不同干燥方式对红花玉兰花蕾挥发油成分及抗氧化、抗菌活性的影响

程嘉莉，马 江，肖爱华，朱仲龙，桑子阳，马履一,

（1.北京林业大学林学院，省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083；2.湖北五峰土家族自治县林业科学研究所，湖北 宜昌 443413）

合成的抗氧化剂和抗菌剂因普遍存在的毒理效应以及不断增强的细菌耐药性，引发了消费者对其安全性和实用性越来越多的质疑和排斥。而植物挥发油因安全无毒，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等生物活性[1-3]，且感官体验良好，被认为是合成添加剂极具潜力的天然替代品，其在食品加工、医药和化妆品等领域均具有极为广阔的开发应用前景[2]。植物材料的干燥作为样品保存和挥发油提取前的预处理手段，方法的选择能显着影响挥发油化学组成及含量。不同干燥处理过程中往往伴随着不同程度的热敏性成分的降解和散失，以及全新化合物的形成[4]，从而可能会导致其抗氧化、抗菌等生物活性以及感官特征呈现明显差异。Pirbalouti等[5]对比香薄荷属Satureja bachtiaricaBunge.在不同干燥处理条件下的挥发油萃取率发现，萃取率从高到低的条件为：45 ℃烘干＞冷冻干燥＞65 ℃烘干＞阴干＞晒干。Ozdemir等[6]研究发现牛至（Origanum vulgareL.）在阴干处理条件下的挥发油萃取率及抗氧化活性均高于60 ℃烘干和晒干处理；而Zhang Liangliang等[7]对柠檬（Citrus limon(L.) Burm. f.）皮挥发油的研究结果则表明：经晒干处理的柠檬皮挥发油萃取率、抗菌活性则高于烘干（40、60 ℃）和红外干燥（40、60 ℃）处理。此外，Farag等[8]研究大蒜（Allium sativumL.）挥发油含量及抗菌活性时却发现，冷冻干燥保留原有化学成分及生物活性表现最佳，但微波干燥后大蒜的挥发油抗菌活性高于阴干处理。因此，干燥方式的选择对于植物挥发油的萃取至关重要，探索理想的干燥条件具有极为重要的生产实践意义。

红花玉兰（Magnolia wufengensisL. Y. Ma et L. R.Wang）是木兰科木兰属落叶乔木[9]，原始群落分布于湖北省五峰县海拔1 400～2 000 m次生林中，花期在3月中下旬—4月中旬，花型优美，花色艳丽，芳香浓郁[10]。有关木兰属植物挥发油具有抗氧化、抗菌活性的相关研究已有较多报道，如Farag[11]和Ha[12]等分别对广玉兰（M. grandiflora）、北美木兰（M. virginiana）花和M. hypolampra枝、叶挥发油的生物活性进行测定，结果均表明木兰属植物的挥发油具有一定的抗氧化及抗菌活性。因此将红花玉兰挥发油开发成为天然抗氧化剂和抗菌剂具有良好的应用潜力和广阔的市场前景。本实验通过超临界CO2萃取法分别萃取4 种不同干燥处理条件下的红花玉兰花蕾的挥发油，并通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）结合保留指数（retention index，RI）对挥发油进行了定性和定量分析，同时利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除法和还原能力法评价其抗氧化活性，并利用滤纸片扩散法评价体外抗菌活性。考察红花玉兰花蕾在不同干燥处理下，挥发油萃取率、化学组成及抗氧化、抗菌活性的差异，以期为红花玉兰挥发油提取工艺的确定提供技术支持和生产实践指导，同时也为红花玉兰挥发油的开发和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2018年3月上旬上午于湖北省五峰县仁和坪采集红花玉兰‘娇红1号’花蕾。

大肠杆菌（Escherichia coliATCC25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC25923）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimuriumATCC14028）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisATCC6633） 上海鲁微科技有限公司。

C7～C40正构烷烃混合标准品 美国o2si标准品公司；DPPH、ABTS 美国Sigma公司；氨苄青霉素、刃天青 上海阿拉丁试剂有限公司；正己烷（色谱纯）北京化工厂；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LGJ-10冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；超临界CO2萃取装置 美国Applied Separations公司；旋转蒸发仪德国Heidolph公司；7890B-5977A GC-MS联用仪美国Agilent科技有限公司；Lambda35紫外分光光度计美国PerkinElmer公司；恒温培养箱 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

新鲜花蕾除去枝梗后分别采用阴干（16 d）、晒干（9 d）、55 ℃烘干（12 h）和-40 ℃冷冻干燥（15.5 h）4 种方法干燥至恒质量，同一干燥处理的花蕾粉碎后过标准筛，取20～40 目样品封袋保存于干燥器中备用。

1.3.2 挥发油的提取

根据前期单因素试验和响应面优化得到的萃取参数：萃取温度47 ℃，萃取压力40.7 MPa，静态萃取时间90 min，动态萃取时间102 min，CO2流速2.5 mL/min对红花玉兰干燥花蕾进行超临界CO2萃取，所得粗提物经正己烷溶解、过滤后，用旋转蒸发仪在35 ℃条件下旋转蒸发至纯净，称质量并按公式（1）计算萃取率。

1.3.3 挥发油的成分分析

C7～C40正构烷烃混标（1 mg/mL）以正己烷稀释至10-3mg/mL，4 种不同干燥花蕾挥发油以正己烷稀释至10 mg/mL，超声处理2 min使其溶解后，分别过直径为0.22 μm的针式微孔滤膜，待GC-MS检测。

GC条件：HP-5M石英毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；120 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至280 ℃，保持20 min；载气（He）流速1 mL/min；进样量1 μL，分流比10∶1。

MS条件：电子电离源（70 eV）；离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度280 ℃，溶剂延迟时间3 min，质量扫描范围m/z 35～550。

GC-MS总离子流图采用自动化质谱解卷积处理，结合正构烷烃混标测定计算目标成分RI[13]，具体按式（2）计算。并与谱库中保留指数（RI*）进行比对，做定性分析，以峰面积所占比例初步定量分析。

式中：TRx为组分保留时间/min；TRz、TR（z+1）分别为碳数z、z+1正构烷烃的保留时间，且TRz＜TRx＜TR（z+1）。

1.3.4 挥发油的抗氧化活性测定

以DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力和还原能力3 个指标来评价挥发油的抗氧化活性，建立抗氧化活性指标（y）-挥发油质量浓度（以无水乙醇为溶剂）（x/（mg/mL））回归模型。以抗坏血酸为阳性对照，无水乙醇为空白对照，DPPH自由基清除能力测定实验中抗坏血酸-无水乙醇质量浓度梯度为0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg/mL，ABTS阳离子自由基清除能力和还原能力测定实验中抗坏血酸-无水乙醇质量浓度梯度为0.007、0.014、0.021、0.028、0.035 mg/mL。所有试剂现配现用，按公式（3）计算DPPH自由基清除率和ABTS阳离子自由基清除率。

式中：A0表示空白对照组的吸光度；AS为实验组的吸光度。

通过回归模型求解DPPH自由基清除法和ABTS阳离子自由基清除法所得到的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50），IC50为自由基清除率达到50%时挥发油或抗坏血酸的质量浓度[14]。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除率的测定参照Cherrat等[15]的方法并稍作修改。取1 mL不同质量浓度梯度挥发油-乙醇溶液（冷冻干燥花蕾挥发油-乙醇溶液的质量浓度梯度依次为1.2、2.4、3.6、4.8、6.0 mg/mL，阴干、晒干和55 ℃烘干花蕾挥发油-乙醇溶液的质量浓度梯度依次为3、6、9、12、15 mg/mL样液），加入3 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L），室温黑暗条件下振荡60 min，于517 nm波长处测定吸光度。

1.3.4.2 ABTS阳离子自由基清除能力测定

ABTS阳离子自由基清除率的测定参照Tian Jun等[16]的方法并稍作修改。ABTS溶液（7 mmol/L）和过硫酸钾溶液（2.45 mmol/L）等比例混合，室温黑暗条件下反应12～16 h，以无水乙醇稀释至在734 nm波长处吸光度为0.700±0.005，制备得到ABTS溶液。取0.3 mL不同质量浓度梯度挥发油-乙醇样液（梯度同1.3.4.1节），加入2.7 mL ABTS溶液，30 ℃水浴加热6 min，于波长734 nm处测定吸光度。

1.3.4.3 还原能力测定

还原能力的测定参照Harkat-Madouri等[17]的方法并稍作修改。取1 mL不同质量浓度梯度挥发油-乙醇样液（冷冻干燥花蕾挥发油-乙醇溶液质量浓度梯度依次为7、14、21、28、35 mg/mL样液，阴干、晒干和55 ℃烘干花蕾挥发油-乙醇溶液质量浓度梯度依次为15、30、45、60、75 mg/mL样液），加入1 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L、pH 6.6）、1 mL 1 g/100 mL铁氰化钾溶液，黑暗条件下50 ℃水浴加热20 min，于冰水中快速冷却后加入1 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，3 000×g离心10 min，取1.5 mL上清液，加入1.5 mL蒸馏水和0.3 mL 0.1 g/100 mL氯化铁溶液充分混合，静置10 min，于700 nm波长处测定吸光度（A700nm），以A700nm表征还原能力。

1.3.5 挥发油抗菌活性测定

参照Abdelli等[18]的方法并做优化。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和枯草芽孢杆菌以平板菌落计数法调整至107CFU/mL。在MH平板中加入4 种菌液100 μL，均匀涂布并干燥后，等间距放置3 个空白药敏纸片（直径6 mm），依次滴加10 μL挥发油-吐温-80样液（50 mg/mL）、体积分数5%吐温-80（阴性对照）和5 μg/片氨苄青霉素溶液（阳性对照），平板置于超净工作台上扩散0.5 h时后，移至37 ℃恒温培养箱中倒置培养24 h，每个菌种设置3 组平行，记录抑菌圈直径/mm，结果取其平均值。

1.4 数据统计分析

实验设3 个平行，实验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 16.0软件进行方差分析，Excel软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 不同干燥方式对挥发油萃取率的影响

图1 4 种方式干燥处理后的红花玉兰花蕾的挥发油萃取率Fig. 1 Yields of essential oils extracted from the buds of M. wufengensis subjected to four drying treatments

如图1所示，在不同干燥处理条件下，红花玉兰花蕾的挥发油萃取率有极显着差异。其中，冷冻干燥花蕾的挥发油萃取率最高，达（2.736±0.138）%，晒干和55 ℃烘干次之，分别为（1.864±0.025）%、（1.680±0.007）%，且这两种干燥处理间差异没有极显着差异，而阴干花蕾的挥发油萃取率最低，仅为（1.217±0.014）%。结果表明冷冻干燥处理能最大限度地保留红花玉兰花蕾的挥发油含量，而阴干处理造成的挥发油损失最为显着。不同干燥方式下，百里香属Thymus daenensissubsp.daenensis. Celak的挥发油萃取率由高到低为：冷冻干燥＞50 ℃烘干＞晒干＞70 ℃烘干＞阴干[3]，灰罗勒（Ocimum americanumL.）为：晒干＞55 ℃烘干＞阴干[19]，均呈现与本研究相似的规律。这可能是由于在冷冻干燥的超低温环境中，细胞内水分快速形成的冰晶破坏了细胞结构，促进了细胞内物质的释放，从而有效地提高了挥发油的萃取率[20]；而晒干和55 ℃烘干处理的干燥温度较高且干燥时间相对较长，阴干处理虽然干燥温度较低但干燥时间更长；因此，3 种处理均加速了干燥过程中挥发油成分的降解和逸散，且阴干处理损耗最多[20-21]。然而，Sárosi[22]和Xing Ying[23]等在百里香属Thymus vulgaris茎和紫苏（Perilla frutescensL.）叶挥发油提取研究中却得到了相反的结果，冷冻干燥所得挥发油萃取率仅为阴干所得的60%和71%。由此可知，干燥过程中挥发油萃取率的差异不仅受干燥方式的影响，可能还与植物材料本身的生物学特性相关[3]。

2.2 不同干燥方式对挥发油成分及含量的影响

图2 红花玉兰冷冻干燥（A）、阴干（B）、晒干（C）、55 ℃烘干（D）花蕾挥发油GC-MS总离子流图Fig. 2 Total ion current chromatograms of essential oils from the buds of M. wufengensis subjected to freeze drying (A), shade drying (B),sun drying (C) or 55 ℃ oven drying (D)

由图2可知，冷冻干燥花蕾的挥发油色谱峰主要集中在6～30 min，阴干、晒干和55 ℃烘干花蕾挥发油总离子流图相似，色谱峰主要集中在14～30 min。红花玉兰花蕾4 种干燥处理所得的挥发油共鉴定出49 种化合物，其中11 种化合物为共有成分，包括8 种烃类化合物及4H-xanthalongia、VE和γ-谷甾醇。在冷冻干燥花蕾的挥发油中，共鉴定出26 种化合物，占检测到的挥发油总量的77.71%，其中特有成分11 种，占检测到挥发油总量的7.42%，以萜烯（5.62%）和萜醇类（1.2%）为主；两种主要成分γ-谷甾醇（27.84%）和4H-xanthalongia（27.09%）相对含量远高于其他成分，烃类（8.74%）相对含量也较高，且VE（4.71%）和萜烯类（5.62%）相对含量较酯类（2.03%）更高，并含有少量酚类（0.48%）、醇类（1.20%）。从晒干、55 ℃烘干和阴干处理的花蕾挥发油中分别鉴定出20、20、30 种化合物，分别占各自检测到挥发油总量的84.8%、71.1%和70.65%，并且晒干、55 ℃烘干和阴干处理花蕾挥发油中γ-谷甾醇（32.56%、28.01%、24.39%）和烃类（37.42%、27.82%、29.73%）相对含量均远高于其他成分。此外，晒干和55 ℃烘干花蕾中酮类相对含量（分别为10.36%、8.54%）相对较高，但萜烯类相对含量（分别为0.11%、0.16%）较低，仅含有少量VE（分别为0.69%、0.33%）及酯类（分别为0.76%、1.04%），且这两种处理的花蕾挥发油共有成分多达18 种。同样地，阴干花蕾挥发油中的高氧化物质相对含量也非常高，如酮类（7.82%）、醛类（1.78%）和酯类（1.03%），而VE（0.21%）和醇类（0.14%）成分相对含量较低，且无萜烯类成分，特有的12 种成分（3.84%）也以醛类（1.78%）为主。造成4 种干燥处理后花蕾挥发油成分差异的主要原因可能是冷冻干燥过程中材料始终处于超低温环境，从而最大限度地减少了热敏性成分的分解和逸散，加之冰晶直接升华无液态水的存在，以及真空的干燥环境，从而有效地减少了氧化和酶促反应的发生，使得酮、醛、酯等氧化产物含量较低[20]；晒干和烘干处理因为干燥温度较高且干燥时间相对较长，可能导致了热敏性成分的逸散和分解，且持续性与热空气流接触，氧化反应和酶促反应相对剧烈[3,21]；而阴干处理由于干燥温度较低，水分散失缓慢，使得样品材料在较长时间内其水分始终维持在较高水平，延长了干燥过程中代谢反应的持续时间，从而促进了挥发油成分的分解、氧化和酶促反应。除干燥方式外，木兰属植物挥发油成分及含量还受树种生物学特性[11]、生长环境条件[24]、取样部位[25]、所采样品生长发育阶段[26]以及挥发油萃取方式及参数[13]等条件影响。由此可知，实际生产应用中，需综合考量影响挥发油成分组成的各个因素才能有效控制目标成分的获取。

表1 不同干燥处理红花玉兰花蕾挥发油的成分及相对含量Table 1 Chemical composition and their relaive contents of essential oils from the buds of M. wufengensis dried by different drying methods

2.3 挥发油的抗氧化活性

由表2可知，红花玉兰4 种干燥花蕾的挥发油质量浓度与DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率以及吸光度（A700nm）间建立的回归方程线性拟合良好。实验结果表明，红花玉兰花蕾挥发油具有一定的抗氧化活性，但活性相对阳性对照抗坏血酸较弱。4 种不同干燥方式处理花蕾的挥发油的抗氧化性在3 种测定方式下均呈现一致的结果，从高到低均表现为：冷冻干燥＞阴干＞晒干＞55 ℃烘干，且冷冻干燥花蕾的挥发油活性远高于其他3 种干燥处理的花蕾。DPPH自由基清除率和ABTS阳离子自由基清除率测定实验中，冷冻干燥花蕾的挥发油IC50值分别是阴干、晒干、55 ℃烘干花蕾挥发油的0.25、0.19、0.17 倍和0.36、0.29、0.25 倍，在还原能力测定实验中，冷冻干燥花蕾挥发油线性方程斜率也大于其他3 种干燥方式，说明在相同质量浓度下，冷冻干燥花蕾挥发油抗氧化活性更强。前人的研究表明，挥发油抗氧化活性与其化学组成及含量有关，酚类和VE具有较强抗氧化活性；此外，萜醇、萜烯、酮、醛以及甾醇类也是重要的抗氧化活性成分[27-29]，牛油果（Persea americanaMill.）植物甾醇提取物清除自由基能力甚至强于VE[28]。因此，冷冻干燥处理提取的挥发油具有高抗氧化活性可能是因为其挥发油成分中含有含量较高的酚类（0.48%）、VE（4.71%）、萜烯类（5.62%）和萜醇类（1.20%）。另外，挥发油中的微量成分与主要成分间也存在一定的协同作用，也可有效加强抗氧化活性[2]。因此，虽然晒干和烘干花蕾中提取的挥发油所含的VE、萜烯、酮类及甾醇类的含量要高于阴干花蕾，但可能由于阴干花蕾挥发油中含有较多的萜醇类和醛类，以及可能还含有其他某些微量成分，从而使其挥发油的抗氧化活性强于晒干和55 ℃烘干花蕾所提取的挥发油。而由于晒干和55 ℃烘干花蕾挥发油成分和各成分含量均区别不大，因此两者挥发油抗氧化性差异也相对较小。

2.4 挥发油的抗菌活性

挥发油的抗菌活性也主要取决于其化学组成及含量，其中酚类、萜醇、萜烯、酮、醛以及甾醇类等均为抗菌活性成分的重要组分，并与微量成分间存在协同作用[2,18,27-28,30]。如图3所示，红花玉兰花蕾挥发油对4 种供试菌均有一定的抑制作用，但其抑菌活性要弱于氨苄青霉素。4 种干燥处理花蕾的挥发油均对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，且冷冻干燥花蕾挥发油抑菌活性显着高于其他干燥处理，阴干花蕾挥发油对金黄色葡萄球菌抑制作用最弱。此外，冷冻干燥和阴干花蕾挥发油对枯草芽孢杆菌的抑制作用差异不显着，但两者均显着高于晒干和55 ℃烘干处理。4 种干燥花蕾挥发油对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用则均无显着性差异。冷冻干燥和阴干花蕾挥发油对4 种供试菌的抑制作用由高到低依次为：金黄色葡萄球菌（G+）＞枯草芽孢杆菌（G+）＞大肠杆菌（G-）＞鼠伤寒沙门氏菌（G-），晒干和烘干花蕾的挥发油的抑菌作用由高到低则依次为：金黄色葡萄球菌（G+）＞大肠杆菌（G-）＞鼠伤寒沙门氏菌（G-）＞枯草芽孢杆菌（G+）。Almadiy等[2]研究发现蓍草类（AchilleaL.）挥发油对革兰氏阳性菌的抑制作用要强于革兰氏阴性菌，其推测可能是这两类菌细胞壁的结构组成差异导致的，革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖限制了抗菌活性成分的进入；而革兰氏阳性菌细胞壁脂磷壁酸亲脂末端则促进了这些疏水化合物的渗透。Ha等[12]对M. hypolampra枝和叶挥发油抗菌活性的研究结果则表明细菌属于革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌与抗菌活性之间无明显相关性，与本研究结果一致。因此，挥发油对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制作用是否有一定的规律性以及其抑菌机制是否与细胞壁的组成相关均有待进一步的考证。

表2 不同干燥方式处理后红花玉兰花蕾挥发油的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of essential oils from M. wufengensis buds dried by different drying methods

图3 不同干燥方式处理后红花玉兰花蕾挥发油的抗菌活性Fig. 3 Antibacterial activities of essential oils from M. wufengensis buds dried by different drying methods

3 结 论

不同干燥处理条件对红花玉兰花蕾挥发油的萃取率、成分组成、各成分含量以及抗氧化、抗菌活性均有影响。在4 种不同的干燥处理条件下，红花玉兰花蕾挥发油超临界CO2萃取率由高到低依次为：冷冻干燥＞晒干＞55 ℃烘干＞阴干，自动化质谱解卷积结合RI共鉴定出49 种化合物，其中冷冻干燥花蕾挥发油鉴定出26 种，含11 种特有成分，以萜烯类（5.62%）和萜醇类（1.2%）为主；阴干花蕾挥发油鉴定出30 种，含12 种特有成分，以醛类（1.78%）为主；而晒干和55 ℃烘干花蕾挥发油各鉴定出20 种，且成分相似度较高，含18 种共有成分。抗氧化和抗菌实验表明，红花玉兰花蕾挥发油具有一定的抗氧化活性，从高到低依次为：冷冻干燥＞阴干＞晒干＞55 ℃烘干，同时具有广谱抑菌性，且4 种干燥花蕾挥发油均对金黄色葡萄球菌抑制作用最强。此外，在冷冻干燥处理条件下，红花玉兰花蕾挥发油的萃取率、抗氧化活性以及对金黄色葡萄球菌的抗菌活性均显着高于其他3 种干燥处理。综上，冷冻干燥是红花玉兰花蕾最佳的干燥方式，该研究对红花玉兰挥发油提取工艺的制定和产品的开发应用提供了重要的参考。