闵瑶瑶，周梦舟，柳志杰，冯年捷*，吴 茜,*
（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068；2.湖北工业大学材料与化学工程学院，湖北 武汉 430068）
非酶糖化反应，又称Maillard反应[1]，该反应使蛋白质发生交联而失去活性，生成不可逆的非酶糖化末端产物（advanced glycation end products，AGEs）。AGEs在体内大量积累可导致糖尿病[2]、肾病（尿毒症）[3]、动脉粥样硬化[4]、衰老和阿茨海默尔[5]等疾病的发生。研究表明[6]，大部分过渡金属离子（Fe3+、Fe2+、Cu2+、Zn2+）都能有效地促进非酶糖化反应的进行，而Cu2+和Zn2+只在低质量浓度（1～5 mg/L）下有促进作用，当其质量浓度达到5～25 mg/L时，反而对非酶糖化反应有一定的抑制作用，此外部分非过渡金属如Ca2+和Mg2+则会对反应有一定的抑制作用[7]。黄酮类化合物是一类重要的天然产物，其母核为2-苯基色原酮，具有清除自由基、抗癌以及防治心血管疾病等功效[8-9]。研究表明，芦丁、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）等黄酮类化合物对于生理条件下非酶糖化反应有较强的抑制作用[10-11]。
从莲科植物莲的成熟花托即莲房中提取的莲原花青素（oligomeric procyanidins of lotus seedpod，LSOPC），用乙醇提取并用乙酸乙酯萃取的LSOPC的主要成分为儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素及其二、三、四聚体，其单体以儿茶素为主[12]。无论在体内外，LSOPC均有很好的抗氧化、螯合金属离子及消除自由基的功能[13-14]，并有研究显示原花青素能在体外清除Maillard反应的中间产物——活性羰基[15-16]。故LSOPC可能是一种较好的体内外AGEs抑制剂，本实验从模拟生理环境验证LSOPC对AGEs的抑制效果，并寻找更有效的AGEs复配抑制剂，以此为体内的AGEs生成抑制及相关慢性疾病的外源膳食补充剂或新药的研发提供一定的理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
莲房采自洪湖蓝田种植区，品种名称为“武植2号”，夏季6—8月份采收。将莲房去籽，采用本实验室已经建立的提取工艺（中华人民共和国专利（ZL02 1 15423. 6））进行提取，得到浅棕色粉末莲房原花青素粗提物，后用乙酸乙酯萃取3 次，冷冻干燥制得LSOPC。LSOPC经盐酸正丁醇法[17]检测，其原花青素含量相对于葡萄籽原花青素标品为（106.22±0.46）%；通过液相色谱-质谱联用分析，LSOPC的聚合度为3.2，在末端单元中儿茶素和表儿茶素分别占74.2%的和25.8%；而26.0%的儿茶素、43.1%的表儿茶素、30.9%的表没食子儿茶素分别处在扩展单元。
葡萄籽原花青素标品（分析纯） 上海源叶生物科技有限公司；牛血清白蛋白、葡萄糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（均为分析纯） 中国医药集团总公司；叠氮钠（分析纯） 天津市福晨化学试剂厂；氨基胍盐酸盐、表没食子儿茶素没食子酸酯（均为分析纯） 美国Sigma-Aldrich公司；标准金属离子（分析纯） 国家钢铁材料测试中心；AB-8大孔树脂 天津南开合成科学技术公司。
1.2 仪器与设备
RE-111旋转蒸发仪 瑞士Büchi公司；Analytic AC 210 S分析天平 德国Sartorius公司；电热恒温水浴锅北京长安科学仪器厂；真空冷冻干燥机 德国Christ公司；KQ-50B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；UV-2100型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；FE20型pH计 瑞士Mettler-Toledo公司；WH-3型微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 AGEs体外孵育时间的确定
采用Brownlee的方法[18]，进行适当修改。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、葡萄糖（glucose，Glu）、叠氮钠（sodium azide，NaN3）（防腐剂）和LSOPC分别用pH值为7.4的0.2 mol/L磷酸缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）溶解，加入30 mL的具塞玻璃管中，使其最终含量为BSA 5 mg/mL、Glu 36 mg/mL、NaN33 mmol/L、LSOPC 0.2 mg/mL。实验分3组：1）对照组：BSA+Glu+NaN3；2）BSA组：BSA+NaN3；3）LSOPC组：BSA+Glu+LSOPC+NaN3，每组3 个平行，体系最终体积为30 mL（PBS补齐）。并于37 ℃的隔水式培养箱中密封避光孵育，后于3、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70 d取1 mL反应液进行检测。
取获得的1 mL反应液，避光冷却至室温，用pH值为7.4的PBS稀释到4 mL，再用荧光分光光度计检测其荧光值（λEX=370 nm，λEM=440 nm，入射和出射狭缝宽度皆为5 nm）。其荧光值都按稀释倍数换算到原始浓度的荧光值，抑制率按式（1）[19]计算：
式中：IR为抑制率/%；F对照为对照组荧光值；FLSOPC为LSOPC组荧光值；FBSA为BSA组荧光值。
1.3.2 金属离子对LSOPC在体外抑制AGEs生成的影响
用pH 6.5（为增加金属离子溶解度）的0.2 mol/L PBS配制所需的反应溶液：BSA 5 mg/mL；Glu 36 mg/mL；NaN33 mmol/L；LSOPC（最终质量浓度为0.5 mg/mL）；金属离子（Cu2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Sn2+，最终质量浓度为50、10、1、0.1 mg/L）。
按以下各组要求，取所需的反应液分别加入到5 mL的离心管中。实验分5组：1）对照组：BSA+Glu+NaN3；2）BSA组：BSA+NaN3；3）LSOPC组：BSA+Glu+LSOPC+NaN3；4）金属离子组：BSA+Glu+金属离子+NaN3；5）金属离子+LSOPC组：BSA+Glu+金属离子+LSOPC+NaN3，每组3 个平行，体系最终体积为1 mL（PBS补齐），后于37 ℃的隔水式培养箱中密封避光孵育35 d。孵育后的反应液按1.3.1节方法进行荧光检并计算抑制率。
1.3.3 高糖和高蛋白条件下LSOPC对体外AGEs生成的抑制
用pH 7.4的0.2 mol/L的PBS配制所需的溶液，实验分4 组：1）高糖高蛋白组：BSA质量浓度100 mg/mL；Glu质量浓度576 mg/mL；2）高糖组：BSA质量浓度10 mg/mL；Glu质量浓度576 mg/mL；3）高蛋白组：BSA质量浓度100 mg/mL；Glu质量浓度144 mg/mL；4）正常组：BSA质量浓度10 mg/mL；Glu质量浓度144 mg/mL。阳性对照质量浓度为1 mg/mL，NaN3（防腐剂）浓度3 mmol/L。每组3 个平行，体系最终体积为1 mL（PBS补齐）。后于37 ℃的隔水式培养箱中密封避光孵育35 d。孵育后的反应液按1.3.1节方法进行荧光检测并计算抑制率。
1.3.4 LSOPC与EGCG复配物对体外AGEs生成的抑制
1.3.4.1 LSOPC和EGCG对体外AGEs生成的抑制
按1.3.1节的方法将LSOPC和EGCG单独进行体外抑制AGEs生成的实验，并计算IC50值。
1.3.4.2 固定比例法评价LSOPC与EGCG的相互作用
在已知单个抗氧化剂IC50值和和两个抗氧化剂IC50值比值的基础上，将LSOPC和EGCG按几组固定比例混合进行复配实验。以两种抗氧化剂IC50的比值作为参考，选择的固定比例应包括两种抗氧化剂效强含量相当及两种抗氧化剂分别占主导地位的情况，即至少包含3 组固定比例[20]。从前面的LSOPC和EGCG体外抑制AGEs生成的实验中可以得到，LSOPC与EGCG的IC50值比为1∶1.5。本实验选择3 组固定比例（质量浓度比），LSOPC与EGCG的固定比例定为6∶3、2∶3、2∶9，每组固定比例中的质量浓度对AGEs的抑制率选择应在10%～100%范围内均匀分布为宜。按固定比例混合后，以同样的方法测定复合抗氧化剂对AGEs的抑制作用，计算清除率及复合组的IC50值。
1.4 统计学分析
利用等高线分析法研究LSOPC与EGCG之间的相互作用，为确定两种抗氧化剂之间的作用类型（协同、拮抗、相加），需计算复合组的理论IC50,add值，公式如下：
式中：R为A、B两种抗氧化剂单独应用时的效价比，即R=IC50,A/IC50,B；P1为抗氧化剂A在复合组中所占的比例；P2为抗氧化剂B在复合组中所占的比例。相互作用指数（γ）值常用来评价协同或拮抗作用的程度，公式如下：
式中：γ为相互作用指数；IC50,Amix、IC50,Bmix为分别为复合组中A、B两种抗氧化剂的IC50值；IC50,A、IC50,B分别为A、B两种抗氧化剂单独应用时的IC50值。若γ值为1，表示相互作用为相加；若γ值小于1，表示相互作用为协同作用。γ值越小说明协同作用越强；若γ值大于1，表示相互作用为拮抗作用[21]。
2 结果与分析
2.1 AGEs体外孵育时间的确定
图1 不同时间条件下LSOPC对AGEs生成的抑制Fig.1 Inhibitory effects of LSOPC on AGEs formation at different incubation times
如图1所示，对照组和L S O P C组的荧光值均随着时间延长而增加，对照组的增加速度明显快于L S O P C组，说明L S O P C对体外A G E s的生成能起到较好的抑制效果（B S A组的荧光值为（58.259±4.351）～（426.300±10.981），图中未显示）。由图1可以看出，3～42 d，LSOPC对AGEs生成的抑制率不断增加，28 d后趋于平稳，42 d后，由于LSOPC组荧光值急剧上升，其抑制率有一定程度的下降，故选35 d为最终的孵育时间。
2.2 不同质量浓度金属离子对LSOPC在体外抑制AGEs生成的影响
图2 不同质量浓度的金属离子对AGEs生成的影响Fig.2 Effects of metal ions on AGEs formation
如图2A所示，1～50 mg/L的Cu2+对AGEs的生成有较大的促进作用，0.1 mg/L的则无显着性的影响。在1～50 mg/L中，其促进效果不随质量浓度的增加而增加，在10 mg/L处出现最大值（-363.36±33.36）%。在Cu2++LSOPC组中，显示Cu2+增加了LSOPC对AGEs的抑制率，其抑制率值随着Cu2+质量浓度的增加而增加，从0～50 mg/L其抑制率分别为（79.82±2.47）%、（8 1.0 9±1.3 5）%、（9 6.6 0±0.0 3）%、（110.22±0.61）%、（116.67±0.31）%。说明Cu2+和LSOPC在抑制体外AGEs生成上存在一定的协同作用。
如图2B所示，1～50 mg/L的Fe2+对AGEs的生成也有较大的促进作用，同样0.1 mg/L的无显着性影响。在1～50 mg/L中，其促进效果随质量浓度的增加而增加，从1～50 mg/L其抑制率分别为（-34.93±6.82）%、（-134.22±8.38）%、（-164.16±20.19）%。在Fe2++LSOPC 组中，也显示Fe2+增加了LSOPC对AGEs的抑制率，其抑制率值随着Fe2+质量浓度的增加而增加，从0～50 mg/L其抑制率分别为（79.83±2.48）%、（8 0.3 0±0.5 1）%、（8 6.5 7±0.6 0）%、（112.02±0.43）%、（114.75±1.68）%。说明Fe2+和LSOPC在抑制体外AGEs生成上也存在一定的协同作用。
如图2C所示，0.1 mg/L的Zn2+对AGEs的生成有一定的促进作用，其抑制率为（-16.82±1.47）%，50 mg/L的Zn2+对AGEs的生成有一定的抑制作用，其抑制率为（28.06±5.02）%，而其余2 个质量浓度则无显着性的影响。在Zn2++LSOPC组中，显示不同质量浓度的Zn2+对LSOPC抑制AGEs生成作用上均无显着性影响。
如图2D所示，1 mg/L的Mg2+对AGEs的生成有一定的促进作用，其抑制率为（12.11±4.27）%，10 mg/L和50 mg/L的Mg2+对AGEs的生成有一定的抑制作用，其抑制率分别为（-18.25±5.84）%和（-18.04±2.23）%，而0.1 mg/L的则无显着性的影响。在Mg2++LSOPC组中，显示0.1 mg/L Mg2+对LSOPC抑制AGEs生成作用上有略微的拮抗作用，其余质量浓度则无显着性影响。
如图2E所示，0.1～10 mg/L的Ca2+对AGEs的生成有一定的促进作用，50 mg/L的则无显着性的影响。在0.1～10 mg/L中，其促进效果随质量浓度的增加而降低，从0.1～10 mg/L其抑制率分别为（-27.08±6.29）%、（-22.71±2.06）%、（-19.63±6.15）%。在Ca2++LSOPC组中，显示0.1 mg/L和1 mg/L的Ca2+对LSOPC抑制体外AGEs生成上存在一定的协同作用，而10 mg/L和50 mg/L的无显着性影响，从0～50 mg/L其抑制率分别为（79.83±2.48）%、（86.70±0.80）%、（8 6.6 2±0.4 6）%、（8 0.3 2±0.4 6）%、（79.01±0.61）%。
如图2F所示，0.1～10 mg/L的Al3+对AGEs的生成均有较大的抑制作用，并随质量浓度的增大而增大，其抑制率分别为（29.74±6.11）%、（47.96±5.00）%、（72.56±2.35）%。且不同质量浓度的Al3+对LSOPC抑制AGEs生成作用上均无显着性影响。
如图2G所示，0.1～10 mg/L的Sn2+对AGEs的生成均有较大的抑制作用，并随质量浓度的增大而增大，其抑制率分别为（34.29±8.42）%、（64.72±2.47）%、（81.77±10.28）%。且对LSOPC抑制AGEs生成作用上均无显着性影响。
综上结果显示，不同质量浓度的不同金属离子对体外AGEs生成的影响各不相同，其中Cu2+和Fe2+对模拟体系中催化AGEs生成作用最强，并且和LSOPC一起有协同抑制作用；其他5 种金属离子对AGEs生成都有不同程度的抑制或促进作用，但对LSOPC几乎无影响。由于在生理环境下游离金属离子的质量浓度较为稳定且较低，故金属离子对于体内AGEs生成的抑制作用有待进一步深入研究。
2.3 高糖高蛋白条件下LSOPC对体外AGEs生成的抑制
图3 高糖和高蛋白质量浓度下LSOPC对体外AGEs生成的抑制Fig.3 Effects of LSOPC on AGEs formation at high concentrations of sugar or BSA
如图3所示，在高糖高蛋白情况下，LSOPC对AGEs抑制的IC50为（0.383±0.055）mg/mL；在高糖情况下，IC50为（0.131±0.060）mg/mL；在高蛋白情况下，IC50为（0.390±0.035）mg/mL；在正常情况下，IC50为（0.115±0.052）mg/mL。由此可见，LSOPC在正常情况下对AGEs的抑制效果最好；在高糖情况下次之；在高蛋白和高糖高蛋白情况下抑制效果最差。这是因为在高糖高蛋白以及高蛋白质质量浓度生成的AGEs的量大约为高糖质量浓度条件下生成的AGEs的量的3 倍。这与王雅娟等[22]研究结果一致，其对影响AGEs生成因素进行正交试验，结果显示：BSA质量浓度＞孵育时间＞Glu质量浓度。因此，大量的AGEs的生成导致LSOPC抑制效果变差。
2.4 固定比例法评价LSOPC与EGCG对体外抑制AGEs生成的相互作用
2.4.1 LSOPC和EGCG对体外AGEs生成的抑制
按1.3.1节的方法将LSOPC和EGCG单独进行体外抑制AGEs生成实验，得到LSOPC的IC50为（0.115±0.005）mg/mL；EGCG的IC50为（0.172±0.008）mg/mL。
2.4.2 LSOPC与EGCG复配后对AGEs抑制率的测定
LSOPC和EGCG的固定比例（质量浓度比）选定为2∶1、2∶3、2∶9，每个比例设置5 组合适质量浓度，测定AGEs抑制能力，计算抑制率和IC50值，结果见表1。
表 1 LSOPC与EGCG复配后抑制AGEs的能力Table1 Inhibitory effect on AGEs formation of LSOPC combined with EGCG
2.4.3 统计学分析
按1.4节所述方法计算复配组理论上的IC50,add值和γ值，对理论IC50,add值和实验IC50,mix值在95%置信区间进行t检验，结果见表2 。
表 2 LSOPC与EGCG复配后的统计学分析结果Table2 Antioxidant interactions of LSOPC combined with EGCG
由表2可以看出，各种组合的IC50,mix值均小于IC50,add值，经过t检验证明两者之间有显着性差异，且γ值都小于1，表明LSOPC与EGCG的相互作用是协同作用。γ值越小说明协同作用越强，由此可得LSOPC与EGCG复配组中协同作用的强弱顺序为2∶1＞2∶9＞2∶3。
3 讨 论
研究证实，LSOPC是一种具有强抗氧化活性和多种生物学功能的酚类物质[23]。因其很好的清除自由基和螯合金属离子抗脂质过氧化作性质，可能作为AGEs天然抑制剂。本实验首先选取了在模拟生理环境下，最适反应时间为35 d，此时，LSOPC的抑制效果达到最大值并且最稳定。
当pH值接近中性时，Maillard反应是通过离子机理进行的，易受到各种离子的影响[24]。特别是多价态的过渡金属离子能够与Maillard反应产物形成复杂的化合物，氧化Amadori化合物及其衍生物并催化这些物质之间的进一步相互作用。弱碱性环境下，有利于Maillard反应产物的生成，在该条件会导致AGEs大量生成，在弱酸性环境下，AGEs生成相对减少[25]。先前关于金属离子对AGEs产生的影响研究主要是在较高温度下进行的[6]，而37 ℃ Maillard反应中金属离子的催化作用研究鲜见报道[26]。因此本实验研究37 ℃、pH 6.5条件下，Cu2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Sn2+对葡萄糖-牛血清白蛋白反应体系中，AGEs生成的影响。其中Cu2+和Fe2+有较大的促进作用，这可能是Cu2+和Fe2+的催化作用所致。另一方面值得注意的是，Cu2+和Fe2+与LSOPC一起有协同抑制AGEs生成的作用，这可能是由于Cu2+和Fe2+与LSOPC形成了金属配合物，配合物相较于LSOPC有更强的抗氧化活性；而Al3+和Sn2+则有一定的抑制作用，对LSOPC抑制AGEs的生成无显着性影响；Zn2+在低质量浓度（0.1、1 mg/L）促进作用，高质量浓度（10、50 mg/L）抑制作用。Mg2+则与Zn2+相反，在低质量浓度抑制作用，高质量浓度促进作用。Ca2+对AGEs的生成有较少的促进作用，Zn2+、Mg2+和Ca2+三种金属离子对LSOPC抑制AGEs的生成影响都不大。
由于Maillard反应非常复杂，目前关于金属离子在Maillard反应的各个阶段的作用机理尚不完全清楚。过渡金属离子对糖基化反应的催化作用主要是通过氧化路径[27]，促进Schiff碱形成Amadori产物[28-29]，同时又催化Amadori产物自动氧化[24]，即催化初级Maillard反应。此外，葡萄糖在过渡金属离子（如Cu2+）的作用下氧化形成活性二羰基化合物以及活性氧自由基[6]，进而促进反应。随着加入Maillard反应体系中的金属离子的质量浓度的增大会使反应体系中出现自由金属离子，在一定质量浓度下它的存在可以通过氧化/还原效应促进Maillard反应，也可能因引起副反应进而抑制Maillard反应；同时，Maillard反应体系中金属离子和Maillard反应产物形成复杂的复合物，在反应一定时间后该复合物通过自身或和其他反应产物之间的进一步反应可能使复合物中的金属离子以活性更强的自由金属离子的形式被重新释放出来，进而催化Maillard反应[24]。因而，金属离子对于AGEs生成的影响不仅和反应物类型、反应温度、反应时间以及反应介质等有关，而且和金属离子本身有关。
Baynes等[30]认为氧化应激能促进并加速体内AGEs的形成，而在John等[31]研究氧气对Maillard反应影响的实验中，其结果显示虽然无氧条件能较好地抑制Maillard反应前期中间产物乙二醛和甲基乙二醛的产生，但对后期的反应却并无抑制作用，此外其研究还表示在抗氧化条件下虽能抑制葡萄糖Maillard反应的发生但无法有效地抑制戊糖Maillard反应的发生。还有研究表明[32]，在Maillard反应后期会生成具有抗氧化性和消自由基能力的还原酮化合物。故可以推测抗氧化剂对Maillard反应的前期进程应该有较好的抑制作用。目前，对于AGEs抑制剂体内体外筛选实验仍集中在单一的天然抗氧化剂对于模拟生理环境或食品体系加工中对于AGEs生成的影响。本实验对于LSOPC与EGCG复配得到了比单一LSOPC更好地清除DPPH自由基的作用，提示复配可以提高LSOPC的抗氧化性。因此，本实验选取LSOPC与EGCG复配，发现LSOPC与EGCG在质量浓度比为2∶1、2∶9和2∶3时，都具有协同抑制效果，且2∶1时抑制效果最好。研究结果旨在为开发高效复配型天然AGEs抑制剂提供新思路。
4 结 论
本实验探究了LSOPC对于模拟生理体系中AGEs的抑制情况，不同质量浓度的LSOPC在37 ℃与BSA和葡萄糖避光密封孵育35 d，其IC50为0.039 mg/mL（95%置信区间为0.035～0.043 mg/mL）。不同质量浓度的不同金属离子对体外AGEs生成的影响各不相同，其中Cu2+和Fe2+对模拟体系中催化AGEs生成作用最强，并且和LSOPC一起有协同抑制作用；其他5 种金属离子对AGEs生成都有不同程度的抑制或促进作用，但对LSOPC几乎无影响。在高糖高蛋白反应体系中，发现LSOPC在高糖高蛋白以及高蛋白情况下，抑制效果最差。发现LSOPC与EGCG复配有协同抑制AGEs效果，并且在LSOPC于EGCG质量浓度比为2∶1时最佳。
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