俞燕芳，石旭平，黄金枝，夏裕辉，彭晓虹，杜贤明，王军文，邓泽元*
（1.江西省蚕桑茶叶研究所，江西 南昌 330202；2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）
桑叶含丰富的营养和功能活性成分，是一种“药食两用”原料。桑叶具有疏风散热、清肺润燥、清肝明目的功效，可用于风热感冒、肺热燥嗽、头晕头痛、目赤昏花等症治疗[1]。此外，桑叶被广泛用于生产茶饮料、面点、饼干等食品。近年来，桑叶菜（桑芽）作为一种“特色蔬菜”逐渐兴起并且受到消费者的青睐，各种桑叶菜式不断出现[2-4]。
酚类和生物碱类化合物是桑叶的重要功能活性成分，其含量变化会影响桑叶的保健品质。生物碱类成分，以1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）为代表，是高效的糖苷酶抑制剂，能显着抑制餐后血糖上升，具有降血糖、减肥、抗炎和抗病毒等作用[5-7]。酚类物质是天然强抗氧化剂，具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤等作用[8-9]。
已有研究表明，不同的桑叶茶加工工艺、提取方法、干燥方式等会影响桑叶中黄酮类化合物和DNJ的含量[10-13]。而蒸、煮、炸等常用的家庭烹饪方式对其营养和活性成分的研究鲜见报道。虽然国内外已有较多文献报道蔬菜加工过程中营养成分的变化，但是由于材料和加工方式不同，不同的实验得到的结果差异较大。为此，本实验研究不同烹饪方式对桑叶酚类化合物和DNJ的影响，以选择适合的加工方法，为桑叶菜和桑叶食品加工提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑叶2017年9月1日采自江西省蚕桑茶叶研究所，品种为农桑14号，采枝条顶部2～3 片幼嫩展开叶。
绿原酸、没食子酸、芦丁、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚、DNJ标准品、芴甲氧羰酰氯（methoxycarbonyl chloride，FMOC-Cl） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；紫云英苷标准品 四川省维克奇生物生物科技有限公司；福林-酚试剂 上海荔达生物科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯）德国默克公司；其他分析纯试剂购自西陇化工股份有限公司。
1.2 仪器与设备
1260高效液相色谱仪、6430液相色谱-高性能三重串联四极杆-质谱联用系统、Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美国安捷伦公司；UV-2600紫外分光光度计 日本岛津公司；LGJ-18A真空冷冻干燥机 北京四环公司；SK3310HP超声清洗器上海科导超声仪器有限公司；P70D20N1P-G5(W0)微波炉广东格兰仕微波生活电器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 桑叶前处理
采集的桑叶用流水冲洗后，沥干水分，去叶柄，切成2 cm×4 cm左右叶片，备用。
1.3.2 桑叶加工
按照常见烹饪方式对桑叶进行处理，以真空冷冻干燥（冻干）鲜叶为对照，研究烹饪后桑叶活性成分变化情况。各处理条件如下：1）冻干：将新鲜桑叶装盘，于-70 ℃冰箱预冻5～6 h后，放入真空冷冻干燥机内干燥。2）蒸：将桑叶铺开置于蒸屉中，从水沸时计时，分别在3 min和10 min后取出，冻干后粉碎。3）微波：桑叶单层铺在微波炉转盘上，分批分别采用高火（700 W）加热3 min、中火（350 W）5 min或低火（70 W）5 min，去除各个条件首次微波的桑叶，快速放入实验桑叶微波，取出摊凉，冻干后粉碎。4）水煮：水煮开，将桑叶（100 g）置于沸水（1 000 mL）中，加热1、1.5、2、2.5 min后取出，沥干水分，冻干后粉碎。5）油炸：大豆油（500 mL）加热至冒烟，加入切好的桑叶（100 g），加热1.5、2、3 min后取出，沥干表面油，冻干后粉碎。
1.3.3 桑叶DNJ含量测定
参照秦樱瑞[11]和范作卿[12]等的方法略作修改。称取干燥桑叶粉0.1 g于10 mL EP管中，加0.05 mol/L盐酸3 mL，涡旋1 min后超声（150 W）处理30 min，10 000 r/ min离心15 min，取上清液。重复以上步骤提取1 次，合并2 次上清液，用0.05 mol/L盐酸定容至10 mL。提取液（或DNJ标准溶液）进行衍生化反应，高效液相色谱法测定DNJ含量。
2.4.3 色谱与质谱条件 （1）色谱条件：色谱柱为Agilent DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样量为1 μL，分流进样（分流比10∶1）；进样口温度为280℃；离子源温度为230℃；传输线温度为250℃；色谱柱程序升温（起始温度50℃，保持3 min；以10℃/min升至220℃，保持20 min）；载气为氦气，载气流速为1.0 mL/min。（2）质谱条件：离子源为电喷雾电离源（ESI）；选择离子扫描（SIM）模式；电子能量为70 eV。
衍生化反应过程：在5.0 mL离心管中加入提取液（或不同质量浓度DNJ标准溶液）100 μL和0.4 mol/L硼酸钾缓冲液（pH 8.5）100 μL，再加入5 mmol/L的FMOC-Cl（溶于乙腈中）200 μL，混匀后25 ℃水浴20 min。加入1 mol/L甘氨酸 100 μL终止反应，再加入1%醋酸100 μL及超纯水400 μL，以0.45 μm微孔滤膜过滤，收集滤液备用。
液相色谱条件：Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%醋酸（1∶1，V/V）溶液；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL；荧光检测器激发波长254 nm，发射波长322 nm。
以峰面积和对应DNJ标准溶液的质量浓度为坐标绘制DNJ标准曲线，得到回归方程为y＝0.149x-5.281（R2＝0.999 9），x为峰面积；y为DNJ质量浓度（μg/mL）。根据标准曲线线性回归方程计算每个样品的DNJ质量浓度。
1.3.4 桑叶酚类化合物含量测定
按照参考文献[14]的方法略加修改提取桑叶酚类物质。称取干燥桑叶粉0.5 g，加入80%甲醇溶液20 mL，超声（300 W）提取45 min，10 000 r/min离心15 min，取上清液。重复以上步骤提取1 次，合并2 次上清液，用80%甲醇溶液定容至50 mL，作为酚类物质提取液待测。
总酚含量测定参照文献[15]的方法略加修改。在25 mL比色管中加待测液（或不同质量浓度没食子酸标准品溶液）1 mL，加入0.1 mol/L福林-酚溶液5 mL，混匀反应5 min后，加入7.5%碳酸钠溶液4 mL，蒸馏水定容，混匀，避光放置30 min，于波长765 nm处测定吸光度。以吸光度和对应没食子酸质量浓度为坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为y＝0.266x-0.013（R2＝0.997 6），x为吸光度，y为没食子酸溶液质量浓度（mg/mL）。根据标准曲线线性回归方程计算每个样品的总酚含量，样品总酚含量以每克干桑叶中没食子酸当量表示。
酚类物质组成分析：提取液进样前用0.45 μm微孔微滤膜过滤。采用6430高性能液相色谱-三重四极杆质谱联用系统对桑叶各酚类成分进行定性分析。
液相色谱条件：Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温25 ℃；进样量10 μL；流动相A为0.2%甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速为0.8 mL/min。梯度洗脱程序：0～20 min，10%～15% B；20～50 min，15%～35% B；50～60 min，35%～50% B；60～7.00 min，50%～100% B；每个程序后运行10 min。质谱条件：电喷雾离子源，负离子模式；干燥气流速11 L/min，干燥气温度300 ℃，毛细管电压4 kV，碰撞能量30 eV，碰撞电压80 V，质量扫描范围m/z 100～1 000。根据质谱提供的离子碎片数据参照相关文献[16-17]对桑叶各酚类成分进行定性分析。采用1260高效液相色谱系统对各个样品所含的酚类化合物进行定量分析，液相色谱条件同上，紫外检测器检测，检测波长为360 nm。根据酚类物质标准品的色谱峰保留时间和峰面积-质量浓度标准曲线计算各个酚类物质含量。所有标准曲线的线性相关系数均大于0.999。
1.4 数据处理
所有实验均重复3 次，用Excel 2007和IBM SPSS Statistics 22.0进行数据统计分析，结果以 ±s表示，多重比较采用Duncan法。
2 结果与分析
2.1 加工方式对桑叶DNJ含量的影响
如图1所示，与冻干桑叶相比，其他所有处理桑叶DNJ含量均显着下降，下降幅度为：油炸＞水煮＞微波＞蒸。油炸1.5 min组的DNJ含量显着高于油炸2.5 min和3.5 min组，油炸2.5 min的DNJ含量为0.44 mg/g，与冻干桑叶DNJ含量（5.90 mg/g）相比，下降了92.5%；在水煮处理组之间，随着水煮时间延长，桑叶中的DNJ含量逐渐降低；不同微波处理之间DNJ含量无显着性差异，在4.23～4.40 mg/g之间；蒸3 min的DNJ含量为5.57 mg/g，接近冻干桑叶，随蒸的时间延长，其含量也降低。总体说明DNJ含量与烹饪介质（水、油）、温度、时间等有很大关系。
图1 加工方式对桑叶DNJ含量的影响Fig. 1 Effects of cooking methods on DNJ content of mulberry leaves
蒸汽（100 ℃）不会破坏DNJ分子的结构使其降解，所以蒸汽处理桑叶DNJ保留较好，少量DNJ可能在蒸的过程中随水分溶出损失。DNJ是一种水溶性生物碱，有研究表明桑叶茶98 ℃浸泡400 s大约95% DNJ能被浸提出[18]，因此桑叶水煮时间不能过长。
温度过高会降低DNJ的稳定性使其含量下降。范作卿等[12]研究表明在桑叶茶加工过程中，微波杀青（1 350 W，150 s）、蒸汽杀青（2 min）、滚筒杀青（255 ℃，30 s）均可增加DNJ含量，在125 ℃加热处理15 min后，桑叶茶中DNJ的含量达到最大值，但250 ℃加热15 min后，DNJ含量的破坏较大，推测短时高温导致桑叶中的DNJ类似物或DNJ糖苷等物质的结构破坏，转化为DNJ，时间延长DNJ可能会被破坏降解。油炸过程中局部温度可达200 ℃以上，DNJ降解显着。
微波也会造成DNJ结构被破坏或发生反应，进而含量降低。刘超等[19]研究发现微波可以明显破坏桑枝提取液DNJ的稳定性，微波处理时间越长，功率越大，DNJ含量下降的速率越快，800 W微波处理1 h可使DNJ损失达65%，这与本实验结果不完全一致，可能是因为本实验处理时间较短，桑叶中一些黏性物质的物理作用或某些成分之间的分子间作用对DNJ可能起到了保护作用，使其稳定性强于提取液。盛琳波等[20]研究表明桑树乳汁在不同温度条件下（常温、4、-18 ℃）保存DNJ含量相对稳定，但其粗提液中的DNJ含量有显着下降。
2.2 加工方式对桑叶总酚含量的影响
由图2可以看出，不同烹饪方式对桑叶总酚含量影响显着，蒸3 min的桑叶总酚含量最高，为29.64 mg/g，比冻干桑叶（27.50 mg/g）提高2.14 mg/g。蒸10 min后桑叶总酚含量与冻干桑叶无显着差异。微波、水煮和油炸后桑叶的总酚显着降低，其中微波低火处理5 min后桑叶的总酚含量最低，只有1.09 mg/g，微波高火3 min和中火5 min桑叶总酚含量分别为19.89 mg/g和10.32 mg/g。油炸桑叶2.5 min和3.5 min总酚含量没有明显差异，低于油炸1.5 min，但整体高于水煮桑叶；随着水煮时间延长，桑叶中的总酚含量呈降低趋势，水煮2.5 min后桑叶总酚含量仅为7.42 mg/g。
图2 烹饪方式对桑叶总酚含量的影响Fig. 2 Effects of cooking methods on total phenolics content of mulberry leaves
研究表明水煮、清炒、微波等加工方式会引起酚类结构改变和含量的降低，蒸制能够保留更多的酚类成分，甚至使酚类物质含量升高[21-28]，这与本实验结果相符。因为烹饪过程对食物组分的影响机制复杂，一方面热处理可以降低酚类氧化酶活性，抑制酚类物质的氧化和聚合，同时高温可以诱导破坏细胞壁，促使食物组织结构分解和活性物质溶解、释放，从而提高其提取效率；另一方面，游离的酚类物质在水中又极易发生转化、聚合、降解等，从而使含量降低。加工温度、湿度和时间是影响活性成分结构和含量的重要因素[29-31]。
Giallourou等[32]发现水煮（90 ℃，2～10 min）后豆瓣菜中的总酚含量显着降低，而微波（1 400 W，1～3 min）和蒸（5～15 min）可以保留大部分酚类物质。王耀红等[29]研究表明微波（700 W，3.5 min）和蒸制（100 ℃，15 min）的马铃薯中的自由态多酚类物质和结合态多酚均高于水煮（100 ℃，15 min）马铃薯。本实验发现蒸制（100 ℃，3～10 min）和微波（700 W，3 min）处理的桑叶总酚含量高于水煮（100 ℃，1～2.5 min）处理，但是微波（70 W，5 min）处理桑叶严重褐变，酚类含量最低。可能是因为桑叶多酚氧化酶的最适反应温度为40 ℃，超过70 ℃酶活急剧下降[33]；蒸制（100 ℃）和微波（700 W）产生的高温能在短时间内使多酚氧化酶快速失活，而低火微波（70 W）加热处理5 min不能完全钝化酶类，但破坏了细胞的结构，反而增加了酶与底物的接触机会进而促进了酶促褐变[34]。
油炸处理反应体系比其他处理更为复杂。油炸过程中食物受热温度显着高于其他处理组，此外，美拉德反应发生也会极大改变食物组成成分和结构，从而导致酚类物质变化[30]。桑叶经过油炸处理后总酚含量低于蒸制处理，但高于水煮处理，这与前人的研究结果一致。Tian Jinhui等[35]发现油炸土豆只能保留少量的植物化学物，而蒸制和微波能保留大部分。Ramirez-Anaya等[36]研究发现土豆、番茄和南瓜在烹饪时以初榨橄榄油作为传热介质（油炸和清炒）其总酚含量显着高于以水为介质（水煮）。因为水煮会使很多物质遇热聚合、水解且随水流失，从而使其含量显着下降[37]，而水溶性物质难以自发迁移至极性介质中。
也有研究[38-39]表明水煮或微波处理后酚类总酚含量增加。不同作者研究的结果不完全一样，即使采用相同的工艺加工不同种类蔬菜，多酚变化结果也不同[26,39]，主要原因是蔬菜种类不同，其各组分含量不同，而且不同酚类单体组分的稳定性不同。
2.3 加工方式对桑叶酚类物质组成的影响
桑叶中主要有绿原酸、芦丁、异槲皮素、紫云英苷、槲皮素-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷（quercetin-3-O-malonyl-β-D-glucoside，QMG）和山柰酚-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷（kaempferol-3-O-malonyl-glucoside，KMG）等酚类物质[13,16]。QMG经过高温处理可能会脱去一个CO2基团生成槲皮素-乙酰基-葡萄糖苷（quercetin-acetylglucoside，QAG）[13,16]。
表1 烹饪方式对桑叶酚类组成和含量的影响Table 1 Effects of cooking methods on the contents of individual phenolic compounds of mulberry leaves μg/100 g
图3 冻干（A）和油炸（B）桑叶样品的酚类物质色谱图Fig. 3 HPLC chromatograms of phenol compounds from freeze-dried(A) and deep-fried (B) mulberry leaves
如图3和表1所示，冻干桑叶绿原酸、芦丁、异槲皮素、QMG、紫云英苷和KMG含量分别为69.24、20.68、6.74、10.39、3.71 μg/100 g和2.44 μg/100 g。
不同烹饪处理后桑叶的主要酚类物质及含量蒸3 min使桑叶绿原酸、异槲皮素、QMG、紫云英苷和KMG含量显着升高（P＜0.05），芦丁和KAG含量保持不变。蒸10 min桑叶芦丁、QMG、KMG和KAG含量显着下降（P＜0.05）。短时蒸汽处理使绿原酸等物质含量上升的原因可能是高温使结合态酚类物质释放出来，随着时间延长，部分物质会发生降解或随水流失。水煮处理组各种酚类物质均显着下降，且随水煮时间延长而损失越多，水煮1.5 min后检测不到QAG。
微波高火3 min处理能使异槲皮素和紫云英苷含量显着升高至10.95 μg/100 g和6.88 μg/100 g，芦丁含量无显着变化，绿原酸、QMG、KMG显着降低，说明桑叶在微波加热过程中部分QMG和KMG降解成了异槲皮素和紫云英苷。微波低火处理5 min所有酚类物质显着下降，样品中已检测不到绿原酸、KMG和KAG等成分。
油炸处理后桑叶酚类物质组成结构发生显着变化，与冻干比较，油炸桑叶样品中未检测到KMG，而检测出KAG、槲皮素和山柰酚。油炸1.5 min桑叶KAG、槲皮素和山柰酚含量分别为1.29、2.00 μg/100 g和0.78 μg/100 g。3 个油炸处理组之间KAG随油炸时间延长而含量降低，槲皮素和山柰酚含量在油炸2.5 min时降低，3.5 min时又有所升高。推测在油炸处理时KMG极不稳定，易降解成KAG，而QAG和KAG很快又会降解成槲皮素和山柰酚苷元。
3 结 论
不同烹饪方式对桑叶活性成分含量影响显着，各种烹饪方式都导致DNJ含量降低，DNJ含量从高到低为蒸＞微波＞水煮＞油炸。蒸3 min使桑叶总酚含量增加，其他烹饪处理后总酚含量降低，低火微波5 min桑叶酚类物质含量最低。水煮和油炸时间越长，桑叶DNJ和总酚含量越低。高效液相色谱-质谱分析结果显示不同烹饪方式处理后桑叶的酚类物质组成有显着性差异，其中油炸处理对其成分影响最为显着，油炸会使桑叶中的槲皮素和山柰酚糖苷降解为相应的苷元。而且油炸桑叶皱缩苦涩，口感不佳，漂烫和蒸制处理的桑叶能较好保证桑叶原有的色、香、味。综上所述，蒸制是保留桑叶活性成分较好的方法，而水煮、微波和油炸等处理方式要尽量控制短时间。不同烹饪处理对桑叶中维生素、蛋白、糖等营养成分的影响还有待于进一步研究。
