N-乙酰-半胱氨酸干预壬基酚对小鼠Sertoli TM4细胞的损伤作用

刘晓珍，聂少平，余 强，黄丹菲，谢明勇,*

（1.东莞理工学院化学工程与能源技术学院，科技创新研究院，广东 东莞 523808 ；2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047 ）

壬基酚（nonylphenol，NP）是环境中普遍存在的化学污染物，被广泛应用于非离子表面活性剂、防腐剂和着色剂，如日常生活用品中的清洁剂、农药制剂、水性涂料、化妆品等。据报道，NP是一种环境内分泌干扰物，具有持久性、生物蓄积性、损伤滞后性及低剂量-效应关系，具有雌激素样作用，可以干扰内分泌激素系统的正常功能，从而导致潜在的生殖问题[1]。通过对果蔬、肉制品、水产品、饮料等的检测，发现NP普遍存在于各类食品中[2]。NP通过食物链、食品加工、食品包装迁移等途径进入食品从而对机体造成潜在危害[3]。

目前对雄性生殖毒物的研究主要集中在睾丸。Sertoli细胞是存在于睾丸生精上皮中的一种体细胞，其在雄性生殖活动中扮演重要的角色。研究表明，Sertoli细胞具有为生精细胞提供营养、激素转化、屏障保护以及吞噬等作用，有关Sertoli细胞的形态和功能的改变以及分子生物学研究已成为雄性生殖研究最活跃的领域[4-5]。另外，有研究表明，睾丸Sertoli细胞是烷基酚类内分泌干扰物作用于雄性生殖系统的靶细胞[6]。

诱导氧化应激和细胞凋亡是环境内分泌干扰物引起多种细胞损伤的主要方式之一，同样，NP能够诱导细胞凋亡从而损害生物体[7-8]。N-乙酰-半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是氧自由基清除剂，具有干扰自由基生成、清除已生成的自由基、预防DNA损伤、调节信号转导系统、抗细胞凋亡等作用。研究报道，抗氧化剂NAC能够降低毒性化合物引起的细胞损伤[9]。NP作为一种环境内分泌干扰物，可对生殖系统产生危害，尤其是雄性生殖系统，但是其具体的作用机制还不清楚。另外，目前尚缺乏针对NP诱导机体损伤的干预治疗相关药物。因此，本研究通过检测细胞氧化应激和凋亡相关参数，用培养的Sertoli TM4细胞探索NP诱导生殖损伤的机制，探寻目前发育不全、男性生殖系统发育异常等疾病发病率明显增加的可能原因。另一方面，以NAC作为干预药物，探讨其对NP诱导的细胞损伤效应的干预作用，从而为NP生物危害的防治策略提供一定的参考。以期发现并评估NP对机体损伤效应的重要指标，为NP的风险评估、建立环境和食品中的控制标准提供依据，同时为NP诱导机体损伤的预防和治疗提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠Sertoli TM4细胞 美国典型菌种保藏中心；DMEM/F12培养基、胎牛血清、马血清 美国Hyclone公司；NP（纯度99.9%）、噻唑蓝（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美国Sigma公司；质量分数0.25%胰酶北京索莱宝公司；2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（2’,7’-dichlorodi-hydrof l uorescein diacetate，DCFH-DA）美国Molecular Probes公司；细胞凋亡检测试剂盒、Caspase-3检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；BCA蛋白质量浓度测定试剂盒 碧云天生物技术研究所；细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p-JNK蛋白一抗 美国Cell Signaling公司。

1.2 仪器与设备

FACSCaliburTM流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；电子天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；Varioskan Flash E33全波长多功能酶标仪、3110 Series II细胞培养箱 美国Thermo Fisher Scientific公司；倒置相差显微镜 日本Olympus公司；超净工作台 上海一恒科技有限公司；高速冷冻离心机 美国Sigma公司；超低温冰箱 青岛海尔电冰箱股份有限公司；Milli-Q50超纯水净化系统 美国Millipore公司；立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；垂直电泳-转膜装置、ChemDoc XRS+化学发光成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与处理

Sertoli TM4细胞加入含质量分数2.5%经活性炭/葡聚糖处理胎牛血清和5%经活性炭过滤马血清的无酚红DMEM/F12培养基，放入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，选用对数生长期生长良好的细胞进行后续实验。

将培养的Sertoli TM4细胞分为4 组，每个处理组设置3 个复孔。对照组：细胞用培养基处理；NP组：细胞用20 μmol/L NP处理24 h；NP+NAC组：细胞用5 mmol/L NAC预处理4 h后加入20 μmol/L NP处理24 h；NAC组：细胞用5 mmol/L NAC预处理4 h后换与对照组相同体积的培养基培养。

1.3.2 MTT法检测细胞存活率

将Sertoli TM4细胞以1×104个/孔接种至96 孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养6 h或24 h。加入NP处理24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，37 ℃继续孵育4 h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择570 nm波长，在多功能酶标仪上测定各孔OD值，根据OD样品/OD对照×100计算细胞相对存活率。

1.3.3 细胞内活性氧生成水平检测

将Sertoli TM4细胞悬液（约2×105个/mL）于3 000 r/min离心10 min，收集细胞，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗2 次，用0.5 mL 10 µmol/L DCFH-DA溶液重悬细胞，37 ℃孵育20 min；3 000 r/min离心3 min，弃上清液，PBS洗2 次，采用激发波长488 nm、发射波长525 nm于流式细胞仪检测细胞内DCF的荧光强度，每次计数1×104个细胞，用WinMDI 2.9软件分析活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成水平。

1.3.4 分光光度法检测细胞内SOD活力、CAT活力、MDA含量以及Caspase-3相对活力

收集Sertoli TM4细胞，PBS洗2 次，利用液氮在37 ℃下进行5 次反复冻融，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒测定蛋白质量浓度。按照试剂盒说明书测定细胞内SOD活力、CAT活力、MDA含量以及Caspase-3相对活力。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

胰酶消化收集Sertoli TM4细胞（5×105个/mL），将细胞悬液于3 000 r/min离心10 min，预冷PBS洗2 次后用500 μL Binding Buffer重悬细胞，加入Annexin V-FITC和PI探针各5 μL，避光反应5 min后立即用流式细胞术检测各组细胞染色情况。同时以不加Annexin V-FITC及PI探针的细胞样本作为裸细胞，用于设定流式细胞术检测条件。

1.3.6 Western blot法检测ERK1/2、JNK1/2蛋白的磷酸化水平

将Sertoli TM4细胞以2×105个/孔接种至6 孔培养板中。细胞培养24 h后用预冷PBS洗2 遍，加入细胞裂解液，采用蛋白提取试剂盒提取细胞蛋白。用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒测定蛋白质量浓度，等量蛋白上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（质量分数5%浓缩胶、50 V、30 min；质量分数10%分离胶、100 V、55 min），湿法转印NC膜。转印完毕后，NC膜采用牛血清白蛋白封闭2 h，TBST洗3 遍后继续用JNK1/2、p-JNK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2一抗按体积比1∶1 000稀释孵育过夜，TBST洗3 遍，再用辣根过氧化物酶标记二抗按体积比1∶5 000稀释孵育2 h。采用显影液化学发光显色反应，采用全能型凝胶成像分析系统成像、Quantity One软件分析。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 NAC和NP对Sertoli TM4细胞存活率的影响

图1 NAC干预NP对Sertoli TM4细胞的毒性作用Fig. 1 NAC attenuated NP-induced cytotoxicity in mouse Sertoli TM4 cells

如图1所示，20 μmol/L NP处理6 h对Sertoli TM4细胞无损伤作用。而与对照组相比，NP作用24 h能够显着降低Sertoli TM4细胞的相对存活率（P＜0.05）。经NAC预处理后再用NP作用于细胞，细胞相对存活率与对照组相比无显着性差异；同样地，与对照组相比，NAC组细胞相对存活率无显着变化，表明NAC预处理4 h对细胞无损害作用，并且能够减少NP引起的细胞损伤。

2.2 NAC和NP对Sertoli TM4细胞内ROS含量的影响

图2 NAC对NP诱导的Sertoli TM4细胞内ROS生成的干预Fig. 2 NAC attenuated NP-induced ROS generation in mouse Sertoli TM4 cells

如图2所示，与对照组相比，20 μmol/L NP处理细胞24 h能够引起Sertoli TM4细胞内ROS含量极显着上升。与NP组相比，NAC预处理能够显着下调NP诱导的ROS生成量。

2.3 NAC和NP对Sertoli TM4细胞内抗氧化物酶活力和MDA含量的影响

表1 NAC和NP对Sertoli TM4细胞内抗氧化物酶活力和MDA含量的影响Table 1 Effect of NAC on NP-induced antioxidant enzyme activities and MDA content in Sertoli TM4 cells

从表1可见，与对照组相比，NP组细胞内的MDA含量极显着升高。NAC预处理后，细胞内MDA含量极显着减少，表明NAC预处理可减轻NP引起的Sertoli TM4细胞脂质过氧化。与对照组相比，NP组细胞内SOD、CAT活力极显着下降。与NP组相比，NP+NAC组细胞内SOD、CAT活力极显着增加，表明NAC预处理可逆转NP引起的细胞内SOD、CAT活力下降。这些结果表明NAC具有保护NP对Sertoli TM4细胞的损伤作用，该保护作用与减少细胞内氧化应激的形成有关。

2.4 NAC和NP对Sertoli TM4细胞凋亡的影响

图3 NAC对NP诱导的Sertoli TM4细胞凋亡的干预Fig. 3 NAC attenuated NP-induced apoptosis in mouse Sertoli TM4 cells

如图3所示，与对照组相比，Sertoli TM4细胞经20 μmol/L NP处理24 h后，凋亡细胞明显增加。用5 mmol/L NAC预处理Sertoli TM4细胞后，NP诱导的细胞凋亡率显着下降（P＜0.05），这表明NAC对NP诱导的细胞凋亡损伤具有保护作用。

图4 NAC抑制NP对Caspase-3的激活作用Fig. 4 NAC blocked NP-induced activation of caspase-3 in mouse Sertoli TM4 cells

图4 显示NP组、NP+NAC组、NAC组Caspase-3相对活力分别为对照组的（1.48±0.15）、（1.08±0.11）、（0.92±0.09）倍。NP处理激活了细胞内Caspase-3，表明NP可通过激活Caspase-3诱导细胞凋亡。而NAC预处理能够抑制NP诱导的Caspase-3活力的增加，进一步说明NAC能够抑制NP对Sertoli TM4细胞的凋亡诱导作用。

2.5 NAC和NP对Sertoli TM4细胞内JNK、ERK信号通路的影响

图5 NAC和NP对Sertoli TM4细胞ERK信号通路的影响Fig. 5 NAC blocked NP-induced activation of the ERK signaling pathway in mouse Sertoli TM4 cells

图6 NAC和NP对Sertoli TM4细胞JNK信号通路的影响Fig. 6 NAC blocked NP- induced activation of the JNK signaling pathway in mouse Sertoli TM4 cells

如图5、6所示，与对照组相比，NP能够显着增加ERK和JNK的磷酸化水平，表明NP激活了Sertoli TM4细胞内ERK和JNK细胞信号通路。进一步研究发现，NAC预处理能够降低NP诱导的ERK和JNK的磷酸化水平升高。结果表明，NP处理能够激活Sertoli TM4细胞内JNK和ERK通路，并且ROS参与了该过程，ROS清除剂NAC能够阻断这一过程。

3 讨 论

作为一种典型的环境内分泌干扰物，NP引起了学术界和公众的广泛关注。大量的证据表明，有害化学物质在环境中暴露可诱导机体损伤。Duan Peng等[10]发现NP暴露可引发雄性SD大鼠睾丸生精功能退化、精子数量和质量降低。本研究中NP作用24 h后引起Sertoli TM4细胞存活率显着降低，表明NP处理可造成细胞损伤。NAC预处理抑制了NP诱导的细胞凋亡，表明NAC对NP诱导的细胞损伤具有保护作用。

ROS的大量生成和脂质过氧化的增加是氧化应激的两个重要指标。ROS和抗氧化系统之间的平衡与细胞死亡密切相关，ROS的过量生成会诱导线粒体内膜双磷脂酰甘油的过氧化，从而触发细胞色素c的游离。SOD、CAT是细胞内重要的内源性抗氧化物酶，可间接反映细胞内的抗氧化水平[11]。MDA为细胞中多不饱和脂肪酸氧化生成的脂质过氧化物，其含量常用以评价脂质过氧化水平[12]。前人的研究发现，NP能够在多种细胞中诱导ROS的生成，包括Raji淋巴瘤细胞[13]、U937单核细胞白血病细胞[14]、人血中性粒细胞[15]、大鼠原代Sertoli细胞[16]。本研究结果显示，经NP处理后，Sertoli TM4细胞内ROS生成量和MDA含量显着增加，抗氧化物酶活力降低，这些结果均说明NP暴露能够引发Sertoli TM4细胞内氧化应激。

氧化应激被认为是引发细胞凋亡的一个主要机制[17-18]，因此，本研究进一步探究了NP是否能够通过与ROS生成相关的氧化应激诱导细胞凋亡。结果发现，NP处理细胞24 h后显着诱导细胞凋亡，证实NP是通过ROS过量生成引起的氧化应激和细胞凋亡诱导Sertoli TM4细胞损伤，这与前期报道结果[19-20]一致。抗氧化剂NAC能够通过抑制ROS的生成以及维护体内抗氧化系统的平衡从而保护机体或细胞免受有害化学物质的损伤。Ansari等[21-22]报道NAC或者肌肽预处理能够减缓亚硝酸盐对大鼠肠道/血液的损伤作用。本研究中，NAC预处理能够有效抑制NP诱导的氧化应激，主要表现在NAC有效抑制了细胞内ROS的生成、降低抗氧化物酶活力和增加MAD含量，与NAC对NP诱导的氧化应激的干预效果一致。NAC对NP诱导的Sertoli TM4细胞凋亡损伤具有保护作用，主要表现在NAC预处理后，经过NP处理的Sertoli TM4细胞凋亡率和Caspase-3相对活力下降。本研究证明NAC对NP诱导的细胞凋亡损伤具有保护作用，并且NP主要是通过与ROS生成相关的氧化应激诱导细胞凋亡。Huang Wenting等[23]发现NP处理能够诱导SD大鼠睾丸以及Sertoli原代培养细胞发生氧化应激和细胞凋亡，NAC预处理能够缓解这一现象，这与本研究结论一致。

近年来，随着对细胞信号转导途径研究的逐步深入，环境内分泌干扰物对信号转导途径尤其是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的作用引起了人们的广泛关注。MAPK信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导细胞增殖、分化、凋亡和对环境刺激的反应等。目前已知MAPK具有5 个单元，即JNK1、JNK2、p38、ERK1、ERK2亚家族。而JNK、p38和ERK的磷酸化动态平衡决定了细胞的存活或凋亡。研究报道，大量环境污染毒性物质能够通过激活MAPK通路诱导细胞凋亡[24-27]，在本研究中，Sertoli TM4细胞暴露于NP下，细胞内ERK和JNK磷酸化水平显着增加，表明ERK和JNK信号通路参与了NP对细胞的损伤作用。NAC预处理能够抑制NP对ERK、JNK信号通路的激活作用，该结果进一步证明NAC能够通过干预ERK和JNK信号通路抑制NP对Sertoli TM4细胞的损伤作用。

综上，本研究发现NP对Sertoli TM4细胞具有一定的损伤作用，当Sertoli TM4细胞暴露在一定浓度NP环境下，细胞内ROS生成增加、抗氧化物酶活力降低、MDA含量和细胞凋亡率增加，表明诱导细胞内氧化应激和细胞凋亡是NP造成细胞损伤的主要方式之一。同时，ERK和JNK信号通路参与了NP对细胞的损伤作用。NAC预处理能够抑制NP对Sertoli TM4细胞的损伤作用，主要表现在NAC能够缓解NP诱导的细胞内氧化应激，抑制NP诱导的Sertoli TM4细胞凋亡，以及阻断NP激活ERK和JNK信号通路。