绍兴机械黄酒发酵过程中风味物质变化

陈青柳，刘双平，唐雅凤，韩 笑，周志磊，邹慧君，王宗敏，姬中伟，毛 健,*

（1.江南大学食品学院，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122；2.国家黄酒工程技术研究中心，浙江 绍兴 312000；3.江苏省产业技术研究院食品生物技术研究所（如皋江大食品生物技术研究所有限公司），江苏 南通 226500；4.会稽山绍兴酒股份技术有限公司，浙江 绍兴 312000）

黄酒作为我国的民族特色的传统乙醇饮料，具有悠久的历史，与啤酒、葡萄酒并称为“世界三大古酒”[1]。随着工业进步，机械化黄酒成为黄酒产业重要的一部分，绍兴机械加饭黄酒是以糯米、清水、生麦曲、熟麦曲及酒母为原料，经大罐发酵18～23 d，后经压榨、勾兑、陈化而成。相较于传统发酵，机械黄酒发酵实现人工控制，使用无菌压缩空气通气开耙，通气和循环水联合控制发酵温度，使发酵过程更为稳定，黄酒生产不受季节限制，实现了高产量和均一的产品质量。

黄酒的独特酿造工艺和原料造就了黄酒独特、复杂的香气特征，其主要风味成分包括挥发性风味物质、氨基酸、有机酸、糖类、微量元素等。以往对机械黄酒发酵过程中的动态监测，主要是对发酵过程中基本理化指标[2]、固形物[3]、氨基酸[4-5]、生物胺[6]、挥发性风味物质[7-8]的研究，鲜见对机械黄酒酿造过程中有机酸和单体酚含量的报道，缺乏风味物质动态变化的全面报道。对绍兴机械黄酒大罐发酵过程进行跟踪取样，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）及气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用对样品进行检测，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）探寻不同发酵阶段的样品风味物质差异，深入全面地了解机械黄酒发酵过程中风味物质的动态变化，对优质机械黄酒生产有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄酒发酵液和制酒酒母于2016年12月取自绍兴某黄酒生产企业的机械加饭酒生产车间，取样时间点为第0（投料落罐结束）、24、48、72、120、216、312、432小时；标准样品，乙腈、甲醇（色谱纯） 安谱实验科技股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

e2695 HPLC系统 美国Waters公司；ANPEL p/N 462572液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 上海安谱公司；5 81 0 R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Trace GC-MS联用仪 美国Thermo公司；50/30 µm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

机械加饭黄酒以糯米、清水、生麦曲、熟麦曲及酒母为原料，经大罐发酵18 d；前酵期3 d，投料落罐8～12 h后以无菌压缩空气进行通气开耙，发酵温度控制在33 ℃以下；后酵低温发酵15 d，温度控制在20 ℃以下。乙醇体积分数以外的发酵醪指标均取经10 000 r/min离心10 min的清液进行测定。

1.3.1 基本理化指标的测定

温度：工厂发酵罐内置温度计测定；总酸、pH值、乙醇体积分数和氨基态氮含量的测定：参照GB/T 13662—2008《黄酒》[9]的方法；还原糖含量的测定：采用2,3,5-三硝基水酸比色法[10]。

1.3.2 有机酸含量的测定

采用HPLC法，以外标法测定8 种有机酸，色谱条件参考文献[11]。

预处理：用等体积10%的三氯乙酸溶液和样品混匀于4 ℃条件下静置5 h，经10 000 r/min离心10 min后取上层清液过0.22 μm水系滤器；色谱条件：ANPEL p/N 462572色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.025 mol/L KH2PO4溶液（pH 3.1）；流速0.7 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；运行时间15 min；紫外检测波长210 nm。

1.3.3 游离氨基酸含量的测定

采用HPLC法，以外标法测定18 种游离氨基酸，测定方法参照QB/T 4356—2012《黄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法》[12]。

1.3.4 多酚含量的测定

采用固相萃取-HPLC法，以外标法测定6 种单体多酚含量。预处理：取8 mL酒醪清液过活化过的CNW Poly-Sery HLB SPE小柱（500 mg/6 mL），3 倍酒样体积的超纯水冲洗小柱，弃去废液，4 mL甲醇将多酚类物质洗脱下后，氮吹浓缩至1 mL，过0.22 μm有机滤器后用于测定。色谱条件参照文献[13]。

1.3.5 挥发性风味物质的测定

采用顶空固相微萃取结合GC-MS联用技术，预处理方法参照文献[14]。

GC-MS条件：TG-WAXMS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；程序升温：40 ℃保持2 min，以4 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min；载气为高纯氦气（＞99.999%），不分流，流速0.8 mL/min。电子电离源；发射电流50 μA；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围33～400 u。

定性及定量分析方法：利用NIST 2.0（Agilent Technologies Inc.）数据库对物质定性，对乙酸-2-苯乙酯、γ-壬内酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯、戊酸、癸酸乙酯、壬酸、苯乙醛、丁二酸二乙酯、正己酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸、1-壬醛、己酸、4-乙基愈创木酚、1-辛烯-3-醇、3-甲基丁酸、3-甲基丁醛、十六酸乙酯、苯甲酸乙酯、糠醛、4-乙烯基愈创木酚、异戊酸乙酯、2,4-二叔丁基酚、间乙基苯酚、3-甲硫基丙醇、癸酸、4-乙基苯酚、异戊醇、乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、β-苯乙醇、正戊醇、异丁醇、肉豆蔻酸乙酯、乳酸乙酯以外标定量，其他挥发性风味物质以2-辛醇（220 mg/L，20 μL）为内标进行半定量。

1.4 数据统计

样品设3 个平行，采用Excel 13软件和OriginPro 2016软件进行数据处理、绘图。

2 结果与分析

2.1 机械黄酒酿造过程中基本理化指标的分析

图1 机械黄酒酿造中基本理化指标的变化曲线Fig.1 Change in physicochemical indexes in mechanically produced rice wine

如图1所示，在机械黄酒的发酵中，乙醇体积分数、总酸、氨基态氮质量浓度均呈先急后缓的增长趋势，而pH值、还原糖质量浓度呈先急后缓的降低趋势，变化均在前48 h最为迅速。这是由于在落料初期，发酵醪中营养丰富，生麦曲和熟麦曲作为糖化剂及发酵剂[15-16]，带入的霉菌及糖化酶、液化酶、蛋白酶作用于原料产生了大量还原糖、氨基酸提供了丰富的碳源和氮源，同时在投料落罐8～12 h后开始以无菌压缩空气进行开耙通气增加了体系的均匀度、提高了发酵醪的溶氧量，为酵母等有益微生物的生长代谢提供了良好的条件，因此主酵期间指标变化迅速，前酵结束时（第72小时）乙醇体积分数达到（12.73±0.32）%；而后通过控制冷凝水循环在酒醪打入后酵罐前将酒醪温度降至13 ℃以下，后酵期温度维持在11～13 ℃，还原糖的含量及低温限制的了酵母等微生物及酶的活力，发酵变得缓慢。落料时发酵液理化指标相对偏差较大，随着发酵的进行，样品的相对偏差缩小，这是由于机械黄酒发酵过程中原料配比、通气量、温度均为人工控制，使得不同批次产品发酵状态较为一致，在食醋酿造中微生物群落结构也有类似变化[17]。

2.2 机械黄酒酿造过程中风味物质含量变化分析

黄酒的主要成分是水和乙醇，其次是糖类、蛋白质、氨基酸、有机酸及挥发性香气物质，多种风味成分共同作用下，相互累加、分离以及抑制呈现的复合香气[18-19]。黄酒发酵中，风味物质主要来源于原料和微生物的代谢的作用[20]。

2.2.1 有机酸含量变化分析

图2 机械黄酒酿造中有机酸的变化曲线Fig.2 Change in the contents of organic acids in mechanically produced rice wine

有机酸在黄酒中起呈香和呈味作用，同时可在黄酒酿造的过程中起到抑制杂菌的作用。实验中测定的8 种有机酸，除乙酸外均为非挥发性酸，主要起呈味作用。机械加饭酒酿造过程中，总酸含量呈增长趋势，其中含量最高的有机酸是乳酸，与其他报道[21]中一致。如图2所示，乳酸在发酵过程中占总酸的57.57%～73.17%，从落料结束（第0小时）到第432小时增长了0.55 倍，达到（5 568.67±203.87） mg/L。酒石酸、柠檬酸、苹果酸总体上均呈先急后缓的增长趋势，其中柠檬酸、苹果酸均参与三羧酸代谢循环，一般不会大量积累。乙酸质量浓度在发酵过程中先升后降，在第120小时最高达到（563.23±61.16） mg/L。8 种有机酸中草酸、α-酮戊二酸含量最低，呈先增后降的趋势。丙酮酸作为糖酵解最后一步的产物，是诸多代谢产物的前体，如乙醇、乳酸、双乙酰、α-酮戊二酸、氨基酸等，在黄酒发酵过程中不会大量积累。HPLC测定的8 种有机酸总含量高于滴定法测定的总酸含量说明黄酒发酵液具有较好的缓冲体系。

2.2.2 氨基酸含量变化分析

表1 机械黄酒中的氨基酸质量浓度Table1 Amino acid concentrations in mechanically produced rice wine mg/L

黄酒中的氨基酸具有一定的呈味作用，对黄酒的风味及感官品质的形成具有重要贡献[22]。在机械加饭酒酿造过程中，总氨基酸质量浓度呈增长趋势，从落料结束（0 h）的（1 030.73±139.06） mg/L增长到432 h的（3 587.12±284.50） mg/L，增长了2.48 倍。氨基酸在前酵期间的增长可能主要是由麦曲带入及发酵醪中微生物产生的蛋白酶、肽酶水解原料中的蛋白所产生，而后酵期间氨基酸的增长可能主要是由微生物细胞中的氨基酸溶出造成。如表1所示，发酵过程中平均含量排前五的氨基酸占总含量的55.94%，分别为精氨酸（13.19%）、丙氨酸（12.27%）、色氨酸（11.23%）、脯氨酸（9.82%）、谷氨酸（9.43%），主要是苦味、甜味和鲜味氨基酸。含量最高的5 种氨基酸中除色氨酸外的4 种高含量氨基酸均不是高级醇的前体，且色氨酸降解生成的色醇在机械黄酒中并未检测到。在发酵过程中，精氨酸、色氨酸、谷氨酸3 种氨基酸的质量浓度先增加后下降，其他氨基酸均呈增长趋势。从图3可以发现，发酵醪中主要是苦味和甜味氨基酸，苦味氨基酸总体呈先增后降的趋势，而甜味氨基酸呈先急后缓的增长趋势，两者在发酵结束时分别占总氨基酸的42.39%和37.07%。黄酒中富含非蛋白质氨基酸γ-氨基丁酸具有改善脑功能、增强长期记忆、抗焦虑及提高肝、肾机能等生理活性[23]，绍兴机械黄酒样中γ-氨基丁酸质量浓度发酵结束时达到（202.56±10.11） mg/L，远高于上海机械黄酒γ-氨基丁酸含量（65.9 mg/L）[23]。

图3 机械黄酒酿造中氨基酸的变化曲线Fig.3 Change in amino acid concentrations in mechanically produced rice wine

2.2.3 多酚含量变化分析

多酚化合物是以苯环为母体具有多个羟基的一类酚类的总称，研究表明多酚物质是黄酒的抗氧化性的重要来源，在黄酒中具有调味、保健等作用[24-25]。根据其他学者[26-28]对商品黄酒中多酚的研究，选择6 种在黄酒中普遍存的单体多酚进行测定。如图4所示，在机械加饭酒酿造过程中，6 种单体酚的总质量浓度呈先增长后降低的趋势，在第48小时达到最高（11.85±0.91） mg/L，其中儿茶素占60.59%，后酵结束时（第432小时）总质量浓度为（4.70±0.14） mg/L。儿茶素作为前酵期间所占比例最高的单体酚，在48 h时达到最高（7.18±0.50） mg/L，较落料时（第0小时）增长了4.34 倍，转入后酵后儿茶素含量迅速降低。在前酵期间表儿茶素含量仅次于儿茶素，而在后酵期含量最高，表儿茶素在第216小时（后酵期）达到最高（5.58±0.32）mg/L，占总酚的53.50%。p-香豆酸和阿魏酸在发酵过程中含量先增后降。p-香豆酸可在苯丙酸脱羧酶（EC 4.1.1.102）作用下形成挥发性风味物质4-乙烯苯酚；黄酒中的阿魏酸主要由麦曲带入，经阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）水解游离出来，阿魏酸经酶或热作用可生成4-乙烯基愈创木酚、香兰素、愈创木酚等挥发性风味物质，在120 h时达到最高（0.69±0.06） mg/L。原儿茶素属于安息香酸型，是前酵期间唯一含量呈下降趋势的多酚，有研究显示原儿茶酸可以防止尿素/瓜氨酸向致癌物质氨基甲酸乙酯的转化[29]。丁香酸属于苯甲酸类，在发酵过程中含量所占比例较低但持续增长。黄酒发酵过程中从原料中游离出来的单体酚可经微生物代谢产生的酶催化转化其他风味物质，同时单体酚和聚合酚之间相互转换也影响单体酚含量的变化。与其他对商品黄酒的报道[25,30]相比，此批次黄酒发酵结束时6 种单体酚总含量偏低，主要因发酵后期的儿茶素含量较低。

图4 机械黄酒酿造中多酚物质的变化曲线Fig.4 Changes in polyphenol concentrations in mechanically produced rice wine

2.2.4 挥发性风味物质含量变化分析

用GC-MS联用技术共检测到62 种物质，主要包括27 种酯类、10 种醇类、7 种酸类、5 种醛类、5 种酚类、2 种呋喃、2 种烯类、1 种内酯等。检测到的挥发性风味物质中酯类物质种类最多，而醇类物质含量最高，各类物质总量的变化如图5所示。

图5 机械黄酒酿造中各类挥发性风味物质的含量变化曲线Fig.5 Changes in volatile components in mechanically produced rice wine

整体上，总挥发性风味物质在前48 h快速增长，在后酵期间整体上呈缓慢继续增长后开始下降的趋势，在发酵结束时（第432小时）质量浓度为（490.24±10.5） mg/L。在机械加饭酒酿造中，醇类和酯类物质作为主要的挥发性物质，在发酵过程中平均含量占总挥发性物质含量的74.66%和18.90%，含量上远高于酚类、醛类、酸类物质，决定了发酵过程中总挥发性物质的含量变化趋势。发酵过程中风味物质变化趋势及主要风味物质的相对比例，与其他黄酒报道[8,31]相近。

在机械加饭酒发酵液中共检测出10 种醇类物质：β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、3-甲硫基丙醇、2,3-丁二醇、二异丁基甲醇、正丙醇、正壬醇、1-辛烯-3-醇、D-香茅醇。含量前4的醇类依次为β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、3-甲硫基丙醇，在主酵期间（24 h内）增长最为迅速，而后增长趋势有所不同，β-苯乙醇、异丁醇在继续缓慢增长后呈下降趋势，异戊醇波动幅度较大，是后酵结束时质量浓度最高（155.31±5.99） mg/L的醇类物质，3-甲硫基丙醇在主酵期（24 h）结束后，含量变化幅度较小。β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、3-甲硫基丙醇在发酵过程，形成途径有分解代谢途径（Ehrlich途径）和合成代谢途径（Harris途径），分解代谢途径β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇、3-甲硫基丙醇对应的前体氨基酸分别是苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸。β-苯乙醇、异戊醇、异丁醇作为黄酒中的主要高级醇，对酒样整体香气特征具有明显贡献，香气阈值分别为14、30 、40 mg/L。β-苯乙醇呈玫瑰花香味，异戊醇和异丁醇则呈现出杂醇油香、指甲油等溶剂气味，含量过高会为黄酒带来不愉快的异味[32]。2,3-丁二醇是酒类中少有的呈现多元醇之一，呈奶油和黄油香气[33]，是功能性物质四甲基吡嗪的前体之一，主要在主酵期间（24 h）积累。正丙醇、正壬醇、1-辛烯-3-醇、D-香茅醇均只在酒母或前酵期间酒醪中检测到，说明主要是由原料带入。

在机械加饭酒发酵液中共测得27 种酯类化合物，包括23 种乙酯类和3 种乙酸酯类，发酵过程中平均含量前10的酯类为乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、肉豆蔻酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯。在机械加饭酒发酵中，酯类物质总量在0～120 h时较大幅度持续增长到（139.04±4.46） mg/L，而后缓慢增长，312 h后含量有所降低。酯类物质在发酵过程中主要由有机化学反应和微生物的生物合成这2 种途径生成，而影响生物合成的关键酶主要有酯酶、醇酰基转移酶、醇脱氢酶。酯类增长速度小于醇类物质，但大幅度持续增长时间较醇类物质含量增长时间长。

乳酸乙酯和乙酸乙酯2 种酯在发酵过程中平均含量占总酯含量的88.91%，决定了机械加饭酒发酵过程中总酯的变化趋势。乳酸乙酯是发酵过程中质量浓度最高的酯类，在第120小时达到最高为（77.07±2.65） mg/L，后酵结束时（第432小时）质量浓度降为（52.56±1.61） mg/L；乙酸乙酯在发酵过程中持续增长，在后酵后期有下降趋势，终质量浓度为（54.70±2.08） mg/L。丁二酸二乙酯属于二乙酯化合物，在落料结束时（0 h）未检测到，而后稳定增长，后酵结束时（第432小时）达到（6.10±0.289） mg/L，是机械加饭酒中质量浓度较高的酯类之一，但丁二酸二乙酯在乙醇溶液中的阈值也较高（20 000～1 250 000 μg/L）[33]，对黄酒的香味贡献值较小。丁酸乙酯在第48小时第1次检测到，而后持续增长到发酵结束（第432小时）质量浓度为（3.98±0.17） mg/L。乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、乙酸-2-苯乙酯、肉豆蔻酸乙酯、月桂酸乙酯、十一酸乙酯、己酸乙酯含量变化趋势与乳酸乙酯类似，具有先增后降的变化趋势。这7 种酯类在落料结束时（第0小时）未检测到或质量浓度较低，而后在24～120 h期间达到最高值后开始下降，其中乙酸-2-苯乙酯质量浓度在第120小时达到最高（1 499.95±69.22） µg/L，而后快速下降，后酵末期时未检测到。发酵过程中含量较高的酯类的合成前体物质在发酵醪中含量也较高。

在机械加饭酒发酵过程中检测到5 种酚类物质：4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙基苯酚、2,4-二叔丁基酚、间乙基苯酚，其中4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙基苯酚存在于整个发酵过程中。4-乙烯基愈创木酚是由阿魏酸在高温或阿魏酸脱羧酶（EC 4.1.1.102）的作用下形成，香气阈值为20 μg/L[32]；4-乙烯基愈创木酚是在发酵过程中含量最高的酚类物质，发酵过程中平均含量占酚类物质总含量的76.88%，决定了总酚类物质的变化趋势，4-乙烯基愈创木酚在前酵期间增长最快，由落料结束时（第0小时）的（261.91±4.28） μg/L增长到第72小时的（16 004.6±552.04） μg/L，增长了60.11 倍，进入后酵期后增长速度减缓，后酵末期有下降的趋势。4-乙基愈创木酚在0～24 h快速增长，而后呈波动趋势。4-乙基苯酚在古越龙山黄酒中被描述为药香[34]，是4-香豆酸在阿魏酸脱羧酶（EC 4.1.1.102）作用下生成4-乙烯基苯酚，再经乙烯基苯酚还原酶催化形成[35]。2,4-二叔丁基酚、间乙基苯酚仅在发酵第72、120小时检测到。

在机械加饭酒发酵过程中检测到5 种醛类物质，分别为3-甲基丁醛、苯乙醛、苯甲醛、1-壬醛、对甲基苯甲醛。从图5B可以看出，醛类物质基本在前酵前期检测得到，这可能是由于醛类在发酵过程中作为前体被转化为醇或酸。检测到7 种羧酸类物质，分别为3-甲基丁酸、戊酸、癸酸、壬酸、己酸、辛酸、丁酸。除癸酸外，羧酸类物质在0～24 h增长迅速。

2.3 不同酿造时间的机械黄酒酿造风味物质的PCA

对不同发酵时间的机械黄酒的风味物质含量取均值标准化后进行PCA，如图6A所示，第1主成分贡献率为43.64%，第2主成分贡献率为16.88%，2 个成分的累计贡献率已达到60.52%，能较好地解释数据信息。从图6B可以看出，氨基酸、主要非挥发性有机酸（乳酸N25、柠檬酸N26、酒石酸N27、苹果酸N28）与第1主成分有较大的正相关性，主要挥发性有机酸（戊酸V51、己酸V54、辛酸V55）与第1主成分呈负相关性。第2主成分的解释能力弱于第1主成分，挥发性风味物质正丙醇（V7）、乙酸异丁酯（V16）、乙酸-2-苯乙酯（V18）、癸酸乙酯（V19）、正己酸乙酯（V25）、苯甲酸乙酯（V30）与第2主成分有明显正相关性，丁酸乙酯（V14）与第2主成分有明显负相关性。

从图6A可以看出，原料酒母和第0小时的样品与其他发酵时间的样品距离较远，说明原料酒母和第0小时的样品与其他样品的差异性较大。除第48小时的发酵样品，前酵期间的样品都分布在Y轴左侧，而后酵期间的样品都分布在Y轴右侧，说明第1主成分能较好地区分前酵和后酵期间的物质，非挥发性物质对不同发酵阶段的样品解释能力较大。同一发酵阶段的样品在第2主成分上投影距离大于在第1主成分的投影距离，说明第2主成分对同一发酵阶段的样品有更好的解释能力。

图6 不同酿造时间的机械黄酒及风味物质在第1和第2主成分中的分布Fig.6 Distribution prof i les of wine samples and fl avor components in PC1 versus PC2 plot

3 结 论

机械化黄酒生产可对发酵过程的温度、发酵醪含氧量等进行人工控制，使黄酒可常年生产，不受季节限制，机械化黄酒精确的生产控制提高了黄酒的产量和产品质量的均一性。对绍兴机械黄酒大罐发酵过程进行跟踪取样，采用HPLC及GC-MS对机械黄酒发酵过程中风味物质进行检测，发现有机酸、氨基酸、高级醇在前48 h持续快速增长，挥发性酚类物质在前72 h持续快速增长，酯类物质在前120 h持续快速增长，说明风味物质主要在前酵期产生。机械加饭酒酿造过程中，乳酸是含量最高的有机酸，苦味氨基酸含量最高，前酵期间儿茶素含量最高，后酵期间表儿茶素含量最高，检测到的挥发性风味物质中酯类物质种类最多，而醇类物质含量最高。对不同酿造时间的机械黄酒酿造风味物质进行PCA，提取的2 个成分的累计贡献率达到60.52%，结果显示第1主成分能较好地区分前酵和后酵期间的物质，非挥发性物质对不同发酵阶段的样品解释能力较大。