射流空化对大豆分离蛋白的理化性质及结构的影响

白 银，高 悦，王中江，江中洋，孟凡迪，江连洲,*

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江省政务大数据中心，黑龙江 哈尔滨 150028）

大豆分离蛋白是一种产量大、价格低廉的植物蛋白资源，不仅具有良好的营养价值和保健作用，还具有出色的功能性质，包括凝胶性、黏弹性、乳化性、起泡性等[1]，在食品工业中作为食品添加剂被广泛应用。然而未经改性的大豆蛋白理化性质受到限制，不能满足特定食品加工的要求，因此，改善大豆分离蛋白功能性质、提高其在工业上的利用率成为亟待解决的问题。大豆分离蛋白改性方法可分为物理改性、化学改性、酶法改性和基因工程改性。其中物理改性主要通过改变蛋白质的高级结构以及分子间聚集方式达到蛋白改性的目的，因其具有成本低、无毒害、操作简单等优点受到研究人员广泛关注。针对大豆蛋白结构改造、提高理化性质的物理改性方法很多，目前国内外有学者将高压微射流、高压均质、液氮冷冻等技术应用到大豆蛋白改性中，使大豆蛋白部分理化性质得到改善[2-5]。

水力空化技术是一种新兴技术，它有着与超声空化相似的空化效应，是目前国内外学者的研究热点。与超声空化相比，水力空化结合了高温高压、瞬时微射流以及强烈的冲击波，为多物理场结合的处理方法[6]。形成水力空化的方法主要有涡流和射流，其中射流空化是一种物理现象，当液体进入空化反应器中后，空气会对液体施加一种低于该液体饱和蒸气压以下的压力，使得气核快速增长产生空化起泡，此时混在流体里的空化气泡要经历初生、发育、长大、收缩和溃灭这一过程。而空化气泡在破裂的瞬间，微射流产生的温度可以达到5 000 K[7]，压力可以达到140～170 MPa，其强烈的冲击波时速可达400 km/h[8]。射流空化因其设备操作简单、性能稳定、能耗低、易于实现工业化等特点，近年来逐渐得到各界学者的广泛关注。管金发等[7]研究射流空化破乳效果，发现其既可以促进小液滴聚集促使乳化油废水破乳，又可使废水中较大液滴破碎分散并且进一步乳化。孙焕焕等[9]发现射流空化能够有效地强化糖液澄清脱色，使糖液的色值下降率达到最大值2.056%。古颖龙等[10]探究发现空化作用可以形成强烈的冲击波和高速的微射流，作用于液体可以实现一般条件下难以实现的物理和化学反应。任仙娥等[6]研究基于涡流的水力空化对大豆分离蛋白功能性质的影响，发现大豆分离蛋白的溶解度随着水力空化处理时间的延长而增加，并且经过处理后液体的起泡性由14%显着增加到310%。Yang Feng等[11]利用旋转空化对大豆分离蛋白进行改性，发现旋转空化处理可以改善大豆分离蛋白的乳化性能、改变二硫键和巯基含量，同时二级结构也会受到旋转空化的影响。本实验以大豆分离蛋白为原材料，通过射流空化处理对大豆分离蛋白进行物理改性，并探究射流空化时间对其理化性质和功能结构的影响，以期为射流空化在大豆蛋白工业改性方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食品级大豆分离蛋白（纯度99%） 山东禹王有限公司。

十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）天津市光复精细化工研究所；Lowry蛋白试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美国Sigma公司。所用试剂最低纯度为分析纯。

1.2 仪器与设备

FD 5-3型冷冻干燥机 美国SIM公司；电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；高速离心机德国Eppendorf公司；1600PC紫外-可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司；XW-80A漩涡混合器 上海青浦沪西仪器厂；F-4500型荧光分光光度计 日本日立公司；MAGNA-IR560傅里叶变换红外光谱系统 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将大豆分离蛋白以质量分数2%和5%（下同）溶解于磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L、pH 7.0）中，充分搅拌后将样品溶液用射流空化机在20 ℃、0.01 MPa条件下处理不同时间（2、4、6、8、10 min），得到样品溶液，冷冻干燥后磨粉备用。

1.3.2 傅里叶变换红外光谱测定

傅里叶变换红外光谱测定参考齐宝坤等[12]的方法，精确称取1 g样品，与100 g溴化钾用研钵混合后压片测定，扫描范围为400～4 000 cm－1，所得数据用peak fit软件分析。

1.3.3 荧光光谱测定

参照孙英杰[13]的方法将样品用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液溶解至0.05 mg/mL，并在10 000×g下离心30 min，测定上清液的荧光强度。荧光光谱激发波长为290 nm，扫描发射光谱范围为300～400 nm，扫描速率为60 nm/s，激发和发射狭缝宽度均为5 nm。

1.3.4 溶解度的测定

参考Molina等[14]的测定方法，用磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L、pH 7.0）配制2 mg/mL的蛋白质溶液，搅拌1 h使样品溶解，在室温条件下20 000 r/min离心15 min，采用Lowry法[15]测定蛋白质含量。蛋白质溶解度为上清液中蛋白的含量比样品中总的蛋白含量。

1.3.5 浊度的测定

采用Beveridge等[16]的方法测定，将冻干粉末样品用蒸馏水溶解至蛋白质量浓度为2 mg/mL，用紫外-可见分光光度计在600 nm波长处测定其吸光度，以不加蛋白的空白溶液为对照。

1.3.6 表面疏水性的测定

参考Kato等[17]采用的ANS荧光探针法进行测定。用0.01 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液溶解样品使其质量浓度为2 mg/mL，在室温下搅拌1 h后将其在10 000×g下离心30 min获取上清液。用磷酸盐缓冲液将上清液梯度稀释至0.005～0.5 mg/mL之间，取40 μL 8 mmol/L的ANS溶液加入到4 mL不同质量浓度的蛋白样品中，振荡混匀，静置3 min后测其荧光强度。激发波长370 nm，发射波长490 nm，夹缝宽度为1 nm。以荧光强度对蛋白质量浓度作图，以初始段斜率表示蛋白质分子的表面疏水性。

1.3.7 乳化活性及乳化稳定性的测定

乳化活性及乳化稳定性的测定根据汪菁琴[18]的方法稍加改动，用磷酸盐缓冲液将蛋白样品溶解至质量浓度为2 mg/mL，取9 mL样品溶液加入3 mL油，在室温下用均质机在10 000 r/min条件下均质1 min。快速取出50 μL样品，用0.1 g/100 mL的SDS溶液稀释250 倍，漩涡振荡后用分光光度计在500 nm波长处测定其吸光度A。30 min后再次测定其吸光度A0。用0.1 g/100 mL的SDS溶液作为空白对照。按式（1）、（2）分别计算乳化活性及乳化稳定性。

式中：A为样品溶液吸光度；ρ为乳化液形成之前的溶液中蛋白质量浓度/（g/mL）；φ为油占乳化液的体积分数/%；N为样品稀释倍数。

式中：A0为30 min后样品溶液的吸光度。

1.3.8 持水性的测定

持水性的测定参考Javier等[19]的方法，准确称取蛋白样品0.2 g于离心管中并记录此时样品和离心管的总质量m1/g，向离心管中加入4 mL去离子水并漩涡振荡，之后静置30 min，然后在室温条件下2 500 r/min离心20 min，去除上清液，称量此时离心管及剩余样品总质量m2/g。按公式（3）计算持水性。

1.3.9 持油性的测定

持油性的测定参考Javier等[19]的方法，准确称取蛋白样品0.2 g于离心管中并记录此时样品和离心管的总质量m3/g，向离心管中加入4 mL大豆油，漩涡振荡后静置30 min，然后在室温条件下2 500 r/min离心20 min，去除上层油，称量此时离心管及剩余样品总质量m4/g。按公式（4）计算持油性。

1.4 数据统计与分析

每个实验重复3 次，采用Origin 8.5软件作图。采用SPSS V17.0软件中方差分析法进行差异显着性分析，P＜0.05为显着性差异。

2 结果与分析

2.1 射流空化处理后大豆分离蛋白的傅里叶变换红外光谱分析结果

傅里叶变换光谱是研究蛋白质二级结构的重要手段，该方法主要能够提供蛋白质分子中酰胺I带的振动波段信息，再用二阶导数红外去卷积光谱拟合对二级结构进行定量分析[20]。不同射流空化处理时间2%、5%大豆分离蛋白的傅里叶变换红外光谱分别见图1、2。

图1 不同处理时间2%大豆分离蛋白傅里叶变换红外光谱图Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of 2% SPI at different treatment times

图2 不同处理时间5%大豆分离蛋白傅里叶变换红外光谱图Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of 5% SPI at different treatment time

表1 射流空化对2 大豆分离蛋白二级结构的影响Table 1 Effect of jet cavitation on the secondary structure of 2 SPI

如表1、2所示，大豆分离蛋白的二级结构主要以β-折叠为主，这与已有研究结果[21-22]相符。射流空化处理后大豆分离蛋白的二级结构发生改变，α-螺旋结构相对含量升高，证明射流空化破坏了蛋白质分子的有序结构，呈现出无序结构的结合[23]。而β-折叠和β-转角相对含量降低，无规卷曲相对含量升高，说明大豆分离蛋白分子的刚性结构减弱，柔性结构增强，分子由有序结构变为无序[24]。射流空化处理4 min内大豆分离蛋白的二级结构变化较为明显，α-螺旋和无规卷曲含量升高最多，说明此时射流空化处理对蛋白质的二级结构影响最大。经射流空化处理后β-折叠结构含量降低，说明在处理过程中β-折叠结构逐渐转变为α-螺旋结构及无规卷曲结构，而β-折叠结构位于蛋白质内部，其含量降低表明蛋白质疏水位点暴露，因此蛋白质表面疏水性增加[25]。而在不同蛋白质量分数下，各结构变化趋势基本相同，说明改变蛋白质量分数不会进一步影响其二级结构。

表2 射流空化对5%大豆分离蛋白二级结构的影响Table 2 Effect of jet cavitation on the secondary structure of 5 SPI

2.2 射流空化大豆分离蛋白的荧光光谱分析结果

激发波长为290 nm时，色氨酸残基可在300～400 nm的发射图谱内产生荧光，色氨酸的荧光峰位表示其在蛋白质中的位置[26]，因此可以表征蛋白质三级结构的变化。

图3 射流空化对2%的大豆分离蛋白荧光强度的影响Fig. 3 Effect of jet cavitation on the fl uorescence intensity of 2% SPI

图4 射流空化对5%的大豆分离蛋白荧光强度的影响Fig. 4 Effect of jet cavitation on the fl uorescence intensity of 5% SPI

从图3、4可知，两种质量分数大豆分离蛋白的最大吸收峰位均从335 nm波长处红移至340 nm波长处。荧光峰位的红移说明在空化作用下，蛋白质分子结构逐渐展开，空间构象发生变化，色氨酸残基暴露于蛋白质表面，也就是荧光发射基团的微环境极性增加，肽链更加伸展[27]。经过射流空化处理的蛋白样品荧光强度发生明显上升，其中2%蛋白样品的荧光强度随处理时间的延长呈逐渐上升趋势，5%的蛋白样品的荧光强度随处理时间的延长呈先增加后降低的趋势，这与表面疏水性的测定结果一致，这说明一定程度的射流空化会导致大豆分离蛋白内部的疏水基团的暴露。

2.3 射流空化处理对大豆分离蛋白溶解性的影响

蛋白质的溶解性是其他功能性质的先决条件，蛋白质和水分子通过肽键或者其氨基酸侧链相互作用[28]。

图5 射流空化对大豆分离蛋白样品溶解度的影响Fig. 5 Effect of jet cavitation on the solubility of SPI

由图5可以看出，射流空化处理能够显着提升大豆分离蛋白的溶解性。射流空化处理两种质量分数的蛋白样品时溶解度均有所上升，这可能是由于射流空化中产生的压力和高速微射流作用于大豆蛋白聚集体，进而解聚分散成颗粒较小的分子，并暴露更多的疏水基团和亲水性基团等，增加分子的表面电荷，提高了蛋白质的水合作用，从而使大豆分离蛋白的溶解度增加[29]。而质量分数为2%的样品溶解度在处理4 min时最大，达到96.15%，在此之后呈现降低的趋势。这可能是因为射流空化处理大豆分离蛋白时存在的过处理现象，当样品中蛋白质量分数较低时，溶液中颗粒比较分散，而过度的空化效应提高了蛋白质分子间的静电作用力以及疏水相互作用，这些作用力使过度展开的蛋白质分子聚集形成不溶性聚集体，导致溶解度又略有下降[10]。

2.4 射流空化处理对大豆分离蛋白浊度的影响

浊度表示溶液的透明程度，是溶剂中存在的悬浮物对光线透过时产生的阻碍程度[13]，浊度可以直观反映出溶液中颗粒的分散情况。

由图6可以看出，经射流空化后两种质量分数的蛋白溶液浊度均有所下降，这是由于空化效应可以使溶液中聚集体尺寸降低[30]。且质量分数为5%时浊度下降幅度较大，呈持续下降趋势，这是因为未经射流空化处理时样品质量分数较高，含有较多的聚集体，但经射流空化处理后蛋白分子结构展开，增加了蛋白分散程度，降低了溶液的浊度，并且射流空化时间越长，溶液的浊度越低。但样品质量分数为2%时蛋白溶液的浊度变化不明显，总体呈先降低后增加的趋势。这表明射流空化对高质量分数的蛋白溶液的浊度降低更加明显，这可能是由于射流空化的过处理效应导致过度展开的蛋白质分子发生聚集。

图6 射流空化对大豆分离蛋白浊度的影响Fig. 6 Effect of jet cavitation on the turbidity of SPI

2.5 射流空化处理对大豆分离蛋白表面疏水性的影响

表面疏水性是维持蛋白质结构的主要作用力，对蛋白质分子间的相互作用具有很大影响，是衡量蛋白质理化性质的重要指标之一[31]。

图7 射流空化对大豆分离蛋白表面疏水性的影响Fig. 7 Effect of jet cavitation on the surface hydrophobicity of SPI

从图7可以看出，与未经射流空化处理的蛋白样品相比，两种质量分数蛋白样品的表面疏水性均有不同程度的增加。其中质量分数2%的大豆分离蛋白表面疏水性总体呈上升趋势，说明射流空化中的空化现象会使蛋白质分子扩散和展开，使其疏水区域暴露在分子表面[32]。在处理8 min和10 min时表面疏水性最高分别达到20 080和19 820，这可能是因为随射流空化处理时间延长，蛋白质分子的解折叠效果远大于亚基的解聚，因此此时大豆蛋白的表面疏水性显着增加。而质量分数5%的大豆分离蛋白的表面疏水性呈现先增加后保持平稳的趋势，这可能是因为大豆分离蛋白溶液质量分数的增加，射流空化使蛋白质分子的疏水基团暴露，表面疏水性增加。然而随着处理时间延长，射流空化作用达到饱和，使蛋白质分子的表面疏水性没有明显变化。

2.6 射流空化处理对大豆分离蛋白乳化活性及乳化稳定性的影响

蛋白质的乳化性能可以通过乳化活性和乳化稳定性来表征，乳化活性表示蛋白质在水-油混合过程中吸附在油滴界面降低其界面张力，起到乳化作用的性质，它主要是由蛋白质分子链内部分布的亲水或疏水基团所决定的[18]。

图8 射流空化对大豆分离蛋白乳化活性的影响Fig. 8 Effect of jet cavitation on the emulsifying activity of SPI

从图8可以看出，质量分数2%蛋白样品的乳化活性随射流空化处理时间延长而显着升高，这是因为射流空化处理后样品中的蛋白质分子伸展，分子内部基团暴露，使得在乳化过程中有更多的小分子聚集在油-水界面上，因此使得样品的乳化活性有显着提高[18]。质量分数5%的蛋白样品乳化活性呈先降低后增加的趋势，这可能是因为蛋白质量分数增加，在短时间内分子间的亚基会发生聚集，产生分子间作用力，导致乳化活性降低，而随着射流空化处理时间延长，蛋白质分子趋于无序，刚性结构减少，柔性结构增加，使得乳化活性又逐渐增加。

图9 射流空化处理对大豆分离蛋白乳化稳定性的影响Fig. 9 Effect of jet cavitation on the emulsion stability of SPI

由图9可以看出，两种质量分数的大豆分离蛋白经射流空化处理后乳化稳定性均明显增加，这可能是因为随着射流空化时间的延长，蛋白质分子中的疏水性基团逐渐暴露出来，增加了蛋白分子与油滴的吸引作用，使蛋白质分子的体积减小，从而增加了蛋白溶液的乳化稳定性[14]。2%的大豆分离蛋白样品乳化稳定性呈先增加后降低的趋势，这可能是因为在样品质量分数较小时存在射流空化的过处理现象，过度的空化效应导致了蛋白分子发生聚集，聚集后构象稳定性增强，不易快速在油-水界面上稳定，导致乳化稳定性降低[33]。

2.7 射流空化处理对大豆分离蛋白持水性的影响

蛋白质的持水性指蛋白质吸收水并将水保留在蛋白质组织中的能力。从图10中可以看出，两种质量分数蛋白样品经射流空化处理后持水性均有所下降。随着射流空化时间的延长，质量分数2%的大豆分离蛋白的持水性呈总体下降趋势，这是因为长时间的射流空化处理使蛋白质分子展开，暴露了其中的疏水性基团，使持水性下降[33]。而质量分数5%的大豆分离蛋白经射流空化处理后，持水性略有下降，且不同处理时间的样品持水性变化不明显，这可能是因为随着处理时间延长，射流空化作用达到饱和，疏水基团不再暴露，各样品的持水性基本持平，这与表面疏水性测定结果一致。

图10 射流空化对大豆分离蛋白持水性的影响Fig. 10 Effect of jet cavitation on the water-holding capacity of SPI

2.8 射流空化处理对大豆分离蛋白持油性的影响

图11 射流空化处理对大豆分离蛋白持油性的影响Fig. 11 Effect of jet cavitation on the oil-holding capacity of SPI

持油性反映了蛋白质吸附油的能力，从图11中可以看出，经射流空化处理后的蛋白样品持油性均有较明显的增加，其中质量分数2%的蛋白样品增加幅度较大，这是因为经射流空化处理后，蛋白质分子结构打开，使分子中的疏水性基团暴露，油中存在的疏水脂肪酸链就会结合到疏水基团上[14]，因此提高了分子的持油能力。而质量分数5%的蛋白样品持油性随射流空化时间的延长变化不明显，这可能是由于此时射流空化作用达到饱和，疏水性基团不再暴露，因此持油性变化不明显。

3 结 论

射流空化能够使大豆分离蛋白的亚基解聚，使浊度明显下降，且射流空化中的空化效应会使蛋白质分子扩散并展开，暴露其疏水性氨基酸，使其乳化性、持油性、表面疏水性随处理时间延长而增加。然而射流空化处理会使大豆分离蛋白的疏水基团暴露，导致持水性明显下降。在研究过程中还发现射流空化对高质量分数大豆分离蛋白功能性质的改善较为明显，当溶液中蛋白质质量分数较低时，颗粒分散至一定程度，过度的空化效应提高了蛋白质分子间的静电作用力以及疏水相互作用，这些作用力使过度展开的蛋白质分子聚集形成不溶性聚集，所以导致溶解性和乳化稳定性有一定的下降。射流空化处理后大豆分离蛋白的二级结构也会发生变化，α-螺旋和无规卷曲相对含量升高，而β-折叠和β-转角的相对含量降低，说明大豆分离蛋白分子的刚性结构减少，柔性结构增加，分子由有序结构变为无序。同时，在射流空化作用下，大豆分离蛋白荧光峰位红移，两种浓度蛋白的荧光强度均呈增加趋势，表明色氨酸暴露于蛋白质表面，蛋白质分子结构展开，肽链更加伸展。