大黄鱼源腐败菌的黏附特性与生物膜特性分析

张 雯，卞 丹，阮成旭，时祥柱，倪 莉,*

（1.福州大学食品科学技术研究所，福建省食品生物技术创新工程技术研究中心，福建 福州 350108；2.福建省新闽科生物科技开发有限公司，福建 福州 350008）

水体中的病原细菌可通过黏附鱼鳃、鱼体表和肠道定植鱼体，并最终使其感染[1-2]。Van Den Abbeele等[3]发现不同细菌的黏附能力差异较大，Lee等[4]研究表明戊糖乳杆菌对肠黏液的黏附率显着高于其他细菌。同时，研究发现细菌对黏液的黏附特性与菌体表面性质（包括菌体表面疏水性、自凝聚能力）等有关，Del Re等[5]研究证实双歧杆菌的黏附性与其表面疏水性和自凝聚能力密切相关，具有较强疏水性和自凝聚能力的菌株具有更高的黏附能力；许女等[6]也通过实验证明牛源乳酸菌的表面疏水性和其黏附性能呈正相关。大量研究表明细菌能在黏附于物体表面、气液界面后生长繁殖，形成由菌体细胞和胞外分泌物如多糖、蛋白质和核酸等组成的膜状结构，即生物膜。致病菌形成的生物膜会促进感染的发生，阻碍疾病的治疗，而鱼体腐败菌形成的生物膜则可能污染加工设备，加速鱼体的衰败、变质。郭庆昕等[7]探究发现黏附能力强的铜绿假单胞菌，其生物膜形成能力也较强。龚虹等[8]研究表明乳酸菌的疏水性、自凝聚能力和生物膜形成能力有正相关关系，可作为菌体黏附能力的指标。此外，生物膜的形成也与多种环境条件相关，尹清干等[9]实验表明培养时间、初始菌浓度、温度、pH值及不同组织和黏液等各种环境因子均能显着影响鳗弧菌生物膜的形成。

目前，国内外学者对乳酸菌、双歧杆菌等益生菌及一些致病菌的黏附能力、生物膜特性、疏水性等方面进行了较深入研究，而从黏附特性的角度研究鱼体腐败菌较少。希瓦氏菌和假单胞菌是引起冰鲜鱼体腐败变质的特定腐败菌[10-13]。本研究以大黄鱼源腐败菌为研究对象，比较腐败菌黏附差异，探究表面疏水性、自凝聚能力及生物膜形成能力与菌体黏附能力的相关性，并通过微孔板法探究时间、pH值、温度、初始菌浓度等因素对其成膜的影响。这些研究将进一步明确鱼源腐败菌的腐败机理，为保鲜剂的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

希瓦氏菌属（Shewanella sp.）MA1-5、MA1-7和MA1-13，假单胞菌属（Pseudomonas sp.）R3-1、R3-2和R3-5，分离自冰鲜大黄鱼，本实验室保存。

结晶紫 西陇化工股份有限公司；胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基 广东环凯微生物科技有限公司；乙醇、甲醇、二甲苯、氯化钠 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1100紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；CF16RXII冷冻高速离心机 日本Hitachi公司；SpectraMax i3+MiniMax多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌的活化与培养

希瓦氏菌和假单胞菌经斜面培养基活化后，划线接种至牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，28 ℃恒温培养24 h。挑取1 环单菌落接种于50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养过夜。

1.3.2 细菌表面疏水性测定

采用微生物黏着碳氢化合物（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）法[14]测定鱼源腐败菌的表面疏水性。细菌培养物经8 000 r/min离心10 min收集菌体，生理盐水洗涤2 次，8 000 r/min离心10 min，弃上清液，用生理盐水重悬菌体沉淀，并调节菌悬液浓度，使其A600nm为1.0±0.05。吸取2 mL细菌悬液和2 mL二甲苯涡旋混合2 min，于室温静置30 min。待其分层，取1 mL水相，测其A600nm，每组平行3 管，以生理盐水为空白对照组。表面疏水率计算如式（1）所示：

式中：A0和A1分别为与二甲苯混匀前后水相吸光度。

1.3.3 菌株自凝聚能力测定

参考Rahman等[15]方法测定细菌自凝聚能力，细菌培养物经8 000 r/min离心10 min收集菌体，生理盐水洗涤2 次，8 000 r/min离心10 min后，弃上清液，用生理盐水重悬菌体沉淀制备菌悬液，使菌悬液A600nm为1.0±0.05。吸取4 mL菌悬液置于10 mL试管中，室温静置，分别于1、2、3、4、5 h后吸取1 mL上层溶液测定A600nm，分别记作A1、A2、A3、A4、A5，每组每个时间点平行3 管。自凝聚率计算如式（2）所示：

式中：A0和At分别为自凝聚前后上层溶液吸光度。

1.3.4 细菌黏附能力的测定

采用Vinderola等[16]方法对细菌进行荧光标记，参照Larsen等[17]的方法收集大黄鱼体表、鱼鳃和鱼肠部位黏液，以福林-酚法测定蛋白质质量浓度，并调节至0.5 mg/mL，分装保存于-20 ℃冰箱。取体表、鱼鳃和鱼肠黏液各150 μL加入96 孔酶标板中，4 ℃包被过夜。弃去未结合黏液，用200 μL无菌0.01 mol/L磷酸盐缓冲液清洗2 次，加入150 μL异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的菌悬液，4 ℃孵育120 min。用无菌生理盐水清洗2 次除去未黏附的细菌，再加入150 μL 1%十二烷基硫酸钠（0.1 mol/L NaOH）溶液于60 ℃培养箱中释放裂解1 h，多功能酶标仪上检测，每组重复9 孔，以1%十二烷基硫酸钠为空白对照，通过荧光强度按式（3）计算细菌黏附率。多功能酶标仪参数设置：激发光波长：495 nm；发射光波长：525 nm；光学位置：bottom；每孔样品检测次数：12 次。

式中：FI2为实验组的荧光强度；FI1为FITC标记的纯菌悬液的荧光强度。

1.3.5 细菌生物膜的检测

参考Djordjevic等[18]微孔板法并适当修改。鱼源腐败菌过夜培养后，与新鲜TSB按1∶1 000稀释混匀，取200 µL加至96 孔酶标板孔中，28 ℃静置培养24 h后弃去培养液，用200 µL 0.85%无菌生理盐水轻柔清洗2 次，除去游离菌，室温下干燥。每孔加入200 µL 0.1%结晶紫溶液，室温染色15 min后弃去染液，去离子水清洗5 次。完全干燥后，加入200 µL 95%乙醇溶液，待结晶紫充分溶解后，吸取100 µL放于全新96 孔板中，用多功能酶标仪检测A590nm。每组设置9 个平行，以无菌TSB为空白对照。

1.3.6 不同因素对生物膜形成特性的影响

1.3.6.1 培养时间对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

以希瓦氏菌MA1-7为鱼源腐败菌代表，测定不同因素对细菌生物膜形成的影响。将生物膜培养时间分别设置为6、12、24、30、36、48、54、60、72 h，按1.3.5节方法测定生物膜形成情况。

1.3.6.2 菌浓度对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

用TSB培养液配制终密度为108CFU/mL的菌悬液，10 倍系列梯度稀释法依次得到107、106、105、104、103、102CFU/mL的菌悬液，按1.3.5节方法测定生物膜形成情况，探究初始菌浓度对生物膜形成的影响。

1.3.6.3 温度对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

TSB肉汤培养液配制终密度为106CFU/mL的菌悬液，分别在4、10、20、28、37、45 ℃条件下静置培养24 h，按1.3.5节方法测定生物膜形成情况。

1.3.6.4 pH值对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

分别用pH 3、4、5、6、7、8、9、10的TSB培养液配制菌浓度为106CFU/mL的菌悬液，按1.3.5节方法测定生物膜形成情况。

1.3.6.5 NaCl质量分数对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

分别配制NaCl质量分数为0.5%、0.8%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、6%的TSB培养液，以此制备菌悬液，按1.3.5节方法探究NaCl质量分数对鱼源腐败菌生物膜形成的影响。

1.3.6.6 不同部位黏液对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

分别取体表、鱼鳃和鱼肠黏液200 µL加入96 孔板中，4 ℃过夜包被，弃去未结合黏液，用无菌生理盐水清洗2 次，按1.3.5节方法测定生物膜形成情况，以未经黏液包被的96 孔板作为对照。

1.4 数据分析

结果以 ±s表示，采用GraphPad Prism 6.0绘图，SPSS 22.0的Duncan检验进行显着性分析。

2 结果与分析

2.1 细菌表面疏水性和自凝聚能力分析

菌体表面疏水作用和自凝聚能力是细菌非特异性黏附到各种生物和非生物表面及界面的重要理化作用力，被认为是细菌与宿主间相互作用的因素之一，且与其特异性黏附相关[14]。本研究通过疏水性细菌易聚集到水-油界面这一特点，采用二甲苯测定各菌株的疏水性。图1表明，不同鱼源腐败菌的表面疏水性存在高度差异性，疏水率由弱至强依次为R3-2、MA1-5、R3-1、R3-5、MA1-7、MA1-13，其中希瓦氏菌MA1-13的表面疏水性显着高于其他菌株，假单胞菌R3-2显着低于其他菌株。MATH法[19]中菌株疏水率大于50%为高疏水性，小于20%为非疏水性，由此可知鱼源腐败菌MA1-13、MA1-7、R3-5和R3-1为高疏水性菌株，而不存在非疏水性菌株。比较两属细菌发现，希瓦氏菌属的表面疏水性强于假单胞菌属。疏水作用的强弱取决于细菌表面非极性基团的数量，与菌体表面蛋白、菌毛、荚膜等附着器有关，因此不同属细菌表面疏水性存在差异性。图2中鱼源腐败菌的自凝聚能力随着静置时间的推移而显着增强，且菌株间自凝聚率具有明显差异，自凝聚能力由弱至强依次是R3-5、R3-1、R3-2、MA1-5、MA1-7和MA1-13，其中希瓦氏菌MA1-7和MA1-13的自凝聚能力最强，希瓦氏菌MA1-5在静置1 h时的自凝聚能力较弱，但之后随着时间的推移，迅速提高。假单胞菌属的自凝聚能力则明显弱于希瓦氏菌属。

图1 希瓦氏菌和假单胞菌的表面疏水性Fig. 1 Surface hydrophobicity of Shewanella and Pseudomonas

图2 希瓦氏菌和假单胞菌的自凝聚能力Fig. 2 Auto-aggregation ability of Shewanella and Pseudomonas

细菌表面疏水性及自凝聚能力两个指标的比较中，希瓦氏菌强于假单胞菌。细菌黏附分为两阶段，第1阶段为聚集和吸附，细菌接近黏膜上皮细胞发生非特异性结合；第2阶段为特异性受体与细菌发生特异性结合过程。细菌表面性质如疏水性和自凝聚能力则在第1阶段发挥作用，有助于细菌聚集形成生物膜并在宿主表面定植和感染，可以推测希瓦氏菌在鱼体黏附能力上将更强于假单胞菌。

2.2 细菌黏附能力分析

鱼源腐败菌黏附于宿主是其侵袭和致腐的先决条件，细菌定植后，才可在该部位大量繁殖，产生代谢物或毒素进攻宿主。探究希瓦氏菌和假单胞菌对大黄鱼黏液的黏附能力差异，图3表明不同细菌的黏附能力不同，对鱼体不同部位黏液的黏附能力也显着不同。就菌株而言，希瓦氏菌MA1-5和MA1-7对各部位的黏附能力均强于其他菌株（P＜0.05），3 株假单胞菌的黏附能力无明显差异（P＞0.05）。Chen Qiang等[20]表明溶藻弧菌对大黄鱼黏液的黏附取决于细菌表面结构，不同的黏液成分影响细菌的黏附作用强弱。细菌黏附过程由细菌表面的黏附素和黏液中的特异性受体共同完成，而黏附素包括糖蛋白、脂多糖、外膜蛋白等。因此细菌对不同黏液的黏附能力具有差异性，与其对黏液的宿主特异性及细菌自身的黏附素都有关[8]。从黏液部位分析，细菌对鱼肠黏液的黏附能力显着低于其对鱼鳃黏液和体表黏液的黏附能力（P＜0.05）；不同腐败菌对鱼鳃黏液的黏附能力均强于其他黏液，说明鱼鳃是鱼在环境中携带细菌最重要的场所，鱼鳃对腐败菌的黏附可能在鱼体腐败和保鲜中扮演重要的角色。致病弧菌对大黄鱼的黏附作用研究中，同样发现其对鱼鳃黏液有较高的黏附量[1]。

图3 希瓦氏菌和假单胞菌的黏附能力Fig. 3 Adhesion ability of Shewanella and Pseudomonas

2.3 细菌生物膜形成能力分析

生物膜是指细菌黏附于物体或组织表面时形成的含有微菌落及其胞外分泌物的基质层，它能增强细菌对外环境的抵抗力[21]，因此腐败菌生物膜形成能力越强，则其抵御能力越强，导致鱼体腐败越严重。通过微孔板法测定各腐败菌的生物膜形成能力，图4表明不同腐败菌形成生物膜的能力显着不同，希瓦氏菌强于假单胞菌。希瓦氏菌MA1-7是6 株大黄鱼源腐败菌中生物膜形成能力最强的；其次是MA1-5和MA1-13，两者形成生物膜的能力无显着差异；而假单胞菌R3-5最弱。结果表明腐败菌的黏附能力与成膜能力存在一定的一致性。任真真[22]的研究认为以生物膜形成情况可用于评估乳酸菌的黏附能力，这都说明细菌的生物膜形成能力与其黏附作用息息相关。

图4 希瓦氏菌和假单胞菌的生物膜形成能力Fig. 4 Biofilm formation ability of Shewanella and Pseudomonas

2.4 细菌黏附特性相关指标的相关性分析

以6 株鱼源腐败菌的表面疏水性、自凝聚能力、黏附能力及生物膜形成能力为因素，用皮尔逊相关系数表示黏附特性与黏附能力之间的相关性，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析探究希瓦氏菌属和假单胞菌属在黏附作用上的差异。

表1 黏附能力与黏附特性间皮尔逊相关性分析Table 1 Correlation of adhesive ability with adhesive properties using Pearson correlation coefficient

对不同部位黏液黏附能力与黏附特性指标进行相关性分析，通过表1可看出，菌体对鱼肠黏附性与自凝聚能力和生物膜形成能力具有较高的相关性，对体表黏附性只与生物膜形成能力有关，对鱼鳃黏附性与表面疏水性、自凝聚能力和生物膜形成能力都具有一定的相关性。

图5 希瓦氏菌和假单胞菌的黏附特性的PCAFig. 5 PCA plot of adhesion characteristics of Shewanella and Pseudomonas

图5 中F1和F2累计方差贡献为82.68%，能反映出大部分信息，说明通过PCA可较好地区分腐希瓦氏菌属和假单胞属的黏附能力差异。希瓦氏菌属细菌聚集F1轴正坐标，假单胞菌属细菌F1负坐标，说明假单胞菌和希瓦氏菌在黏附特性上具有显着差异，可通过4 个指标可不同菌属区分开。同时，假单胞菌间聚集度高于希瓦氏菌属，这也表明假单胞菌属细菌在黏附特性上具有更多的相似性。

图6 基于黏附特性的希瓦氏菌和假单胞菌聚类分析Fig. 6 Clustering analysis of adhesion characteristics of Shewanella and Pseudomonas

由聚类分析结果（图6）可知，取阈值为6时，细菌以4 项指标可分为3 类，即I类（R3-1、R3-5、R3-2）、II类（MA1-13）、III类（MA1-5、MA1-7）。这说明假单胞菌属细菌间的黏附作用相近，希瓦氏菌属细菌MA1-5和MA1-7能力相近，而与MA1-13有一定差异。这与PCA有一定相似性，PCA中MA1-13距离MA1-5和MA1-7较远，MA1-13表现出更强的表面疏水性，但表面疏水性与黏液黏附性没有高的相关性，因此在黏附能力上，较MA1-5和MA1-7弱。

2.5 不同因素对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

2.5.1 培养时间对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

图7 培养时间对希瓦氏菌生物膜形成的影响Fig. 7 Effect of culture time on biofilm formation of Shewanella

由图7可知，培养时间对鱼源腐败菌形成生物膜有显着影响。培养6 h时细菌增长繁殖但还未聚集，而12 h观察到细菌开始在培养基表面聚集，生物膜开始形成，呈现易被破坏的细条状。12～24 h培养期间，生物膜量逐渐增加；在36 h达到最大值，并维持至54 h，该阶段生物膜形成量无显着差异；54 h之后生物膜量开始下降，厚度逐渐降低。Stoodley等[23]认为生物膜的形成是一个动态过程，经历形成、成熟和老化3 个阶段，Lin Shiqi等[21]则是将形成期再分成初始附着期和早期发展期。根据本研究结果，腐败菌生物膜的形成可分为形成期0～36 h，成熟期36～54 h，老化期60～72 h。细菌黏附后，产生的不溶性多糖有助于其群体间的聚集，生物膜三维结构逐渐形成，厚度显着增加。但进入成熟期后，培养基中的营养成分消耗，且代谢物累积，菌体生长受到限制；老化期时，生物膜上的细菌活性降低，胞外多糖量减少，生物膜开始脱落、减少[24-25]。

2.5.2 初始菌浓度对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

图8 希瓦氏菌初始菌浓度对细菌生物膜形成的影响Fig. 8 Effect of initial bacterial concentration on biofilm formation of Shewanella

图8 表明，随着细菌初始菌浓度（102～106CFU/mL）的提高，其生物膜形成量显着增加。但达到106CFU/mL后，即使浓度增加，生物膜的形成结果无显着差异，即浓度达到一定值后对生物膜形成无显着影响。细菌黏附到接触面后便利用环境中的营养成分生长繁殖，适当的菌体浓度可加速生物膜的形成[24]；当细菌增殖达到一定浓度，环境中的营养物质被消耗完全，细菌生长被抑制，从而导致生物膜的形成受到抑制。

2.5.3 培养温度对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

图9 培养温度对希瓦氏菌生物膜形成的影响Fig. 9 Effect of incubation temperatures on biofilm formation of Shewanella

微生物在适宜温度下进行生长繁殖和代谢活动，因此细菌生物膜的形成与培养温度密切相关。图9表明，温度在4～20 ℃之间时，由于细菌处于不适宜温度下，生长缓慢，几乎不形成生物膜，此期间温度对成膜无显着影响（P＞0.05）。而在20～37 ℃范围内，随着温度的升高，细菌生物膜形成量显着增加，且在37 ℃达到最大值。37～45 ℃，温度继续升高，生物膜形成量显着下降，这可能是细菌不耐受高温或胞外酶类失活导致。有研究认为高温抑制鞭毛的生成，而鞭毛与生物膜形成有关[25]。温度对鳗弧菌[5]、溶藻弧菌[24]等都具有相似的影响。

2.5.4 pH值对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

图10 pH值对希瓦氏菌生物膜形成的影响Fig. 10 Effect of pH valus on biofilm formation of Shewanella

图10 表明，生长环境的pH值显着影响鱼源腐败菌的生物膜形成情况。pH值在3～4时为强酸性环境，不利于细菌生物膜的形成，A590nm显着低于其他组。pH值从4升到7的过程中，酸性逐渐减弱至中性，鱼源腐败菌的生物膜形成能力显着增强，并在pH 7时达到最大值。随后，pH值从8继续升高至10，碱性慢慢增强，A590nm迅速减小，即细菌的生物膜形成量显着下降。由此猜测在强酸性和强碱性环境中，鱼源腐败菌的活性可能受到抑制，从而导致生物膜形成能力也受到阻碍。

2.5.5 NaCl质量分数对鱼源腐败菌生物膜形成的影响

图11 NaCl质量分数对希瓦氏菌生物膜形成的影响Fig. 11 Effect of of NaCl concentration on biofilm formation of Shewanella

图11 显示，NaCl质量分数对鱼源腐败菌生物膜的形成有显着影响。当NaCl质量分数为0.8%时，希瓦氏菌生物膜的形成量最多，此后随着质量分数增大，生物膜形成量显着下降。这说明低浓度NaCl会促进希瓦氏菌生物膜的形成，其主要原因是Na+可驱动端鞭毛的运动，从而促进生物膜的形成[26]，而高浓度NaCl溶液却抑制细菌生物膜的形成。研究发现当NaCl质量分数为1.5%时，希瓦氏菌生长速率最大[27]，而本结果中该质量分数下的生物膜量仅次于最适浓度下的形成量。希瓦氏菌可在较高盐条件下生长，这可能是其在NaCl质量分数3%～6%条件下仍可形成生物膜的原因。陆文伟等[28]探究双歧杆菌生物膜的成膜规律，发现其对氯化钠、硫酸镁等离子具有一个最适浓度；副溶血性弧菌在NaCl质量分数2%时形成生物膜能力最强，但当其在NaCl和葡萄糖混合溶液中时，其生物膜的形成受葡萄糖浓度的调控[29]。

2.5.6 不同部位黏液对希瓦氏菌生物膜形成影响

图12 不同部位黏液对希瓦氏菌生物膜形成的影响Fig. 12 Effect of fish mucus type on biofilm formation of Shewanella

鱼源腐败菌对不同部位大黄鱼黏液的黏附能力不同，进一步探究不同部位的黏液对细菌形成生物膜的影响。如图12所示，与对照组正常TSB培养基中形成的生物膜量相比，包被黏液后的实验组生物膜量产生显着差异。当96 孔板包被鱼肠黏液和体表黏液后，希瓦氏菌形成的生物膜量低于对照组，但包被鱼鳃黏液后，生物膜量显着高于对照。此部分结果与菌体对鱼体黏液层黏附能力具有对应关系。黏附实验表明鱼源腐败菌对鱼鳃黏液的黏附能力最强，而腐败菌对鱼肠和体表黏液的黏附能力较弱。黏液层是生物体防御机制的重要组成部分，体表和鱼肠黏液可能含有某些抑菌成分，在一定程度上抑制细菌繁殖、分泌胞外多糖等，从而降低生物膜的形成量。由此可以推测，鱼体表和鱼肠黏液可能存在某些因素，抑制腐败菌的黏附与生物膜的滋生。

3 结 论

希瓦氏菌属比假单胞菌属具有更强的对海水鱼体黏液的黏附能力，同时具有很好的生物膜形成能力。黏附能力与自凝聚能力和生物膜形成能力有较高的相关性。希瓦氏菌的生物膜形成受初始菌浓度、培养时间、温度、pH值、盐含量等多种环境因素影响。希瓦氏菌在初始菌浓度大于106CFU/mL、37 ℃、pH 7～8、0.8% NaCl时形成的生物膜量最多；生物膜在12～24 h期间快速形成，并在36 h达到峰值后，随培养时间延长而逐渐下降。大黄鱼黏液对腐败菌的黏附和成膜都具有一定程度的影响，鱼肠黏液对菌体的黏附性最小，对生物膜形成具有抑制作用，而鱼鳃黏液对菌体的黏附性最高，对生物膜形成具有促进作用。希瓦氏菌和假单胞菌是常见的鱼体腐败菌，但不同水域、不同种类的鱼体中特定腐败菌种类不同、比例不同。深入了解腐败菌在鱼体的黏附、定植、成膜，并取得腐败优势的成因，是解释鱼体腐败机理的一个重要途径。