郭兴峰，赵文婷，廖小军，胡小松，王 晓，吴继红,*
（1.聊城大学农学院，山东 聊城 252000；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，国家果蔬加工工程技术研究中心，北京 100083；3.山东省分析测试中心，山东 济南 250014）
随着人们生活节奏的持续加快和食品工业化水平的不断提高，包装类食品已经成为人们生活中不可缺少的食品种类，在包装类食品的加工过程中热处理是必不可少的加工工序。传统的食品加工过程中，热处理过程的作用通常包括：食品加工工艺和产品自身特性的需要，如真空浓缩、热风干燥等；食品包装过程中进行的杀菌工艺，如巴氏杀菌、超高温杀菌等；保持食品的感官特性的需要，如进行食品灭酶处理等。即使在现在新兴的非热加工过程中，食品原料往往也需要进行水浴或蒸汽加热，以达到食品灭酶的目的，保持食品在贮藏过程中感官品质[1-4]。加热工艺除了以上正面作用外，在食品加工中还不可避免会对食品的颜色、质构和营养等造成负面的影响[5-7]。张甫生等[5]研究超高压和加热对黄桃罐头质地、黏度和细胞结构等的影响时发现加热处理会使黄桃罐头的果肉质地软化、显微结构破坏及可溶性固形物增加，严重影响产品品质。Zhao Liang等[6]研究超高压和巴斯杀菌对黄瓜汁的品质影响时发现，经过巴斯杀菌的黄瓜果汁的品质显着比超高压处理果汁的品质要差。Ans等[7]研究不同温度条件下超高压处理胡萝卜对其质构的影响，结果表明加热处理使胡萝卜的质构严重软化，且在不同的溶液环境中胡萝卜的软化规律不尽相同，在有Ca2+存在的情况下胡萝卜的质构变化相比于水溶液中减缓。
果胶作为一类广泛存在于植物细胞内的寡糖和多聚糖的混合物，由于具有增稠、稳定、乳化等作用而作为天然、绿色的食品添加剂广泛应用于各类果酱、果冻、饮料和软糖等食品的加工过程中。食品加工时，不同加工条件包括加热温度、pH值、酶、微波等均会对果胶结构和性质产生重要的影响，甚至引起果胶分子链的降解[8-10]。Fishman等[8]研究了加压条件下微波辅助提取对柑橘囊衣果胶理化性质的影响，结果表明随着超声处理时间的延长会引起果胶的平均分子质量、回旋半径、固有黏度等理化指标改变。Fraeye等[9]研究表明80～110 ℃不同pH值条件下果胶会发生不同程度的水解反应和β-消除反应，从而引起果胶分子的降解。Chen Jun等[10]研究动态高压微射流技术后果胶的表观黏度、平均分子质量、果胶的粒径分布等理化指标均明显下降，同时电镜观察表明果胶由完整的片状结构转变为多孔的碎片结构。富含果胶的酸性饮料大都pH值在4.3以下，探索酸性条件下食品热加工过程对果胶流变和结构特性的影响及规律对探究在酸性条件下热处理对产品的理化和感官特性的影响及规律十分重要。
本实验通过高静压技术以柚皮为原料制备高分子质量果胶，并对酸性条件下高分子质量果胶溶液进行加热处理，研究该条件下热处理对果胶表观黏度和流变特性的影响，并通过测定半乳糖醛酸含量、酯化度和分子质量分布等果胶理化指标，结合原子力显微镜扫描果胶分子结构状态的变化，揭示酸性条件下热处理对果胶流变和结构特性的影响规律及机制，为富含果胶的酸性食品在热加工过程中的品质变化提供理论依据和指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜、无病虫害、成熟的琯溪蜜柚（Citrus grandis Osbeck），购于北京市海淀区明光寺农副产品综合批发市场。将蜜柚经剥皮去除果肉后得到柚皮并用清水洗净，然后柚皮切丁（2 cm×2 cm），于100 ℃蒸汽灭酶2 min后，放入-18 ℃冰箱中预冷，用冷冻真空干燥（隔板温度18 ℃）至含水量为7%左右，粉碎过60 目筛，真空包装后4 ℃冷藏备用。
盐酸、四硼酸钠、浓硫酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；95%乙醇、无水乙醇（均为分析纯） 北京化学试剂公司；半乳糖醛酸、间苯基苯酚（均为分析纯） Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司。
1.2 仪器与设备
HHP-700-7型高静压设备 包头科发高压科技有限责任公司；AY120型万分之一分析天平 日本岛津公司；EY-300A型分析天平 日本松下电器公司；HH-601型超级恒温水浴锅 金坛市荣华仪器制造有限公司；MF-400型单室真空封口机 广州鸿亿机电设备制造有限公司；CR21GIII型高速冷冻离心机 日本日立公司；LGJ-25C型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；HY-04A型小型高速粉碎机 北京环亚天元有限公司；FMP-3D-BIO型原子力显微镜 美国Asylum Research仪器公司；AR550旋转流变分析仪 美国TA仪器公司。
1.3 方法
1.3.1 高分子质量果胶的制备
参考Guo Xingfeng等[11]的方法，将10 g柚皮干粉装于1 000 mL的聚乙烯塑料袋中，加入预热至85 ℃的pH值为1.5的提取液500 mL，用单室真空封口机进行封口，保温5 min后立刻放入预热好的聚四氟乙烯保温桶中进行超高压处理。超高压处理参数分别设定为：提取压力500 MPa，保压时间10 min，压力波动范围±10 MPa，泄压时间2 s。卸压后立即离心（10 000 r/min，10 min，18 ℃）得到上清液，转移至烧杯中冷却后，加入2 倍体积95%乙醇溶液沉淀过夜以使果胶充分析出[12]，用400 目滤布过滤分离出果胶沉淀，用力将果胶中吸附的水分挤压干净，并用30 mL乙醇清洗2 次，每次5 min以除去色素和游离的中性糖[13]，最后用冷冻真空干燥机对所得果胶进行干燥24 h，得到干燥的果胶样品，放入干燥皿中保存备用。
1.3.2 果胶的热处理
称取9.0 g果胶置于2 275 mL pH 3.7的盐酸溶液中，用保鲜膜封口后置于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解，得到质量分数为0.4%的果胶溶液。将溶解好的果胶溶液装入容积为400 mL的聚乙烯塑料袋中，每袋装入的果胶溶液体积为150 mL，用真空封口机密封后，放入温度为85 ℃的恒温水浴中保温，保温时间分别为20、40、60、80、100 min，取出后立即放入冰水中冷却并转移至烧杯中，分别加入2 倍体积95%乙醇溶液沉淀过夜以使果胶充分析出，用400 目滤布过滤，并用30 mL乙醇清洗2 次，以除去色素和游离的中性糖，最后用冷冻真空干燥对所得果胶进行干燥24 h，得到干燥的果胶样品，放入干燥皿中保存备用。
1.3.3 表观黏度测定
参考Guo Xingfeng等[14]的方法使用旋转流变分析仪进行，实验选用的夹具为锥头式同心圆筒（定子半径15.00 mm、转子半径14.00 mm、浸没高度42.00 mm、间隙5 920 µm），选择的测定程序为稳态剪切峰值保持模式，温度为25 ℃，剪切速率为10 s-1，测定时间为1 min，采样间隔时间为10 s。测定时使样品刚刚没过转子，采用恒温循环水系统进行温度控制。
1.3.4 果胶流变特性测定
参考Guo Xingfeng等[11]的方法使用旋转流变分析仪进行，实验选用夹具为锥头式同心圆筒（定子半径15.00 mm、转子半径14.00 mm、浸没高度42.00 mm、间隙5 920 µm），选择的测定程序为稳态剪切模式，温度为25 ℃，剪切速率为0.01～100 s-1，变量扫描为对数模式，采样周期10 s，容差百分比为5.0%。测定时使样品刚刚没过转子，采用恒温循环水系统进行温度控制。
应用幂律模型对果胶热处理前后果胶的表观黏度随着剪切速率的变化进行拟合，幂律方程如式（1）所示：
式中：τ为剪切应力/Pa；k为稠度系数/（Pa·sn）；γ为剪切速率/s-1；n为流变特性指数；其中，n等于1时为牛顿流体行为，n小于1时为假塑性流体（剪切变稀），n大于1时为胀塑性流体（剪切稠化）。
1.3.5 半乳糖醛酸含量的测定
参考Blumenkrantz等[15]描述的方法，并略有改变。
1.3.5.1 标准曲线绘制
取20 mL具塞试管6 支放入冰水浴中，分别量取质量浓度为20、40、60、80、100 μg/mL半乳糖醛酸标准溶液1 mL，再加入6 mL 12.5 mmol/L的浓硫酸-四硼酸钠溶液，充分振荡置于沸水浴中加热5 min，并再次放入冰水浴中冷却。冷却后分别向各试管中加入0.1 mL的0.15%间苯基苯酚溶液并轻轻振荡，放置15 min后用分光光度计测定波长520 nm处其吸光度，绘制标准曲线回归后得到标准曲线方程：y=77.45x+1.786，R2=0.999。
1.3.5.2 样品中半乳糖醛酸含量测定
精确称取果胶样品0.1 g，溶于100 mL去离子水中，待完全溶解后再用去离子水稀释至80 μg/mL，然后取果胶溶液1 mL，加入6 mL 0.012 5 mol/L的浓硫酸-四硼酸钠溶液，立即放入冰水浴中。振荡混合均匀后于沸水浴中5 min，并再次放入冰水浴中冷却至室温后加入0.1 mL的0.15%间苯基苯酚溶液振荡，放置15 min后用分光光度计测定其在波长520 nm处吸光度，空白加入的反应试剂为0.5%氢氧化钠溶液代替果胶溶液。按公式（2）计算果胶中半乳糖醛酸百分比。
式中：a为从标准曲线中查得的半乳糖醛酸质量浓度/（μg/mL）；80为样品质量浓度/（μg/mL）。
1.3.6 果胶酯化度测定
参考QB 2484—2000《食品添加剂 果胶》的方法，并略有改变。量取20 mL质量分数为0.5%的果胶溶液并加入80 mL去CO2水，用0.05 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至pH 8.1，记录所消耗氢氧化钠的体积（V1）即为原始滴定度。继续加入20 mL、0.5 mol/L的氢氧化钠溶液，加塞后强烈振摇15 min，加入能够完全中和20 mL氢氧化钠溶液的盐酸溶液（20.50 mL），振摇至粉红色消失为止。用0.05 mol/L氢氧化钠溶液再次滴定至pH 8.1，记录所消耗氢氧化钠的体积（V2），即为皂化滴定度。
果胶酯化度按公式（3）计算：
1.3.7 果胶分子质量分布的测定
参考Fishman等[16]的方法采用体积排阻色谱法测定果胶分子质量。将0.2%果胶溶液和标准品经过0.45 µm的微孔滤膜后进行色谱分析。以分子质量5.9、11.8、22.8、47.3、112、212、404、788 kDa的葡聚糖标准品制作标准曲线。
检测条件为：德国Knauer高效液相系统，K-1001泵，RI-2301示差检测器，20 µL进样环，流动相为0.05 mol/L NaNO3，流速0.5 mL/min，柱温35 ℃，Shodex OHpak SB-804 HQ色谱柱（8.0 mm×300 mm），保护柱为Shodex OHpak SB-G，检测器为示差检测器，进样量20 µL。根据不同葡聚糖标品在体积排阻色谱图上保留时间与其对应分子质量的对数（lgmp）作图，并回归得到葡聚糖标品分子质量和峰位保留时间的线性方程：y=-0.291x+9.195，R2=0.992。
1.3.8 果胶微观形态分析
参考Zhang Lifeng等[17]采用原子力显微镜进行测定，将20 μL质量浓度为10 μg/mL的果胶溶液滴于新鲜平整的云母片表面，放置2 min，用适量双蒸水将未吸附的果胶分子冲走，然后用氮气吹扫，将云母片表面的水分迅速吹干，使云母片快速干透，然后将载有果胶分子的云母片置于原子力显微镜的检测槽中进行检测。原子力显微镜的扫描模式为非接触轻敲模式，所使用探针为硅探针：PPP-NCHR Silicon SPM Sensor，共振频率为330 kHz，力常数为42 N，分辨率为512×512，扫描尺寸为2 μm×2 μm，扫描速度为1 Hz。扫描图像应用原子力显微镜的离线数据处理软件进行分析。
1.4 数据分析
所有实验均进行3 次重复，数据处理采用SPSS 16.0和OriginPro 8.0软件。不同处理间的数据采用多重比较方法，显着水平为0.05，并用标记字母法进行标记，流变特性由仪器自带的分析软件（Rheology Advantage Data Analysis）进行数据处理并应用Origin 8.0数据分析软件进行曲线拟合。
2 结果与分析
2.1 热处理对果胶表观黏度的影响
图1 pH 3.7时加热对果胶表观黏度的影响Fig.1 Effect of heating at pH 3.7 on the apparent viscosity of pectin
如图1所示，果胶的表观黏度随着热处理时间的延长而发生显着性降低。当85 ℃热处理40 min后果胶溶液的表观黏度即可减小1 倍左右，原因可能是果胶分子发生了降解或果胶分子立体结构发生了改变。果胶作为高酸性果蔬汁、果蔬饮料、酸奶等休闲食品中常用的增稠剂、稳定剂或乳化剂，能够对产品的品质保持起到重要作用，表观黏度的下降将降低果胶的稳定效果[18]。Buggenhout等[19]比较了加热和超高压处理对番茄酱流动特性的影响，发现40 ℃加热15 min会显着增大番茄酱的流动性，显着降低番茄酱的表观黏度。
2.2 热处理对果胶流变特性的影响
流变特性与食品的化学成分、分子构造、分子内及分子间结合的状态、组织构造之间有很强的相关性[20-22]。如图2所示，没有经过加热处理的果胶溶液表现出最为明显的非牛顿流体特性，随着剪切速率的增大表观黏度显着减小。而随着热处理时间的延长，果胶溶液在各剪切速率条件下的表观黏度均表现出降低趋势，在热处理时间为100 min时果胶的剪切变稀现象最为明显。如表1所示，所有结果均具有较好的拟合度，而且随着热处理时间的延长果胶的流变特性指数显着增大，而稠度系数则显着减小，说明随着热处理时间的延长果胶在特定剪切速率条件下的黏度越来越小，而其剪切变稀的程度越来越不明显。
图2 pH 3.7时加热对果胶流变特性的影响Fig.2 Effect of heating at pH 3.7 on the rheological behavior of pectin
表1 pH 3.7时加热对流变特性的影响Table1 Effect of heating at pH 3.7 on the rheological behavior of pectin
2.3 热处理对果胶半乳糖醛酸含量的影响
图3 pH 3.7时水浴加热对果胶半乳糖醛酸百分比的影响Fig.3 Effect of heating at pH 3.7 on the galacturonic acid content of pectin
如图3所示，85 ℃条件下对果胶溶液热处理0～100 min均没有对果胶的半乳糖醛酸的含量产生显着性的影响。该结果说明在热处理的过程中没有发生中性糖组分和半乳糖醛酸分子的丢失。
2.4 热处理对果胶酯化度的影响
果胶酯化度是果胶中以酰胺化或甲酯化状态存在的羧基数目占全部羧基（游离状态、成盐状态、甲酯化状态、酰胺化状态）总数目的百分比[23-24]。通过研究果胶酯化度的差别可以看出果胶中半乳糖醛酸羧基的酰胺化或甲酯化程度的不同。由图4所示，在该条件下果胶溶液热处理后所得果胶的酯化度均在79.28%～82.37%之间，且没有显着性区别。
图4 pH 3.7时水浴加热对果胶酯化度的影响Fig.4 Effect of heating at pH 3.7 on the DE of pectin
2.5 热处理对果胶分子质量分布的影响
果胶分子质量分布为评价果胶理化性质和分子结构的重要指标[25]。如图5所示，根据高效凝胶色谱测定分子质量的原理，保留时间越小说明分子质量越大，反之亦然。可以看出在pH 3.7、85 ℃水浴条件下加热不同时间后，果胶分子质量分布曲线基本重合，没有显着性的差别。此结果说明在pH 3.7条件下果胶的分子链没有发生显着的降解反应。
图5 pH 3.7时加热对果胶分子质量分布的影响Fig.5 Effect of heating at pH 3.7 on the molecular mass distribution of pectin
2.6 热处理对果胶微观结构的影响
原子力显微镜作为一种通过检测待测样品表面和原子力探针之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质的分析装备，现在被广泛应用于材料科学、生命科学、食品科学、环境科学和医学等领域[26-27]。近年来众多学者也将原子力显微镜应用于研究果胶的分子形态和分子间的聚集状态[28-30]。由图6果胶的原子力显微镜的高度图像和右侧的颜色标尺条可以看出各果胶在扫描面积为2.0 μm×2.0 μm的范围内分子链的长短形态和高度，由图6a可以看出，果胶多呈现分散和舒展的状态，由图6b～f可以看出，同样浓度的果胶在pH 3.7条件下分别经过20、40、60、80、100 min热处理后与图6a相比，果胶的分子聚集状态更加明显，果胶形态表现出更多形态稍大的聚集体。
图6 pH 3.7时加热对果胶微观结构的影响Fig.6 Effect of heating at pH 3.7 on the microstructure of pectin
3 结 论
通过系统研究酸性条件下热处理对果胶的表观黏度、流变特性、半乳糖醛酸含量、酯化度、分子质量分布和微观形态结构的影响，深入探讨热处理对果胶流变和结构特性的影响，提出酸性条件下热处理导致果胶黏度减小和流变特性改变的机制，得出以下结论：在pH 3.7条件下，果胶溶液在85 ℃热处理0～100 min会导致果胶表观黏度和稠度系数降低，同时引起果胶流变特性指数的增大，致使果胶的增稠效果减弱。但果胶的半乳糖醛酸含量、酯化度和分子质量分布均没有显着性变化。通过对果胶微观结构的研究发现，果胶的分子链内和分子链之间会发生聚集现象，引起果胶空间立体结构的减小，进而导致果胶表观黏度的减小。该研究结果为富含果胶的酸性食品在热加工过程中的品质变化提供了理论依据和指导。
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