延迟采收对酿酒葡萄类黄酮物质的影响

赵 婷，吴佳颖，陈黄曌,2，梁 攀，孟江飞，张振文,*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.河南牧业经济学院食品与生物工程学院，河南 郑州 450046）

类黄酮物质是植物酚类次生代谢物，由苯环上连有一个或多个羟基构成[1]。在葡萄与葡萄酒中类黄酮物质占有举足轻重的地位，可以抵抗紫外线和病原体对葡萄的损伤，具有抗氧化性，可预防冠心病等[2-3]。类黄酮物质主要包括花色苷、黄酮醇、黄烷-3-醇[4-5]。其中花色苷是主要的呈色物质，以花色素（花青素、甲基花青素、花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素）与葡萄糖结合生成的3-O-葡萄糖苷形式存在[4]。花色苷的酰化可以增加花色苷的稳定性，因此酰化程度高的处理有利于葡萄酒颜色的稳定性。黄酮醇可以通过与花色苷的辅色作用对红葡萄酒的颜色产生影响[6-7]。黄烷-3-醇是葡萄酒中的苦涩味主要来源，这些物质会对葡萄酒的结构和口感产生很大影响，缩合单宁是黄烷-3-醇二聚体或多聚体聚合物，在口腔中单宁与蛋白质或其他聚合体（如多糖）结合引起收敛性，使人产生苦涩的感觉[8]。葡萄果实中类黄酮物质含量主要受气候条件[9-11]、品种特性[12-14]、栽培条件[15-18]和成熟度[13,17-19]等因素的影响。

葡萄的成熟度非常重要，它影响着葡萄的组分，决定了品种的特性。在葡萄成熟过程各品质指标发生相应的变化且不同步[20]。Kennedy等[17]研究表明，可溶性固形物及花色素在转色期开始积累，而单宁的积累发生在转色期前几周，并且从转色期开始逐渐下降，直到成熟后期进入稳定阶段。酿酒葡萄主要以工业成熟度（即糖成熟）为采收标准[21]，但是除了糖酸，其他主要的成分，如酚类物质与香气达到适当水平也很重要[19,22]。葡萄是呼吸非跃变型水果，无法在采后进一步成熟，因此在合适的成熟度采收对于酿酒葡萄果实品质与葡萄酒的质量至关重要[19]。酿酒经验表明，用更成熟的葡萄能够酿制出颜色更稳定、紫色色调更高或更强烈的葡萄酒，这与类黄酮物质密切相关。因此，研究果实成熟度与类黄酮物质之间的关系是非常必要的。本实验通过研究延迟采收对酿酒葡萄梅鹿辄和赤霞珠类中黄酮物质的影响，为确定梅鹿辄和赤霞珠的最佳采收期提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试酿酒葡萄品种梅鹿辄（Vitis vinifera L.cv. Merlot）和赤霞珠（Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon）均于2016年采摘于山西省襄汾县尧京酒庄（35.7°～36.1°N，111.1°～111.7°E），该地年平均气温11.5 ℃，年降雨量550 mm左右，无霜期185 d。梅鹿辄和赤霞珠均定植于2012年，株行距为1 m×3 m，倾斜式独龙蔓树形。

根据果实成熟度监控结果，于果实生理成熟期（可溶性固形物和可滴定酸含量趋于平稳）采第1次样品，之后每隔7 d采1 次样，共采4 次。梅鹿辄分别于9月11日（ML-对照）、9月18日（ML-H1）、9月25日（ML-H2）和10月2日（ML-H3）采样，赤霞珠分别于9月25日（CS-对照）、10月2日（CS-H1）、10月9日（CS-H2）和10月16日（CS-H3）采样，试验地区9～11月的降水与气温如图1所示。每次随机选取10 棵植株，每棵植株分别在阴面与阳面随机采一穗葡萄，共20 穗，每个时期采取3 个重复。样品装在泡沫盒后立即运回实验室，并置于-40 ℃超低温冰箱备用。

图1 2016年9—11月的气温与降水Fig. 1 Precipitation and temperature during September to November of 2016

乙酸乙酯、葡萄糖、氢氧化钠、硫酸钠、硫酸铵、五倍子酸、甲酸、甲醇、乙腈、乙酸（均为分析纯）天津市博迪化工有限公司；福林-酚试剂 北京索莱宝科技有限公司；甲基纤维素、（+）-儿茶素、干没食子酸（均为分析纯），二甲花翠素、原花色素B1、槲皮素（均为色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

PAL-1数显手持式折糖仪 日本ATAGO公司；Mettler ET18型自动点位滴定仪 瑞士Mettler-Toledo公司；PB-10标准型pH计 德国Sartorius公司；FD5系列真空冷冻干燥机 美国Gold Sim公司；AUW220D电子天平、UV-1800型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；KQ-300DE型数控超声器 昆山市超声仪器有限公司；CentriVap离心浓缩仪 美国Labconco公司；5804R型低温冷冻离心机 德国Eppendorf公司；1100、1200系列LC/MSDTrap-VL液相色谱-离子阱质谱联用仪美国Aligent公司。

1.3 方法

1.3.1 果实基本理化指标的测定

可溶性固形物含量：采用数显手持式折糖仪法测定；可滴定酸含量：采用NaOH滴定法测定，结果以酒石酸计；还原糖含量：采用斐林试剂滴定法测定，结果以葡萄糖计；pH值：采用pH计测量法。总酚含量采用福林肖卡比色法测定，结果以没食子酸计（果皮干粉）[23]；单宁含量：采用甲基纤维素法测定，结果以儿茶素计（果皮干粉）[24]；总花色苷含量采用pH示差法测定，结果以二甲花翠素-3-葡萄糖苷计[25]。酚类物质的测定在避光条件下操作。

1.3.2 果实类黄酮物质的提取及测定

样品前处理：取每处理200 粒保存于-40 ℃的果实样品，在冷冻状态下剥皮经液氮速冻后用粉碎机打成末，真空冷冻干燥机-50 ℃条件下真空冷冻24 h以上，使葡萄皮粉充分干燥，之后保存在-80 ℃冰箱备用。

果皮单体花色苷的提取：称取0.500 g葡萄皮干粉于50 mL离心管，加入10 mL提取剂（甲酸-甲醇（98∶2，V/V）），避光超声10 min，之后在摇床中150 r/min振荡提取30 min，取出后8 000 r/min离心5 min，转上清液于50 mL离心管中，重复提取4 次，合并上清液在离心浓缩仪于30 ℃减压旋转蒸发至干，剩余物质用10 mL流动相（A-B，9∶1，V/V）定容，于-80 ℃冰箱保存待测[26]。其中，流动相A相为水-甲酸-乙腈（92∶2∶6，V/V），流动相B相为水-甲酸-乙腈（44∶2∶54，V/V）。

果皮非花色苷酚类物质的提取：称取1.0 g葡萄皮干粉于离心管中，加入1 mL蒸馏水之后加9 mL乙酸乙酯，在摇床中避光振荡提取30 min，转上清液于50 mL离心管中，共提取4 次，合并上清液在离心浓缩仪中于30 ℃蒸干，残渣用色谱甲醇定容至1 mL，于-80 ℃冰箱保存待测[27]。

类黄酮物质采用高效液相色谱-质谱法测定。花色苷物质的检测采用1100系列LC/MSD Trap -VL液相色谱-离子阱质谱联用仪，二极管阵列检测器。每个样品重复进样2 次。花色苷的定性研究根据中国农业大学葡萄酒中心建立的“葡萄与酒花色苷HPLC-UV-MS指纹谱库”进行[28]。花色苷定量：以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷为外标物建立5～500 mg/L之间、9 个梯度、3 个重复的标准曲线，决定系数在0.999以上，以其他花色苷相当于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量计。果皮中花色含量单位为mg/kg（果皮干质量）表示。非花色苷酚类物质的检测采用1200系列LC/MSD Trap-VL高效液相色谱-离子阱质谱联用仪，可变波长检测器。每个样品重复进2 次[27]。非花色苷酚类物质的定性与定量参考Liang Nana等[28]的方法进行，果皮中非花色苷含量单位用mg/kg（果皮干质量）表示。

1.4 数据分析

数据采用Excel 2010统计，SPSS 20.0（IBM,Armonk, NY, USA）进行方差分析（analysis of variance，ANOVA），采用Tukey’s HSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 延迟采收对酿酒葡萄果实基本理化指标的影响

表1 延迟采收对梅鹿辄果实基本理化指标的影响Table 1 Effects of delayed harvest on general composition of Merlot

不同采收期的梅鹿辄和赤霞珠果实基本理化指标见表1、2。随着采收期的延迟，梅鹿辄和赤霞珠的果粒质量和纵径均显着减小；可溶性固形物和还原糖含量均增加，可滴定酸的含量持续下降，H3与对照差异显着。H2和H3时期梅鹿辄总花色苷含量降低，而赤霞珠总花色苷含量随着延迟采收增加。梅鹿辄和赤霞珠单宁的变化情况一致，H2时期的单宁含量均为4 个时期中最低。总酚含量呈先增后降的趋势，梅鹿辄和赤霞珠总酚含量分别于H2和H1时期达到最高。

表2 延迟采收对赤霞珠果实基本理化指标的影响Table 2 Effects of delayed harvest on general composition of Cabernet Sauvignon

2.2 延迟采收对果皮类黄酮物质的影响

2.2.1 延迟采收对果皮花色苷组分的影响

表3 延迟采收对梅鹿辄果实花色苷的影响Table 3 Effects of delayed harvest on anthocyanin contents of Merlot mg/kg

酿酒葡萄的花色苷组分HPLC检测结果见表3、4，延迟采收对葡萄果皮花色苷物质的种类和含量有显着影响。梅鹿辄葡萄果皮花色苷组分的种类随着采收期的推迟而减少，分别检测出19、18、17和15 种花色苷物质。延迟采收的样品中均未检测到顺式-二甲花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷；H3时期花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷、反式-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-(6-O-咖啡酰)-葡萄糖苷均未能检测出。延迟采收后梅鹿辄花色苷组分含量减少，含量对照（16 267.16 mg/kg）＞H2（15 320.81 mg/kg）＞H1（14 878.61 mg/kg）＞H3（9 653.80 mg/kg）。赤霞珠果皮花色苷组分种类随着采收期的推迟呈增加趋势，分别检测出14、14、15、15 种花色苷。H2和H3时期均检测到反式-甲基花翠素-3-O-(6-O-香豆酰)-葡萄糖苷。赤霞珠花色苷组分含量随着采收期的延迟而增加，赤霞珠含量H2（13 237.13 mg/kg）＞H3（13 234.30 mg/kg）＞H1（11 322.20 mg/kg）＞对照（10 823.77 mg/kg）。

表4 延迟采收对赤霞珠果实花色苷的影响Table 4 Effects of delayed harvest on anthocyanin contents of Cabernet Sauvignon mg/kg

随着采收期的延迟，梅鹿辄葡萄果皮中花翠素类和二甲花翠素类花色苷含量越来越少，赤霞珠果皮中含量越来越多。由于花色苷β环上的羟基数目越多，其蓝色色调越深；甲基化数目越多，红色越深。因此，随着采收期的延迟，梅鹿辄葡萄果皮颜色越来越浅，赤霞珠果皮颜色越来越深。在赤霞珠和梅鹿辄葡萄果皮花色苷中，含量最多的为非酰化花色苷，占花色苷总含量的60%左右；其次为乙酰化花色苷，占总含量的21%～32%，香豆酰化花色苷占总含量的7%～16%；只有微量咖啡酰化花色苷。非酰化的基本花色苷是所有花色苷中含量最高的组分，延迟采收后，梅鹿辄非酰化花色苷含量下降，而赤霞珠非酰化花色苷含量随着采收期的延迟呈上升趋势，在H3时期达到最大值8 296.59 mg/kg。酰化花色苷在总花色苷含量中比例的增加有利于提高花色苷的稳定性。梅鹿辄延迟采收后，酰化花色苷含量下降。而赤霞珠乙酰化花色苷含量随采收期的延迟呈先增后减的趋势，其含量H2＞H3＞H1＞对照；H2与H3时期赤霞珠香豆酰化花色苷含量显着增加，H1时期咖啡酰化花色苷含量较高。

从上述分析中可以看出，对于成熟期较早品种梅鹿辄，果实花色苷稳定性随着采收期的延迟降低；而对于晚熟品种赤霞珠，果实花色苷稳定性随着采收期的延迟提高。

2.2.2 延迟采收对果皮非花色苷酚类物质的影响

从表5、6可以看出，延迟采收对葡萄果皮非花色苷酚类物质的种类和含量有一定的影响。不同采收期的梅鹿辄葡萄共检测出21 种非花色苷酚类物质，而赤霞珠葡萄中只检测出19 种。检测出的非花色苷酚类物质主要包括黄烷醇类和黄酮醇类，不同采收期的非花色苷酚类物质总量差异显着。

黄烷醇类：延迟采收各时期梅鹿辄葡萄果皮中均检测出6 种黄烷醇，分别为原花色素B1、原花色素B2、原花色素C1、儿茶素、没食子酸儿茶素和表没食子酸儿茶素。其中，原花色素B1含量最高，占总黄烷醇含量的80%左右。延迟采收不同时期梅鹿辄果皮中黄烷醇含量H1（69.29 mg/kg）＞CK（41.00 mg/kg）＞ H3（51.22 mg/kg）＞H2（35.33 mg/kg）。不同采收期的赤霞珠葡萄果皮中，只检测到4 种黄烷醇，其中未检测到原花色素B2和原花色素C1，含量最高黄烷醇类物质为原花色素B1，占总黄烷醇含量的65%左右。2 个品种的黄烷醇含量占非花色苷酚类物质总量比例均较低，其中梅鹿辄为5%～9%，赤霞珠仅为2.6%～4%。

黄酮醇类：延迟采收不同时期梅鹿辄和赤霞珠葡萄果皮中均检测到15 种黄酮醇，且2 个品种葡萄果皮中黄酮醇含量占非花色苷酚类物质总量的比例很高，达91%以上。不同采收时期黄酮醇含量差异显着，梅鹿辄葡萄果皮黄酮醇含量为H1（732.49 mg/kg）＞对照（720.48 mg/kg）＞H3（688.23 mg/kg）＞H2（668.08 mg/kg)。赤霞珠果皮黄酮醇含量随着采收期的延迟呈增长的趋势，其含量为H3（629.83 mg/kg）＞H2（390.13 mg/kg）＞对照（349.12 mg/kg）＞H1（338.28 mg/kg）。在赤霞珠和梅鹿辄葡萄果皮中，槲皮素类为含量在最高的黄酮醇物质，占黄酮醇总量的49%以上。

表5 延迟采收对梅鹿辄果实非花色苷酚类物质的影响Table 5 Effects of delayed harvest on contents of non-anthocyanins phenolic compounds in Merlot mg/kg

表6 延迟采收对赤霞珠果实非花色苷酚类物质的影响Table 6 Effects of delayed harvest on contents of non-anthocyanins phenolic compounds in Cabernet Sauvignon mg/kg

2.3 主成分分析

对不同采收期的葡萄果实基本理化指标与类黄酮物质进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果见图2。可以看出梅鹿辄PC1解释了总变量的46.86%，PC2解释了总变量的23.97%；赤霞珠PC1解释了总变量的62.10%，PC2解释了总变量的22.35%。

梅鹿辄基本理化指标与酚类物质的主成分结果见图2A、B，可以看出花色苷与黄酮醇类物质主要集中在PC1正端，黄烷醇类物质主要集中在PC2正端。在得分图中，CK位于PC1正端，CK与H3在PC1上差异较大，与H1在PC1上差异较小，PC2能将H2与其他时期很好的区分开。说明随着采收期的延迟，与正常成熟期相比在与PC1相关的花色苷和黄酮醇类物质间差异越大。

对照赤霞珠载荷图（图2C），可以看出在赤霞珠中PC1主要与除二甲花翠素-3-O-(6-O-咖啡酰)-葡萄糖苷、花青素-3-O-(6-O-乙酰)-葡萄糖苷和杨梅酮之外的其他单体酚类物质呈良好的正相关。在得分图中可以看出（图2 CS-b），PC1能将CK与H3很好的区分开，H2与其他时期在PC2上差异较大，说明CK与H3在与PC1相关的物质上差异较大，随着采收期的延迟，与正常采收期果实花色苷的差异越大。

此外，从载荷图中可以看出不同物质间的相互关系，图中距离较近的物质间有较强的正相关关系，而距离较远的物质间则呈较强的负相关。图中可溶性固形物与可滴定酸分别位于PC1两端，可以看出可溶性固形物与可滴定酸呈较强的负相关关系。

图2 不同采收期与果实品质相关物质的PCAFig. 2 PCA of substances related to grape quality at different harvest stages

3 结论与讨论

国内外研究结果表明，葡萄果实延迟采收后的外观特性和生理指标变化显着。例如，葡萄果实失水皱缩，质量减少、有机酸含量明显下降和含糖量增加[29-31]，造成这些变化的原因可能与蒸腾作用和韧皮部的变化有关[32-33]。本实验结果表明，随着采收期的延迟，葡萄果实的粒质量、粒径均降低，葡萄果实中的可滴定酸含量显着降低、还原糖含量显着提升，这些结果与前人研究一致。

本研究中，酿酒葡萄延迟采收后，由于品种差异性和气候条件等因素，类黄酮物质的变化趋势与他人的研究结果略有不同。梅鹿辄延迟采收后花色苷含量变化呈下降趋势，与王宇等[34]研究结果相反，结合气象数据分析，可能与周期内降雨量较大有关；赤霞珠延迟采收后花色苷含量变化呈上升趋势，与温鹏飞等[35]研究结果一致。延迟采收后，梅鹿辄酰化花色苷含量持续降低，赤霞珠酰化花色苷含量在延迟1～2周时，呈上升趋势，而在3 周后呈下降趋势。梅鹿辄延迟1 周黄烷醇与黄酮醇增加，2～3 周后均降低；赤霞珠延迟采收后黄烷醇含量持续增加，而黄酮醇含量先降低后增加。研究结果表明，采收期气温变化对类黄酮物质含量的影响较大，葡萄果实成熟阶段的低温环境会增加花色苷的积累，而高温会降低葡萄表皮中类黄酮物质合成相关基因的表达，增加花色苷的降解[36-39]。结合PCA，延迟采收可以提高赤霞珠类黄酮物质含量，而对于梅鹿辄，延迟采收不利于类黄酮物质的积累。