蒋晓岚，石渝凤，付周平，成 琳，刘亚军，高丽萍，夏 涛,*
（1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2.安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036）
花青素是一类广泛存在于植物中的天然色素，如紫甘蓝、紫薯、葡萄、玫瑰花、蓝莓、茄子等[1]。花青素属于类黄酮化合物，其基本结构如图1所示，由于取代基的不同，可形成多种花青素，如天竺葵色素、飞燕草色素、矢车菊色素等。游离态的花青素单体在自然条件下非常少见，经常与各种单糖通过糖苷键连接形成花青素糖苷。花青素糖苷中的羟基还可以与一个或多个分子的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等通过酯键形成酰基化的花色苷[1-2]。
图1 花青素基本结构Fig. 1 Basic structure of anthocyanins
花青素类色素具有显着的抗氧化活性[3-5]，还具有抗菌、抗衰老、降低癌症和心血管疾病发病率等重要生理功能[6-10]。基于花青素的这些生理活性，花青素相关研究主要集中在对花青素苷提取纯化的研究[1,10-16]、花青素理化性质及稳定性的研究[3,5,17]、花青素产品的应用及开发以及花青素合成代谢的调控[18-20]等，其中对花青素苷的提取纯化是其他花青素研究的基础。
食用蔬菜紫甘蓝来源丰富，色素含量很高，相关研究报道花青素的稳定性，以及花青素作为酸碱指示剂的特性[21-22]。同其他花青苷类色素一样，紫甘蓝色素具有很强的抗氧化能力，以及预防心脑血管疾病等功效[3-4,23-24]，具有很高的研究价值。液相色谱-质谱法分析表明，紫甘蓝花青素中含有多种花色苷，基本为矢车菊色素的一系列糖苷及其酰化物[1-2,5,25-26]。紫甘蓝中花青素苷的提取纯化技术已基本成熟，相关研究表明大孔树脂柱、Sephadex LH-20凝胶层析柱等对紫甘蓝花青素具有较好的纯化效果[11,27-28]。但有关制备高纯度花青素苷元的方法报道较少。花青素苷元作为花青素苷以及儿茶素类合成的前体，在研究黄酮类生物合成代谢调控中，作为标准物质，必不可少。但是花青素苷元价格昂贵，例如矢车菊色素，现在市售95%纯度的矢车菊色素单体为842.4 元/mg，利用低成本制取高纯度的矢车菊色素苷元具有很大的市场前景。
本实验在前人研究的基础上，首先对紫甘蓝花青素苷进行定性分析，鉴定紫甘蓝中的矢车菊色素苷；然后对矢车菊色素苷的提取条件进行优化，并利用AB-8型大孔树脂对矢车菊色素苷进行初步纯化后，通过高温酸水解的方法获得游离态矢车菊色素粗品；再利用C18柱层析的方法纯化得到矢车菊色素单体；最后通过结晶沉淀的方法获得纯度大于99%矢车菊色素单体粉末，从而为后续的科学研究提供特定的标准物质。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫甘蓝购于合肥清溪路大润发超市，清洗后去除老叶受损的叶子，置于冰箱中保存。
甲醇、乙腈、乙酸（均为色谱纯） 美国Tedia公司；无水乙醇、甲醇（均为分析纯），浓盐酸 国药集团药业股份有限公司；AB-8型大孔树脂 安徽良臣硅源材料有限公司；C18柱填料 GE医疗生命科学公司。
1.2 仪器与设备
ANKE TGL-16C台式离心机 上海安亭科学仪器厂；ZK高速自控组织捣碎机 江苏省盐城县龙岗医疗机械厂；AR124CN电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；UV-265型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；20AD高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 日本岛津公司；HH-2恒温水浴锅 国华电器有限公司；YCYN-DCY-24Y圆形氮吹仪 上海郓曹电子科技有限公司；超高压液相色谱-串联质谱（ultra pressure liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）、20RBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 安捷伦科技（中国）有限公司；Synergi 4u Fusion色谱柱（250 mm×4.6 mm） 美国Phenomenex公司；AVANCE AV 400（400/100 MHz）核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）仪 瑞士Bruker公司。
1.3 方法
1.3.1 紫甘蓝花青素苷的分析鉴定
1.3.1.1 紫甘蓝花青素苷的提取
称取0.1 g紫甘蓝置于研钵中，加入含50%乙醇-1%盐酸溶液1 mL作为提取溶液，进行研磨提取，离心取上清液。重复上述步骤2 次，合并上清液，定容至2 mL，备用。
1.3.1.2 紫甘蓝花青素苷最大吸收波长的确定
将获得的紫甘蓝花青素苷溶液稀释后，以蒸馏水作为空白对照，用分光光度计在400～600 nm波长范围内对其进行吸光度测定，从而确定最大吸收波长，并在最大波长处测定各个因素的吸光度，探讨各因素对紫甘蓝花青素提取纯化的影响。
1.3.1.3 紫甘蓝花青素苷的鉴定
色谱条件：流速0.2 mL/min，柱温箱40 ℃。流动相为0.4%乙酸溶液（A相），100%乙腈（B相）；线性洗脱梯度为：0～10 min，10%～30% B，1 0～1 5 m i n，3 0%～3 5% B；1 5～1 8 m i n，35%～10% B，回到起始比例。
质谱条件：正、负离子模式，电子电离源，碎裂电压175 V，质量扫描范围m/z 100～2 000，毛细管电压3 500 V，干燥气流速6 L/min，干燥气温度350 ℃，喷雾器电压45 psi。
通过UPLC-MS/MS保留时间、最大吸收波长、质子化/去质子化分子（[M+H]+/[M－H]－），以及主要的碎片离子，与标准品及文献进行比较分析，对化合物进行鉴定。
1.3.2 矢车菊花青素苷提取工艺的优化
分别称取0.1 g紫甘蓝叶片放入研钵中，按不同料液比，加入不同体积分数乙醇溶液和盐酸捣碎至匀浆。考察提取液中乙醇体积分数（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、盐酸体积分数（0.5%、1%、2%）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL））因素对矢车菊色素苷提取效果的影响，确定最佳提取工艺。
1.3.3 矢车菊花青素苷的初步纯化
在最佳提取条件下，用组织捣碎机提取约1.152 kg紫甘蓝中的矢车菊色素苷，抽滤后备用。AB-8型大孔树脂填料用无水乙醇浸泡过夜，倒入层析柱中，然后用2～3 倍无水乙醇清洗，再用3～5 倍柱体积的纯水洗至流出液无醇味。将提取的矢车菊色素苷初提液稀释至乙醇体积分数约为10%时上柱，待矢车菊色素苷全部被吸附后，再用3～5 倍柱体积的纯水冲洗；用10%、20%、30%、40%、50%乙醇溶液依次洗脱，收集各洗脱液。
1.3.4 矢车菊花青素苷的酸解
由于矢车菊色素苷属糖苷化合物，而糖苷化合物在含1%～7%盐酸体积分数的洗脱液中，高温下会水解成相应的苷元和糖配体。收集初步纯化的矢车菊色素苷，按4∶1比例与浓盐酸混合配成水解溶液，置于90 ℃恒温水浴箱中水解1 h，得到矢车菊花青素苷水解后的溶液。
1.3.5 矢车菊色素的C18柱纯化
将矢车菊色素纯度最高的组分上C18柱，吸附后分别用3 倍柱体积的30%、50%和70%甲醇溶液洗脱，收集不同的洗脱液，HPLC分析其纯度。
1.3.6 矢车菊色素结晶
将上述得到的高纯度矢车菊色素，用纯水稀释到甲醇体积分数为10%左右，再用大孔树脂吸附，然后用100%甲醇洗脱进行浓缩。浓缩液在通风厨中挥发，除去部分甲醇，按体积比5∶1加入浓盐酸，－20 ℃冷冻一段时间后即出现大量析出的紫红色沉淀。得到的沉淀离心后用氮吹仪吹干，得到矢车菊色素纯品粉末。
1.3.7 矢车菊色素HPLC分析
HPLC条件：检测波长为530 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为5 μL。采用梯度洗脱，条件为A相1%乙酸，B相乙腈，洗脱梯度为0～30 min，87%～70% A相；30～33 min，70%～87% A相。
1.3.8 矢车菊色素1H-NMR分析
将得到的矢车菊色素苷元粉末溶于氘代甲醇（CD3OD），然后转移到5 mm直径的核磁管中，用H-NMR仪在反转门控去偶条件下，脉冲角度为45°，收集时间为0.4 s，延迟时间为2.6 s，扫描频率为25 000～30 000 Hz进行1H-NMR分析。
1.4 数据统计和图像处理
提取条件的优化，每个实验重复3 次，然后取平均值。HPLC及质谱图分析，经Adobe Photoshop CS5软件进一步处理。最后所得矢车菊色素纯品，其得率计算：得率=纯品质量/紫甘蓝质量。
2 结果与分析
2.1 紫甘蓝花青素苷的分析鉴定结果
2.1.1 紫甘蓝花青素最大吸收波长的确定
花青素色素类在520～600 nm波长之间有一明显的最大吸收峰。从图2可知，紫甘蓝花青素的最大吸收峰是在520～530 nm波长处，因此本实验于波长530 nm处测定各吸光度，探讨各种实验条件对紫甘蓝色素提取纯化的影响。
图2 花青素紫外吸收光谱Fig. 2 Ultraviolet absorption spectrum of anthocyanins from purple cabbage
2.1.2 紫甘蓝花青素苷的鉴定
利用UPLC-MS/MS对紫甘蓝花青素苷提取物进行定性分析，由图3A和3B可知，530 nm波长处液相色谱图和总离子流图相一致，且在正离子模式下，花青素苷类化合物的离子化效果很好。根据一级质谱离子和二级质谱碎片离子，以及保留时间等信息（图2C），获得化合物的分子质量信息，分析每个谱峰，确定可能的分子质量，并与文献报道的成分进行比较，推测色谱峰的可能组成。
峰1在正离子模式下，一级质谱m/z 773，二级质谱m/z 611、449和287（图3C和表1）。其中二级质谱中的信号m/z 611、449和287分别是m/z 773失去1、2 个和3 个葡萄糖基（质量数162）所得，根据文献[1,2,5]，峰1预测为矢车菊-3-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。峰4和峰12，正离子模式下，一级质谱m/z 979，二级质谱m/z 817、449和287（图3C和表1），其中二级质谱中的信号m/z 817是母离子m/z 979失去1个葡萄糖基（质量数162）所得，m/z 449是母离子m/z 979失去质量数530所得，推测为2 个葡萄糖基和1 个芥子酰基，根据文献[1,2,5]，峰4和峰12预测为矢车菊-3-(芥子酰基)-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。峰16在正离子模式下，一级质谱m/z 1 185，二级质谱为m/z 1 023、449和287（图3C和表1），其中二级质谱中的信号m/z 1 023，是母离子m/z 1 185失去1 个葡萄糖基（质量数162）所得，m/z 449是母离子m/z 1 185失去质量数736所得，推测为2 个葡萄糖基和2个芥子酰基，根据文献[1,2,5]，峰16预测为矢车菊-3-(芥子酰基)(芥子酰基)-二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷。
图3 紫甘蓝中花色苷的鉴定Fig. 3 Identification of anthocyanins of purple cabbage
按照上述方法，从紫甘蓝中分析鉴定16 种花色苷类化合物（表1），主要为B环二羟基的矢车菊类花色苷。紫甘蓝中花色苷主要为酰基化形式，更有利于花色苷的稳定，酰基化作用的酸有p-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、琥珀酸和芥子酸等。酰化的糖链将折叠好的酰基缠绕在2-苯基苯并吡喃骨架的表面，此堆积作用不仅对花色苷具有保护作用，而且对系统的色泽稳定性具有积极的作用[29]。
表1 通过UPLC-MS MS鉴定紫甘蓝中花青素Table 1 Identifified anthocyanin from purple cabbage via UPLC-MS MS
2.2 紫甘蓝花青素苷元的制备与纯化结果
2.2.1 矢车菊色素苷提取工艺的优化结果
研究结果表明，乙醇体积分数为20%～60%，随着乙醇体积分数的增加，对矢车菊色素苷提取效果越来越好；乙醇体积分数过高，不利于紫甘蓝矢车菊色素苷的提取。本着经济原则以及后续纯化的方便，选择体积分数50%乙醇溶液（图4A）。根据文献[21-22]，酸性溶液环境有助于提高花青素的稳定性，实验发现向提取溶液中加入少量盐酸，能够显着提高提取效果。然而过多盐酸会使溶液酸度过大，在后续的柱层析纯化过程中，影响柱填料的性能，因此结合文献，最终选择含1%盐酸的乙醇溶液作为提取液（图4B）。由图4C显示，随提取试剂的增加，提取效果无明显差别，考虑经济成本以及对环境的影响，选择1∶10（g/mL）作为提取紫甘蓝矢车菊色素苷的料液比。
图4 不同提取条件对矢车菊色素苷提取效果的影响Fig. 4 Effect of extraction concentrations on the yield of cyanidins
2.2.2 矢车菊色素苷的初步纯化结果
矢车菊色素苷粗提液用大孔树脂吸附后，经不同体积分数乙醇梯度洗脱，结果显示40%乙醇溶液洗脱后得到的组分颜色最深，呈紫红色，可知40%乙醇溶液洗脱时得到的矢车菊色素苷的含量最高（图5A）。用紫外分光光度计检测表明，5 组吸光度分别为0.133、0.278、0.468、0.524、0.453，可知40%乙醇溶液洗脱时，其吸光度最大（图5B）。
图5 AB-8大孔树脂纯化紫甘蓝矢车菊色素苷效果Fig. 5 Purification efficiency of cyanidins with macroporous resin AB-8
2.2.3 矢车菊色素的制备与纯化
图6 经C18纯化后的矢车菊色素HHPPLLCC图Fig. 6 HPLCprofiles of cyanidins puri fied with C18
收集初步纯化后的矢车菊色素苷溶液，水解去除糖配体后，再经C18柱纯化。用C18柱纯化时，分别依次用30%、50%、70%甲醇溶液洗脱，收集各洗脱液并进行HPLC分析。由图6A可知，矢车菊色素的出峰时间约为12.5 min，其中30%甲醇洗脱液时，矢车菊色素主峰前仍有杂质峰（图6B），推测是未水解的矢车菊色素苷。70%甲醇洗脱液时，在矢车菊色素主峰后，有杂质峰，可能是水解过程中氧化变性的花青素（图6D）。而50%甲醇洗脱液显示除矢车菊色素峰外，几乎无杂峰，说明经C18柱纯化后，50%甲醇洗脱液中含有高纯度的矢车菊色素单体，其纯度可达到98%（图6C）。
2.2.4 矢车菊色素结晶
根据上述实验最后纯化得到矢车菊色素纯品粉末约100 mg，计算得率为86.806 mg/kg。1H-NMR分析表明，得到的纯品粉末为矢车菊色素（图7A）。HPLC二维以及三维图谱分析表明，结晶后的矢车菊色素纯度大于99%（图7B、C）。光谱分析表明，矢车菊色素最大吸收波长为524 nm（图7D），质谱分析表明，正离子模式下矢车菊色素m/z 287（图7E）。
图7 结晶沉淀后纯化的矢车菊色素特性Fig. 7 Properties of cyanidin monomer powder after crystallization
3 结 论
通过UPLC-MS/MS对紫甘蓝中花色苷进行分析，发现紫甘蓝中花色苷主要是B环二羟基的矢车菊色素的衍生物。在此基础上，对紫甘蓝中花色苷和矢车菊色素进行纯化。首先，以提取剂体积分数、盐酸体积分数、料液比为考虑因素，分别对紫甘蓝中的色素提取条件进行探索，通过单因素试验得出紫甘蓝矢车菊色素苷的最佳提取条件为：含1%盐酸的50%乙醇溶液作为提取溶剂、料液比1∶10（g/mL）。经过AB-8大孔树脂以及C18纯化后，结晶得到比较纯的矢车菊色素。经HPLC分析，纯度达99%以上。1.152 kg紫甘蓝获得100 mg矢车菊色素纯品粉末，得率为86.806 mg/kg。
