江艳艳，粟桂娇，马 丽,，黄秋容，于 唱，李丽丽
（1.广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004；2.广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁 530004）
天然香料以其绿色、安全、环保等特点，日益受到消费者的青睐。采用物理提取的方法从动、植物体内获取的天然香料远不能满足人们的消费需求。利用微生物转化技术获得的香料可视为“天然品”[1-3]，附加值高，是天然香精香料研究领域关注的焦点[4-6]。在微生物转化以应中，高效生产菌株的筛选是开展微生物转化研究的前提，可以通过监测转化体系实现，但工作量非常繁重。因此，建立用于监测生物转化体系的简便、快捷、有效的分析方法，对于实验菌株的高效筛选具有非常重要的意义。
肉桂醇是风信子香精的主香剂，在香石竹、玫瑰、茉莉、铃兰、葵花、紫丁香等香精中也经常使用，还可用于杏子、桃子、草莓、柠檬等食品及白兰地酒用香精中[7]。通过肉桂醛选择性加氢制备肉桂醇，一直以来是催化领域研究的热点[8-9]，但通过化学催化法得到的肉桂醇不能视为“天然品”，产品附加值低。利用微生物转化可以实现由肉桂醛选择加氢制备肉桂醇，开辟了天然肉桂醇的新来源[10-12]。筛选高活性菌株是提高转化以应转化率和以应选择性的有效手段。在微生物转化肉桂醛的以应中，肉桂醛容易被氧化成肉桂酸，与产物肉桂醇同时存在。文献报道同时测定肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸3 个组分的分析方法主要为色谱法[13-15]。虽然色谱法灵敏度高、可信度强，但设备价格昂贵，样品需要进行前分离处理，操作繁琐耗时，在生物转化的前期筛菌工作中需要投入较高的成本和精力。
紫外分光光度法操作简便、迅速，广泛应用于食品、药品及精细化学品等的分析[16-18]。但是直接扫描肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸3 个组分得到的紫外光谱相互重叠，而且由于生物转化液含有多种有机培养基及无机盐，成分复杂，对产物的测定会造成一定的干扰，因此，紫外分光光度法不能直接用于实验菌株的筛选。
导数光谱是通过对吸收光谱进行一阶或多阶求导变换获得，是紫外吸收光谱派生的一个分支。导数光谱法能从重叠的吸收光谱中分离出多组分样品各自对应的吸收峰，排除背景和基质的干扰，提高重叠谱带及平坦谱带的分辨率，可用于定性鉴别和定量分析[19-21]。复杂的多组分试样可不经分离直接用导数光谱法进行测定，方法简便、快速、准确，可大大节省试剂、时间和人力，被广泛用于药品[22-25]、食品[26-29]和生物质[30]的分析。但其用于筛选微生物转化菌株的研究还鲜有报道。本研究利用导数光谱法的特点，对3 个组分的紫外吸收光谱进行二阶或三阶导数处理，不仅解决了肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸3 个组分紫外光谱相互重叠的问题，还消除了转化液培养基对检测的干扰，实现了3 个组分的快速测定。利用该方法对微生物转化样品直接进行测定，操作简便快捷、成本低、实用性强，可大大提高利用微生物转化肉桂醛制备天然肉桂醇前期筛菌工作的效率。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
肉桂醇标准品（98%）、肉桂酸标准品（纯度≥99.5%） 国药集团化学试剂有限公司；肉桂醛标准品（98%） 上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯） 广东光华科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
8453紫外-可见分光光度计 美国Agilent公司；Precisa XB120A分析天平 上海精科天美仪器有限公司；3-18K台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司。
1.3 方法
1.3.1 溶液的配制
培养液空白溶液：以培养实验菌株的液体培养基作为培养液空白溶液；单一标准品储备液：准确称取肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸标准品适量，以无水乙醇为溶剂，配制成质量浓度分别为109.4、103.0、102.7 mg/L的标准液，将其作为储备液备用。
1.3.2 样品的制备
在肉桂醛生物转化后的以应液中加入等体积的无水乙醇，充分振荡混匀后，8 000 r/min离心20 min，取上清液稀释到一定浓度后用于紫外光谱的测定。
1.3.3 紫外光谱的采集
准确移取肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸标准储备液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL分别置于10 mL容量瓶中，无水乙醇作溶剂，配制成系列不同质量浓度的标准液。于200～400 nm波长范围内分别测定各组分的紫外吸收光谱。
1.4 数据处理
将所测紫外光谱数据导出，然后采用Origin软件对数据作多阶求导处理。
2 结果与分析
2.1 各组分检测波长的选择
2.1.1 多组分紫外吸收光谱
将肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸、培养液空白以及各组分的混合物进行紫外扫描，其紫外吸收光谱如图1所示。
图1 紫外吸收光谱Fig. 1 UV absorption spectra
由图1可看出，以应体系中各组分的紫外吸收光谱相互之间均有部分重叠，难以分辨。
2.1.2 肉桂醛、肉桂酸检测波长的选择
紫外吸收光谱的导数光谱能够有效消除被测组分与共存组分因重叠所带来的吸收干扰。为此，对肉桂醇、肉桂醛、肉桂酸及培养液空白的紫外吸收光谱进行二阶求导得到相应的二阶导数光谱，如图2所示。
图2 二阶导数光谱Fig. 2 Second-order derivative spectra
由图2可看出，在230～400 nm波长范围内，培养液空白的吸光度二阶导数值为零，对样品中其余3 个组分肉桂醛、肉桂酸和肉桂醇的检测没有干扰。
在300～350 nm波长范围，进一步考察不同质量浓度肉桂酸、肉桂醛和肉桂醇3 个组分的二阶导数光谱图，如图3所示。
图3 不同质量浓度下肉桂酸、肉桂醛和肉桂醇二阶导数光谱Fig. 3 Second-order derivative UV spectra of cinnamaldehyde and cinnamic acid at different concentrations
由图3可知，在300～350 nm波长范围内，不同质量浓度肉桂醇的二阶导数值始终趋近于0，肉桂醇的紫外吸光度二阶导数值不会干扰肉桂醛和肉桂酸的测定；在306 nm波长处，不同质量浓度的肉桂醛二阶导数光谱都相交于一点，且该点的二阶导数值为零，因此，在306 nm波长处检测肉桂酸，其紫外吸收的二阶导数值不受肉桂醛的干扰，故选取306 nm作为肉桂酸的检测波长；在320 nm波长处，不同质量浓度肉桂酸所对应的吸光度趋于零，同理可选取320 nm作为肉桂醛的检测波长。
2.1.3 肉桂醇的检测波长的选择
由于培养液空白、肉桂醇、肉桂醛和肉桂酸的二阶导数光谱在200～300 nm波长范围内均有吸收，且吸收峰相互重叠，无法定量分析肉桂醇含量。因此，对4 种物质的紫外吸收光谱进行三阶求导，得到的三阶导数光谱如图4所示。
图4 三阶导数光谱Fig. 4 Third-order derivative UV spectra
由图4可知，在235～275 nm波长范围内，培养液空白、肉桂醛和肉桂酸的紫外吸收三阶导数值都趋于零，对肉桂醇的紫外吸收三阶导数值的测定无干扰，故实验选取干扰最小且有最大紫外吸收三阶导数值的256 nm作为肉桂醇的检测波长。
2.2 工作曲线线性回归方程
按2.1.2节所述方法获得肉桂酸和肉桂醛的二阶导数光谱，分别选取肉桂酸在306 nm和肉桂醛在320 nm波长处的二阶导数值为定量指标，分别建立肉桂酸和肉桂醛的紫外吸收二阶导数值YII对质量浓度C（mg/L）的工作曲线的线性回归方程；按2.1.3节所述方法获得肉桂醇的三阶导数光谱，选取肉桂醇在256 nm波长处的三阶导数值为定量指标，建立肉桂醇的紫外吸收三阶导数值YIII对质量浓度C（mg/L）的工作曲线的线性回归方程，结果如表1所示。
表1 线性回归方程、线性范围及相关系数Table 1 Linear regression equations, linear ranges and correlation coefficients
2.3 精密度实验
在低、中、高不同质量浓度范围内，取不同质量浓度的肉桂酸、肉桂醛和肉桂醇溶液各3 份。在306 nm和320 nm波长处分别测定肉桂酸和肉桂醛的吸光度二阶导数值，在256 nm波长处测定肉桂醇的吸光度三阶导数值，并分别计算测量结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果如表2所示，各组分的RSD（n=6）均不超过5%，具有良好的重复性。
表2 精密度测定（n=6）Table 2 Precision of the presented method (n= 6)
2.4 回收率实验
模拟肉桂醛转化体系，在培养液空白液中分别加入一定量的肉桂醛（3.78 mg/L）、肉桂酸（1.93 mg/L）、肉桂醇（2.16 mg/L），分别按低、中、高3 个质量浓度加入各组分的标准溶液进行测定，结果见表3。肉桂醛、肉桂酸和肉桂醇平均回收率分别为103.3%、104.1%和98.0%，RSD分别为4.1%、2.1%和3.5%。
表3 回收率测定（n=3）Table 3 Recoveries of the method (n= 3)
2.5 样品的测定
按1.3.2节方法处理3 批不同质量浓度的样品，并按1.3.3节方法对样品进行紫外扫描和分析处理，平行测定6 次，结果如表4所示，其RSD（n=6）均小于4%，表明该方法稳定可靠。
表4 样品测定结果（n=6）Table 4 Quantitative results for actual samples (n= 6)
3 结 论
实验表明，通过对紫外吸收光谱进行数学变换为多阶导数光谱测定生物转化液中的肉桂醛、肉桂酸和肉桂醇，不仅能够消除在生物催化以应中的媒介（培养液空白）对样品测定的干扰，同时也能消除各组分样品相互影响所带来的测定误差。该方法操作简单、准确度高、适用性强，相比于传统的色谱法，避免了萃取、分离等繁琐操作以及价格昂贵、成本高、分析时间过长所带来的不便，适合频繁和大量的前期筛菌工作的测量，能够广泛使用。
