张凯华，臧明伍*，张哲奇，李 丹，李笑曼，王守伟，陈文华
（中国肉类食品综合研究中心，北京食品科学研究院，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）
随着我国经济的快速发展和居民生活节奏的加快，即食、即烹和即热型预制调理食品越来越受到消费者的青睐，极大节省消费者家庭备餐时间[1]。肉制品是人们摄取蛋白质和脂质的重要来源，预制调理肉制品方便快捷，尤其是调理肉类菜肴，其市场份额正不断扩大。预制调理肉制品大多在食用前需要进行二次加热，同时我国消费者对预制调理肉制品也有热食的习惯。而复热在一定程度上造成产品的风味和品质特性的损失，比如，肉经加热-冷藏-复热后会产生过熟味（warmed-off flavor，WOF）[2]，该不良风味易被消费者感知，影响产品食用品质，不利于预制调理肉制品消费市场的扩大。因此，开展预制调理肉制品复热风味研究有其必要性和现实性。目前，国外学者针对西式肉制品复热风味尤其是WOF形成、影响因素和控制措施开展大量研究[3-9]，国内学者多围绕速冻调理制品复热品质开展研究[10-11]，对于预制调理肉制品复热风味形成、品质保持和WOF控制研究较少，仍有待深入。
气相色谱-质谱联用结合嗅闻（gas chromatographyolfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）将GC分离能力与人的嗅觉相结合，能够较好鉴定产品挥发性风味成分[12]。吹扫/捕集-热脱附（purge and trap thermal desorption，P&T-TD）相较顶空固相微萃取，具有吸附效率高、对痕量物质敏感等优点，能够较真实且完整地反映样品中挥发性成分的组成[13]。气味活度值（odor activity value，OAV）是风味物质浓度与其阈值的比值[14]，多用来评价各化合物对样品总体风味的贡献。
猪耳朵制品作为一种中式传统熟肉制品，含有一定量不饱和脂肪酸，复热食用时易产生令人不愉快的WOF。本研究选取猪耳朵制品为研究对象，以P&T-TD-GC-O-MS为风味检测手段，同时结合OAV和硫代巴比妥酸反应活性物质（thiobarbituric acid reaction substances，TBARS）值分析不同复热处理对猪耳朵制品风味特性及脂肪氧化的影响，探明不同复热方式对猪肉制品WOF关键风味因子和产品品质保持的规律，以期为建立传统猪肉制品复热风味形成及WOF控制机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
真空包装低温猪耳朵制品（4 ℃冷藏） 北京吃乐福食品有限责任公司；2-甲基-3-庚酮、C5～C20正构烷烃美国Sigma公司；正己烷（色谱纯） 美国Fisher公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸二钠、三氯甲烷均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Gerstel TDS半自动热脱附进样器、Tenax TA石英玻璃吸附管、TC-20型Tenax-TA吸附管自动净化仪、ODP2嗅闻检测仪 德国Gerstel公司；P&T样品瓶 自制；GC-MS联用仪、TG-Wax MS极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国赛默飞世尔科技（中国）有限公司；SynergyH4多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
将超市冷藏放置1 d的市售真空包装低温猪耳朵制品于4 ℃条件下冷藏4 d，以促进WOF的生成[15]；随后对猪耳朵制品分别进行不同复热处理：巴氏复热（90 ℃水浴15 min使其中心温度达到70 ℃以上）、水蒸复热（电磁炉沸水蒸20 min）、微波复热（微波炉高火加热2 min）和高温复热（121 ℃，15 min），复热完毕后将样品取出，迅速放入冷水浴中冷却至室温，按顺序依次编号为样品B、样品C、样品D和样品E。冷藏4 d的市售猪耳朵制品为空白对照，编号为样品A。将样品用铝箔袋真空包装，于-18 ℃冷冻。
1.3.2 样品P&T-TD处理
将样品在室温条件下切碎混匀。准确称取10 g装入P&T样品瓶中，旋紧瓶盖，加入1 μL 0.816 μg/μL的2-甲基-3庚酮作为内标物，样品瓶一端通氮气，氮气吹扫流率为50 mL/min，另一端接装有Tenax TA吸附管（经老化后无杂质峰出现），55 ℃恒温条件下吸附40 min，将吸附管取出插入TD系统进样口进样。每个样品平行3 次。
冷阱进样系统条件：采用标准加热模式；液氮冷却，初始温度-100 ℃，平衡1 min，再以10 ℃/min的速率升至230 ℃；分流比30∶1。
TD条件：采用标准加热模式；不分流模式进样；初始温度40 ℃，保持1 min，再以60 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；传输线温度220 ℃。
1.3.3 GC-MS条件
TG-Wax MS极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；升温程序：起始柱温40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；检测器温度260 ℃；载气（He）纯度不小于99.999%，流速1.0 mL/min。电子电离源；电子能量70 eV；接口温度260 ℃；离子源温度280 ℃；溶剂延迟时间2.5 min；检测器电压1.2 kV；质量扫描范围m/z 40～600。
1.3.4 嗅闻检测器
嗅闻检测器接口温度200 ℃。用预处理后的样品及标准香气化合物对评价员反复培训后再进行样品实验，由3 位评价员在嗅觉检测口记录闻到香气的时间来筛选对猪耳朵制品风味有贡献的香气成分，每种风味化合物的香气描述及时间至少由其中2 名评价员一致才确定。检测时为防止评价员鼻腔干燥，适量通入湿润氮气。
1.3.5 脂肪氧化程度（TBARS值）测定[16]
取10 g绞碎的肉样，加50 mL 7.5%的三氯乙酸溶液（含0.1%乙二胺四乙酸二钠），振摇30 min，双层滤纸过滤2 次。取5 mL滤液，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，100 ℃水浴30 min，取出冷却1 h，然后加入5 mL三氯甲烷摇匀静置分层后，取上层有机相分别在532 nm和600 nm波长处测吸光度，记录吸光度A532nm、A600nm，并按公式（1）计算TBARS值。每个样品测定3 次计算平均值。
1.3.6 WOF感官分析
参照文献[4]方法进行实验。选取10 名食品专业技术人员，组成感官评价小组，对小组成员进行WOF相关知识和气味辨别的培训，以保证对WOF特征达成共识。WOF具体评定指标如表1所示。感官评分实行5 分制原则：0 分，闻不出味道；1～4 分，风味逐渐增强，5 分，风味最强（即表中所示浓度）。评价前，将样品在30 ℃条件下恒温放置30 min。评价时，各样品间至少间隔3 min。感官评价结果取平均值绘制风味剖面图。
表1 WOF感官评价标准Table1 Criteria for sensory evaluation of WOF
1.3.7 GC-MS定性定量分析
定性分析：通过NIST和Willey谱库，选取正反匹配比均大于800的化合物；同时借助系列正构烷烃计算挥发性风味化合物的保留指数（retention index，RI），与标准化合物的RI进行比对确定化合物，对挥发性风味物质进行定性鉴定。RI按公式（2）计算：
式中：tR（x）、tR（n）及tR（n+1）分别为待测挥发性成分、含n 个碳原子正构烷烃及n+1 个碳原子正构烷烃的保留时间/min。
定量分析：样品在吹扫捕集前加入1 μL 0.816 μg/μL 2-甲基-3-庚酮作为内标，待测样品中挥发性风味物质的含量根据峰面积比按公式（3）计算：
式中：CX为内标化合物含量/（μg/kg）；CO为内标化合物质量浓度/（μg/μL）；VO为内标化合物进样体积/μL；SX为未知风味化合物的峰面积/（AU·min）；SO为内标化合物峰面积/（AU·min）；m为式样的质量/kg。
1.3.8 OAV计算
按公式（4）计算OAV：
式中：C为风味物质含量/（μg/kg）；T为该风味物质在水中的感觉阈值/（μg/kg）。
1.4 数据分析
利用SPSS 17.0对数据进行显着性分析，利用UnscrambX 10.1进行主成分分析。
2 结果与分析
2.1 不同复热处理猪耳朵制品挥发性风味物质分析
表2 不同复热猪耳朵制品挥发性风味成分GC-O-MS分析结果Table2 GC-O-MS analysis of volatile compounds in cooked pig ear reheated by different methods
续表2
表3 不同复热方式猪耳朵制品挥发性风味成分种类及占比Table3 Volatile compound composition of cooked pig ear reheated by different methods
基于P&T-TDS-GC-O-MS对不同复热处理猪耳朵制品挥发性风味物质进行鉴定，结果如表2、3所示。从表2可以看出，不同处理猪耳朵制品共鉴定出58 种风味物质，主要为烃类26 种、醛类12 种、醇类7 种、酯类2 种、酮类3 种、含氮含硫及杂环化合物1 种、脂肪酸类1 种、醚类2 种、酚类4 种。不同复热处理条件猪耳朵制品挥发性风味物质种类及含量各有不同（表3），与空白对照相比（样品A 52 种、含量为1 010.53 μg/kg），样品B、样品C、样品D和样品E分别鉴定出48、50、45 种和38 种，含量分别为1 806.79、1 158.85、703.26 μg/kg和1 175.03 μg/kg，且组间差异显着（P＜0.05）。不同复热处理样品中醛类、烃类含量较高，其含量超过总含量的50%。
2.1.1 醛类物质变化分析
醛类物质主要来自原料肉中脂肪的氧化和蛋白质的降解[10]。不同复热处理猪耳朵制品醛类物质种类相差不大，分别为11、12、9 种和10 种。不同复热方式对醛类风味物质含量影响显着（P＜0.05），其中，巴氏复热醛类含量最高，为541.02 μg/kg，微波复热含量最低（176.71 μg/kg）且显着低于对照组（302.64 μg/kg）。王瑞花等[17]在研究生猪肉水煮熟制时，发现水煮熟制中醛类物质显着高于微波熟制（P＜0.05），本研究中微波复热醛类物质含量也偏低，与其研究结果相一致，推测可能与微波加热时间较短有关[18]。2-庚烯醛、苯甲醛和肉桂醛OAV偏低，对复热风味贡献不大。
2.1.2 烃类物质变化分析
烃类物质主要来自脂肪酸烷氧自由基的均裂[19]。不同复热处理猪耳朵制品烃类物质种类和含量分别为23（285.85 μg/kg）、21（575.40 μg/kg）、24（457.46 μg/kg）、18 种（184.72 μg/kg）和17 种（495.17 μg/kg）。微波复热烃类含量显着降低（P＜0.05）。饱和烃类物质阈值偏高，萜品烯OAV较小（＜1），对风味贡献不大。柠檬烯具有柠檬清香，OAV较高，但不同复热处理其含量变化不显着（P＞0.05），复热对其风味变化影响不大。
2.1.3 醇类风味物质变化分析
不同复热处理分别检出醇类物质7（134.35 μg/kg）、6（149.45 μg/kg）、5（85.86 μg/kg）、7 种（92.54 μg/kg）和4 种（60.42 μg/kg）。与对照组相比，巴氏复热含量变化不显着（P＞0.05），其他复热处理醇类物质含量显着降低（P＜0.05）。正己醇和桉叶油醇OAV较高，正己醇可能来自复热过程中不饱和脂肪酸裂解氧化裂解[20]，桉叶油醇可能源自猪耳朵卤制过程中香辛料（如草果）的使用[21-22]。
2.1.4 醚类和酚类物质变化分析
复热猪耳朵制品其醚类物质为对烯丙基苯甲醚和茴香脑2 种。茴香脑OAV较高，对复热整体风味具有一定贡献，巴氏复热显着增加茴香脑含量，水蒸和高温复热对茴香脑含量影响不显着（P＞0.05）。
酚类物质主要是2,6-二叔丁基对甲苯酚、苯酚、对甲苯酚和丁香酚，可能来源于猪耳朵卤制过程中香辛料丁香、肉豆蔻等的使用[23-24]。苯酚和丁香酚具有较高的OAV。不同复热处理对丁香酚含量变化不显着（P＞0.05），复热对其风味变化影响不大。
2.1.5 其他风味物质变化分析
不同复热处理产生少量的酮类、酯类、酸类和杂环类物质。香叶基丙酮在不同复热处理猪耳朵制品中均检出，且巴氏复热其含量显着增加（P＜0.05），其他复热处理含量变化不显着，OAV小于0.1，对整体风味影响不大。
酯类物质的存在可能与猪耳朵制品生产中料酒的添加有关[25]。不同复热处理间乙酸丁酯含量变化不显着（P＞0.05）。巴氏复热处理显着增加乙酸乙酯含量（P＜0.05），其他处理方式间变化不显着（P＞0.05），但OAV偏低（0.18～0.42），在复热整体风味中起一定的修饰作用。
杂环类化合物2-戊基呋喃通常被认为是肉制品最重要的风味物质，其在巴氏、水蒸和高温复热中未检出，微波复热组其含量较对照组略有下降（P＜0.05），微波复热能够较好保持产品肉香味。
2.2 不同复热处理猪耳朵制品挥发性风味OAV分析
表4 不同复热方式下猪耳朵制品挥发性风味物质OAVTable4 OAVs of volatile compounds in cooked pig ear reheated by different methods
OAV大于1，说明该物质可能对总体风味有直接影响；在一定范围内，OAV越大，说明该物质对总体风味贡献越大[26]。由表4可以看出，己醛、辛醛、壬醛、癸醛、（E）-2-癸烯醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、苯酚和丁香酚其OAV基本在10以上，对猪耳朵制品复热风味贡献较大。（E,E）-2,4-癸二烯醛OAV最高，推测其在猪耳朵制品复热风味贡献最大。（E,E）-2,4-癸二烯醛源自亚油酸自动氧化生成9-氢过氧化物的裂解[27]，故亚油酸氧化可能在猪耳朵制品复热风味的形成中发挥重要作用。对表4中不同处理样品风味进行主成分分析，得到不同复热方式对猪耳朵制品复热风味成分载荷图。由图1可知，第1主成分的贡献率为73%，第2主成分的贡献率为22%，总贡献率为95%，表明第1和第2主成分能够较好地反映样品特征，在第1和第2主成分构建的平面上区分度较好。从图1可以看出，样品A、C和E分布在第4象限；样品B和样品C分布在第1象限，样品C在第1和第2主成分上均有较大贡献。这表明巴氏复热、微波复热和高温复热风味差异最为显着，水蒸复热与对照组最为接近，该结果与GC-MS分析结果相一致。
图1 猪耳朵制品复热风味主成分载荷图Fig.1 Biplot of principal component analysis (PCA) for volatilecomponents in cooked pig ear reheated by different methods
2.3 不同复热猪耳朵制品WOF感官评价结果分析
图2 不同复热处理猪耳朵制品WOF感官剖面图Fig.2 WOF prof i le of cooked pig ear reheated by different methods
如图2所示，复热猪耳朵制品WOF以亚麻籽油味为主，带有轻微的金属味和酸败味，失去猪耳朵制品原有的淡脂味和甜香味。对于亚麻籽油味，巴氏和水蒸复热其感官评分较高，高温次之，微波复热最低，相比之下，微波复热在减少亚麻籽油味方面效果较好。高温复热猪耳朵制品金属味最弱，其他处理组间风味强度变化不显着（P＞0.05）。与对照组相比，复热提升酸败味强度，但不同复热处理间酸败味变化不显着（P＞0.05）。湿纸板味和硫化味感知度较弱，且不同复热处理间变化不显着（P＞0.05）。
2.4 不同复热处理对猪耳朵制品WOF成分的影响
戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、戊醇、1-辛烯-3-醇、2,3-辛二酮、2-庚酮、（E,E）-2,4-癸二烯醛，（E,E）-2,4-庚二烯醛、（E）-2-癸烯醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇、二甲基二硫化物多被认为是熟肉产品WOF的主要来源[3-8,28-29]。结合风味物质含量及OAV，选择己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、（E）-2-癸烯醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-醇8 种WOF关键风味因子，具体分析不同复热对其含量的影响。
图3 不同复热猪耳朵制品WOF关键风味因子含量变化Fig.3 The contents of critical fl avor factors related to WOF for cooked pig ear with different reheating treatments
由图3可知，除部分样品未检出外，对比不同复热方式，8 种WOF关键风味因子含量基本呈现巴氏＞高温＞水蒸＞对照＞微波的规律。国外学者研究熟肉制品复热WOF，普遍采用加热使产品温度达到70 ℃[5-6]，与本研究中巴氏复热样品WOF关键风味因子含量较高的结果一致。高温复热样品WOF关键风味因子总量（342.70 μg/kg）较巴氏复热（432.04 μg/kg）有所下降，二者己醛、庚醛、辛醛和（E,E）-2,4-癸二烯醛含量不显着（P＞0.05），推测可能是较高温度发生美拉德反应，其产物延缓了WOF的继续生成[30]，也可能与不饱和脂肪酸受高温蒸煮变化幅度较小有关[31]。水蒸复热其WOF关键风味因子含量（265.75 μg/kg）与对照组差异不显着（P＞0.05），与基于OAV的主成分分析结果相一致。微波复热其含量最低，与较短的复热时间有关，也可能是样品中含有的水分对自由基产生了淬灭[32]。
WOF不是复热中新产生的风味物质，而是已有物质含量升高的结果[33]。己醛和（E,E）-2,4-癸二烯醛是亚油酸的氧化产物，己醛含量高时呈酸败味，含量低呈青草味，（E,E）-2,4-癸二烯醛呈油脂氧化味，OAV最高；壬醛、辛醛是油酸的氧化产物，具有较强烈的脂肪味或粗油脂气味[34]；癸醛具有油脂味，（E）-2-癸烯醛具有青草味；1-辛烯-3-醇具有蘑菇香气、泥土味，略带金属味。这些物质浓度低时促进产品风味，浓度升高则呈现WOF等不良风味，与感官评价中亚麻籽油味、轻微金属味和酸败味存在一致性。
2.5 不同复热方式对猪耳朵制品脂肪氧化的影响
图4 不同复热处理猪耳朵制品TBARS值Fig.4 TBARS values of cooked pig ear with different reheating treatments
TBARS值反映脂质氧化分解所产生的次级产物（如丙二醛）含量的高低，能够更准确地评价脂质氧化程度[35]。从图4可以看出，与对照相比，除微波复热外，巴氏、水蒸和高温复热能够显着促进猪耳朵制品的脂肪氧化（P＜0.05）。其中，水蒸复热氧化程度最强，为0.190 mg/100 g，其次是巴氏复热（0.183 mg/100 g），两者对猪耳朵制品脂肪氧化影响不显着（P＞0.05），高温复热脂肪氧化程度（0.165 mg/100 g）显着低于巴氏和水蒸复热，可能与脂肪氧化酶活性有关，也可能是脂质氧化产物在高温作用下形成新物质。TBARS作为脂肪氧化的指标，也被用来衡量WOF的产生程度[3,5]，巴氏复热较高的TBARS值与WOF关键风味因子较高的含量、较强烈的亚麻籽油味相一致。微波复热较低的TBARS值可能与较短的微波时间有关。微波复热TBARS值为0.156 mg/100 g，脂肪氧化程度最弱，推测微波复热产生较少的WOF，与WOF关键风味因子含量变化趋势和感官评价相一致。尽管图3中水蒸复热其WOF关键风味因子含量变化不显着，但其脂肪氧化程度显着增加，WOF感官评价中亚麻籽油味也较为明显，影响了产品品质。因此，结合感官评价、WOF关键风味因子含量、OAV和TBARS值，推测微波在降低WOF方面具有一定可能性。
3 结 论
结合P&T-TD-GC-O-MS、OAV和TBARS值分析不同复热对猪耳朵制品挥发性风味和脂肪氧化的影响。
不同复热处理猪耳朵制品共鉴定出58 种挥发性风味物质，包括烃类26 种、醛类12 种、醇类7 种、酯类2 种、酮类3 种、含氮含硫及杂环化合物1 种、脂肪酸类1 种、醚类2 种、酚类4 种，醛类和烃类挥发性风味物质含量较高。
己醛、辛醛、壬醛、癸醛、（E）-2-癸烯醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、苯酚和丁香酚OAV较高，对猪耳朵制品复热风味贡献较大。基于主成分分析可知，与对照相比，水蒸复热对其风味变化最不显着；但其脂肪氧化程度显着增加。
复热猪耳朵制品WOF以亚麻籽油味为主，带有轻微的金属味和酸败味；巴氏复热显着增加WOF关键风味因子含量和TBARS值含量。结合感官分析、WOF关键风味因子含量、OAV和TBARS值分析，微波复热更能够避免猪耳朵制品复热WOF的形成。
