冯 杰，冯 娜，刘艳芳，唐庆九，周 帅，刘 方，张劲松，杨 焱
（农业部南方食用菌资源利用重点实验室，国家食用菌工程技术研究中心，上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403）
竹荪又名竹笙、竹参，在真菌分类学上隶属于真菌界（Eumycotina）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、腹菌纲（Gasteromycetes）、鬼笔目（Phallales）、鬼笔科（Phallaceae）、竹荪属（Dictyophora）[1-2]。竹荪具有一定的防腐作用，具有较高的营养保健价值，被人们誉为“真菌皇后”，是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。竹荪子实体中富含蛋白质、氨基酸、多糖、维生、微量元等，具有抗肿瘤、抗菌、抗血栓、降血脂、增强人体免疫力等生物活性。
竹荪多糖是竹荪中的主要生物活性成分之一，目前关于竹荪多糖结构的研究，多数还都只是停留在竹荪多糖组成上，对其分子结构及构象的研究报道较少，有研究者做过竹荪多糖链的一级结构研究[3]。赵凯等[4]研究了竹荪多糖提取物，得到的竹荪多糖化学结构主要是β-甘露糖；而连宾等[5]从竹荪中提取的多糖化学结构为半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖杂多糖。王家堂等[6]所用的方法则与上述有所不同，其采用衍生化后通过气相分析、红外图分析和核磁共振分析方法证明出：竹荪多糖以葡萄糖为主，并同时含有半乳糖和甘露糖，为均一的多糖组分，分子构型为β型，且竹荪多糖也是以β-(1,3)-D-葡聚糖为主链，带有(1,6)葡萄糖支链的化学结构。
竹荪子实体人工栽培周期长且容易污染杂菌，受病虫害侵蚀，耗费人力多、场地大，栽培环境受海拔与温度影响十分明显，生产规模受到一定限制[7-8]。 而深层发酵技术是较为先进的技术，其特点是发酵周期短、劳动生产率高、劳动强度低、占地面积少等[9]。采用深层发酵技术直接生产竹荪营养菌丝体，可以克服上述不足，不仅可将获得的菌丝体作为液体菌种或食品添加剂，还可从中提取生理活性物质，这为竹荪生产及深加工开创了新路[10-11]。
目前国内外关于深层发酵竹荪菌丝体及发酵液多糖的研究报道较少，较多为对其抗氧化性能与抗菌性的检测，或是对其氨基酸含量的分析与自由基清除能力的检验[12-13]。国内外也有少量研究者对竹荪的深层发酵进行研究，但其主要侧重点是如何获取更高的生物量[14-15]。只有少部分研究者关注竹荪的功效成分多糖，但往往都仅局限于小试的摇瓶实验，属于基础研究阶段，并且其生物量和活性产物多糖得率比较低，生产成本高，其工艺需进一步提升，若要达到规模化和产业化的生产竹荪多糖还需进行大量的研究[16-17]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
供试菌株Dictyophora indusiata ZS03，由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心上海食用菌分中心提供。
1.1.2 培养基
斜面和平板培养基（马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基）购自美国BD公司，按照39 g溶于1 000 mL蒸馏水的比例配制，121 ℃灭菌20 min 后备用。
种子培养基：葡萄糖30 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸氢钾2 g/L，硫酸镁2 g/L，121 ℃条件下灭菌30 min后备用。
发酵基础培养基：葡萄糖30 g/L，酵母粉1.5 g/L，磷酸氢钾2 g/L，硫酸镁2 g/L，121 ℃条件下灭菌30 min后备用。
1.2 仪器与设备
ZWY-2102双层恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；BIOTECH-5BGZ-50JS 5 L和50 L发 酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；Synergy HT多功能酶标仪 美国BioTek公司。
1.3 方法
1.3.1 培养条件
菌株活化：将配制好的平板培养基于121 ℃条件下灭菌20 min后倒入9 cm平板冷却备用。在无菌条件下挑取冷冻管保藏菌种于平板培养基中，在26 ℃恒温箱中培养，待菌丝长满平板后备用。
种子液培养：将平板活化后的菌株取3 块约0.2 cm2大小的菌块接种于装有100 mL液体种子培养基的250 mL三瓶中，在摇床上于26 ℃、150 r/min培养7 d得种子液。
发酵罐培养：将制备好的液体菌种分别转接至5、30 L和50 L发酵罐中进行培养，发酵罐装液量为总体积的70%，接种量10%（V/V），搅拌转速100 r/min，培养温度26 ℃，通气比1.0 L/（Lg min），培养至144 h 结束发酵。
1.3.2 指标测定
菌丝体干质量的测定：取发酵液50 mL，15 000h g离心20 min后弃上清液，沉淀的菌丝体用去离子水洗涤 3 次，收集菌丝体后放在60 ℃的烘箱中烘干至质量恒定，精确称质量[18]，以g/L计。每组实验设定3 个平行，测定平均值。
总糖的测定：将烘干后的竹荪菌丝体研磨成粉末，称取100 mg加入100 mL蒸馏水，沸水浴提取3 h。冷却后定容至100 mL，将溶液15 000h g离心15 min后取上清液备用[10]。取稀释一定倍数的上清液品1 mL到试管中（设3 个重复），加入5%苯酚（重蒸苯酚）0.5 mL，混匀，再加入2.5 mL浓硫酸，振荡，沸水浴中加热15 min后在冷水下迅速冷却，用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度，根据标准曲线计出总糖含量[11]，总糖含量以占干菌丝质量分数计（%）。
还原糖的测定：将总糖测定时制备的上清液稀释一定倍数，取稀释后的品液2 mL到试管中（设3 个重复），加入3 mL 3,5-硝基水杨酸试剂，混匀，沸水浴中加热5 min，流动水冷却后用蒸馏水定容至25 mL，摇匀后用酶标仪在520 nm波长处检测吸光度，根据标准曲线计出还原糖含量[20]，还原糖含量以占干菌丝质量分数计（%）。
1.3.3 工艺优化
1.3.3.1 竹荪多糖发酵培养基中碳源和氮源种类的筛选
碳源的筛选：在供试基础液体培养基中分别添加 30 g/L葡萄糖、30 g/L蔗糖和30 g/L麦芽糖为碳源。基础培养基选用酵母粉1.5 g/L、磷酸氢钾2 g/L、硫酸镁2 g/L，研究不同碳源对竹荪胞内多糖发酵的影响。各实验设3 个重复。
氮源的筛选：在供试基础液体培养基中分别添加1.5 g/L酵母粉、1.5 g/L玉米粉和1.5 g/L黄豆粉为氮源。基础培养基选用葡萄糖30 g/L、磷酸氢钾2 g/L、硫酸镁2 g/L，研究不同氮源对竹荪胞内多糖发酵的影响。各实验设3 个重复。
根据上述培养基中碳源和氮源种类筛选结果，选择最佳碳源中的葡萄糖和氮源中的酵母粉用量2 个因，分别考察每种因在4 个水平下的竹荪胞内多糖得率，因与水平设计如表1所示。
表 1 竹荪多糖培养基中碳源和氮源单因素筛选Table 1 Levels of carbon and nitrogen sources used in one-factor-at-a-time design
1.3.3.3 Box-Behnken法优化竹荪多糖发酵培养基设计
表 2 Box-Behnken法优化竹荪多糖发酵培养基的因素与水平Table 2 Codes and levels of independent variables used in Box-Behnken design
1.4 数据与图像处理
数据采用Excel 2013软件进行处理，应用Origin 8.5软件进行绘图，应用DPS v7.05软件进行显着性分析，利用Design Expert V8.0.6软件对数据进行回归分析。
2 结果与分析
2.1 竹荪多糖发酵培养基中碳源和氮源种类的筛选
图 1 发酵培养基中碳源和氮源种类对竹荪菌丝体和胞内多糖发酵的影响Fig. 1 Effects of carbon and nitrogen sources on mycelial biomass and polysaccharide production by D. indusiata
由图1可以看出，碳源种类对竹荪菌丝体液态深层发酵菌丝体和胞内多糖得率有明显影响，其影响由高到低依次为葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，差异极显 着（P＜0.01）。实验结果表明葡萄糖是最适合菌丝体生长产生胞内多糖的碳源。在不同种类的氮源实验中，竹荪菌丝体干质量由高到低的氮源依次为酵母粉、黄豆粉和玉米粉（P＜0.01），竹荪胞内多糖得率由高到低的氮源依次为酵母粉、玉米粉和黄豆粉（P＜0.01）。实验结果表明酵母粉是最适合菌丝体生长产生胞内多糖的氮源。
2.2 竹荪多糖发酵培养基中碳源和氮源用量的单因优化
图 2 发酵培养基中葡萄糖（A）和酵母粉（B）用量对竹荪菌丝体和 胞内多糖发酵的影响Fig. 2 Effects of glucose (A) and yeast power (B) concentration on mycelial biomass and polysaccharide of D. indusiata
如图2A所示，葡萄糖用量由15 g/L增加到60 g/L时，竹荪菌丝体干质量和胞内多糖得率有大幅度提升。葡萄糖用量为30 g/L时，竹荪菌丝体干质量和胞内多糖得率最高，分别为9.72 g/L和0.89 g/L，葡萄糖用量继续增加时，其菌丝体干质量和胞内多糖得率反而有小幅度减少。分析原因可能是过高的葡萄糖用量会抑制竹荪菌丝体的生长，进而影响胞内多糖的合成，因，合适的葡萄糖用量对竹荪胞内多糖的合成影响较大。从单因试验结果可知，30 g/L是竹荪菌丝体液体发酵胞内多糖最佳葡萄糖用量。
如图2B所示，当酵母粉用量为4.5 g/L时，竹荪菌丝体干质量和胞内多糖得率最高，分别为9.95 g/L和 0.88 g/L。当酵母粉用量增加至6.0 g/L时，其多糖得率开始降低。这可能是由于高用量的酵母粉对菌丝体的生长产生了抑制作用。根据单因试验结果，4.5 g/L是竹荪菌丝体液态深层发酵胞内多糖最佳酵母粉用量。
2.3 Box-Behnken法优化竹荪多糖的发酵培养基组成
2.3.1 模型建立和显着性检验
表 3 Box-Behnken法优化竹荪多糖的发酵培养基组成Table 3 Box-Behnken design with experimental results
利用Design Expert V8.0.6软件对数据进行次多元回归拟合，得到竹荪菌丝体液态深层发酵胞内多糖得率（Y）对编码自变量之间的次多项回归方程为：
方差分析检验多项式方程对试验数据拟合的显着性，如表4所示。次方程模型的F值为12.59，表明该模型显着，可以有效拟合试验数据，该模型F值由于噪音因影响发生的P值小于0.01。从表4可以看出，X1、X3、X4、X1X4、X3X4、X12、X22、X32和X42是显着项。整个模型的拟合度R2为0.926 4，表明该次方程模型可以解释和预测92.64%的变量响应，在本研究中可以很好地拟合试验数据。
表 4 Box-Behnken法优化竹荪多糖的发酵培养基组成方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model
2.3.2 验证实验
2.3.2.1 摇瓶验证实验
表 5 Box-Behnken法优化竹荪多糖的发酵培养基组成摇瓶 实验验证结果Table 5 Results of confirmation using shake flask experiments
2.3.2.2 发酵罐验证实验
为更好地将上述响应面的优化结果应用于实际生产，对响应面模型得出的最佳条件结合发酵罐的最佳控制条件（本研究团队前期研究基础）分别在5、30 L和50 L规模发酵罐中进行逐步扩大实验。由图3A可知，在5 L发酵罐上，竹荪菌丝体在0～48 h增加较少，之后进入对数期，大幅度增加，在第144小时达到最大值16.11 g/L；胞内多糖在稳定期合成较少，进入对数期后稳定增多，在第144小时达到最大值1.43 g/L。由图3B可知，在30 L发酵罐上，竹荪菌丝体在0～24 h增加较少，之后进入对数期，大幅度增加，在第144小时达到最大值12.10 g/L；胞内多糖在稳定期合成较少，进入对数期后稳定增多，在第144小时达到最大值1.28 g/L。由图3C可知，在50 L发酵罐上，竹荪菌丝体在0～24 h增加较少，之后进入对数期，大幅度增加，在第144小时达到最大值13.69 g/L；胞内多糖在稳定期合成较少，进入对数期后稳定增多，在第144小时达到最大值1.26 g/L。综合图3分析可知，在不同发酵规模下，竹荪菌丝体的生长较为一致，随着菌丝体生长进入对数期后，胞内多糖的合成也进入快速增长阶段，当菌丝体生长进入稳定期后，胞内多糖的合成也基本达到最大值。在发酵罐控制条件一致时，不同发酵规模下的竹荪菌丝体生长基本一致，胞内多糖的含量也很稳定，因，本研究获得的发酵条件可以考虑进一步继续放大以应用于工业化生产。
图 3 在5 L（A）、30 L（B）和50 L（C）发酵罐中优化培养基条件下竹荪多糖发酵过程曲线Fig. 3 Time-course curves of mycelial biomass and polysaccharide production by D. indusiata using the optimized medium in 5 L (A), 30 L (B) and 50 L (C) fermentors
2.4 不同发酵规模下竹荪多糖的发酵参数比较
为更好地比较不同发酵规模下竹荪胞内多糖的发酵结果，将实验数据进一步整理，得到5、30 L和50 L发酵罐条件下竹荪菌丝体液态深层发酵过程参数，如表6所示。结合Box-Behnken法优化结果，竹荪菌丝体液态深层发酵过程参数比对照组有显着提高。5、30 L和50 L发酵罐验证实验中的菌丝体干质量、菌丝体对葡萄糖得率、胞内多糖得率、胞内多糖质量分数、胞内多糖生产强度和胞内多糖对葡萄糖得率均优于对照组结果，且在不同规模下的发酵结果也很稳定，没有较大的波动，可见优化后的培养条件有助于提高竹荪菌丝体中的胞内多糖，且随着发酵规模的逐步扩大结果也很稳定。
表 6 在不同规模发酵罐中优化培养基条件下竹荪多糖发酵参数比较Table 6 Comparison of fermentation parameters for production of D. indusiata polysaccharides using the optimized medium in 5-, 30- and 50-L fermentors
