王方杰，吴祖芳，翁佩芳，张 鑫，田 园

（宁波大学食品与药学学院，浙江省动物蛋白精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315832）

肥胖是一种慢性代谢紊乱，能够大幅增加罹患2型糖尿病、脂肪肝、高血压、心肌梗塞和癌症等疾病的风险，从而导致患者生活质量下降和预期寿命缩短，故预防和治疗肥胖已成为现代社会面临的主要健康挑战[1-2]。近年来，众多的研究表明肠道微生物对人体健康起着至关重要的作用，能够改善免疫系统、调节宿主代谢、平衡营养素的吸收，菌群的多样性与机体健康息息相关[3]。与正常个体相比，肥胖宿主的肠道菌群显示出较低的基因丰度[4-5]，适当的饮食干预可以增强肠道菌群的基因丰度并促进体质量减轻[6]。肠道菌群与肥胖的关系已成为研究的热点，且是治疗肥胖的潜在有效靶点。

许多研究表明，植物活性物质具有预防肥胖的作用，并可能通过调节肠道菌群来减轻体质量[7-9]。胡柚为芸香科植物柚与甜橙的杂交品种，是浙江省常山县原产的地方柑橘品种，具有镇咳化痰、消食舒胃等功效[10]。黄酮类化合物（flavonoids，FLS）是胡柚中重要的生物活性物质，胡柚黄酮的主要成分为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等[11]。研究表明，FLS能够利用其抗氧化和抗炎特性在超重胰岛素抵抗大鼠中发挥潜在的肥胖治疗作用[12]，并降低血浆脂质浓度，改善高碳水化合物、高脂肪饮食诱导的大鼠心血管功能障碍和肥胖[13]。在FLS发挥作用的机制中，肠道菌群被认为起到核心作用，这不仅是因为一些FLS具有抑菌作用，而且也特异性地促进了部分细菌的增殖[14-15]。然而，胡柚黄酮与肥胖宿主肠道菌群间的相互作用并不清楚。本研究拟采用高脂肪饮食（high fat diet，HFD）诱导建立高脂肥胖小鼠模型，应用16S rDNA测序技术，探究胡柚黄酮对HFD小鼠肠道菌群的影响及对肥胖的调控作用，为胡柚资源的深度开发和黄酮类化合物作为功能性成分的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

实验动物采用SPF级C57BL/6J小鼠（6 周龄，雄性，平均体质量（20±2）g），实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0191，购于上海斯莱克实验动物有限公司。

胡柚黄酮为常山胡柚干燥粉末采用乙醇浸提法得到的粗提物，经D101型大孔树脂进一步纯化，所得提取物的总黄酮质量分数为95%；标准饲料由宁波大学实验动物中心提供；高脂饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒 南京建成生物工程研究所；苏木精-伊红染液 武汉谷歌生物科技有限公司；DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.®Stool DNA Kit） 美国Omega Bio-Tek公司；DL2000 DNA Marker 日本宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖（RA1011-Agarose LE-100G） 上海捷瑞生物工程有限公司；氯化钠、异丙醇、无水乙醇、多聚甲醛 国药集团化学试剂有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AY-120型电子精密天平 日本Shimadzu公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器、无菌硬质粪便收集袋 上海申安医疗器械厂；Spectramax190全波长酶标仪 美国Molecular Devices有限公司；5418R小型高速冷冻离心机、5804R高速冷冻离心机德国Eppendorf 公司；MX-S/M X-F 型漩涡混合器 大龙兴创实验仪器北京有限公司；Cryotome E冰冻切片机 赛默飞世尔科技中国有限公司；ECLIPSE CI正置光学显微镜 日本尼康公司；L96G梯度型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 杭州朗基科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组和处理

小鼠购得后经外包装灭菌处理立即转入宁波大学实验动物中心，SPF级屏障系统内进行饲养，温度和相对湿度分别控制在（22±2）℃和（50±10）%，12 h光照和12 h黑暗交替循环，小鼠自由饮食饮水。在整个实验期间，所有涉及动物的程序均严格按照中国有关实验动物的相关饲养规范和法律规定进行。

小鼠经过1 周的适应性饲养，每组6 只，随机分为3 组：正常对照组（CONT组）、高脂肥胖组（HFD组）、胡柚黄酮组（FLS组），实验动物具体分组情况见表1。称取一定量的胡柚黄酮溶解于无菌水中，避光保存，采用灌胃的方式按100 mg/（kgmb·d）的剂量对FLS组小鼠进行干预，每日1 次，CONT组和HFD组灌胃等体积无菌水（在此剂量下小鼠精神正常，无任何异常现象，无一例死亡）。实验以第一天灌胃为第0周，共持续8 周，每周3 次记录小鼠的体质量和摄食量并计算平均值，同时在第0、2、4、8周（分别为FLS 0、FLS 2、FLS 4、FLS 8组）收集每组小鼠的新鲜粪便样本，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱中保存，用于肠道菌群分析。第8周末，所有小鼠禁食过夜，通过颈椎脱臼处死小鼠，立即收集血液样本，并在4 ℃下3 500×g离心10 min，取上层血清用于生化测定。迅速解剖小鼠，分离肝脏组织用于病理学检测。

表1 实验动物分组Table 1 Animal grouping

1.3.2 血清生化指标测定

小鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C含量均采用南京建成生物工程研究所生产的测试盒进行检测，测定方法严格按照测试盒说明进行。

1.3.3 肝脏组织病理学检测

将新鲜肝脏组织在4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，用OTC包埋剂进行包埋。快速冷冻后切下组织切片（8～10 μm），并用油红O染色，在光学显微镜200×放大倍数下观察肝脏脂肪变性程度。

1.3.4 粪便细菌DNA提取和16S rDNA测序分析

参考文献[16]报道的方法，采用E.Z.N.A.®Stool DNA Kit提取小鼠粪便中细菌的总DNA，并对提取的DNA样本进行质检，检验合格的样本用于后续分析。以16S rDNA高变区中的V3+V4区为目标测序片段，采用带Barcode的特异引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对目标片段进行PCR扩增，每个样品进行3 次重复。PCR扩增产物通过质量分数2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行回收、纯化。对纯化后的PCR产物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒在Qbit荧光定量系统上对文库进行定量，将合格的文库在Illumina MiSeq平台上对样品进行测序。

采用FLASH（v1.2.8）软件将序列拼接成高质量Tags，并将序列建库引入的Barcode和引物序列去除，然后采用Vsearch（v2.3.4）软件过滤嵌合体。将序列相似度大于97%的clean tags聚类为操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。使用QIIME（v1.8.0）软件计算样本的Alpha多样性，对样本进行物种多样性分析。通过主坐标分析计算Beta多样性，用于评估样本在物种多样性中的差异。使用BLAST进行序列比对，将OTU代表序列与核糖体数据库以及NCBI-16S数据库对比，对每个代表性序列进行物种注释，获得分类学信息，在门、科、属水平上统计样本的群落结构组成并进行分析。

1.4 数据统计分析

所有实验均进行3 次平行实验，数据结果表示为平均值±标准差。运用统计软件SPSS 17.0进行单因素方差分析，数据采用Duncan’s多重比较检验，当P＜0.05则认为具有统计学显着差异。

2 结果与分析

2.1 FLS对高脂肥胖小鼠摄食量和体质量的影响

图1 FLS灌胃期间小鼠日摄食量变化Fig. 1 Changes in daily food intake of mice during administration of FLS

各组小鼠的日均摄食量在实验周期内基本稳定，由图1可看出，CONT组、HFD组和FLS组小鼠的摄食量无显着性差异（P＞0.05），表明对高脂肥胖小鼠喂食FLS不会引起小鼠的食欲下降。

图2 FLS灌胃期间小鼠体质量变化Fig. 2 Changes in body mass of mice during administration of FLS

对8 周实验过程中各组小鼠的平均体质量进行比较。第0周时，3 组小鼠具有相似的初始体质量。从图2 A 中可以看出，经过8 周的高脂饮食诱导，HFD组小鼠体质量与CONT组相比具有显着性差异（P＜0.05）；随着胡柚黄酮样品的灌胃处理，从第4周起，FLS组的平均体质量显着低于HFD组（P＜0.05），第7周起具有极显着差异（P＜0.01）。第8周实验结束时（图2B），FLS组的平均体质量为（28.20±0.85）g，与食物摄入量相同的HFD组平均体质量（（31.23±0.80）g）相比极显着降低（P＜0.01）。表明FLS显着缓解了高脂饮食诱导的肥胖小鼠的体质量增加。

2.2 FLS对高脂肥胖小鼠血清生化指标的影响

图3 FLS灌胃对小鼠血清生化指标的影响Fig. 3 Effect of FLS on serum biochemical parameters in mice

由图3可知，与CONT组相比，HFD小鼠的TC、TG和LDL-C浓度显着升高，HDL-C浓度显着下降（P＜0.05），出现高血脂症状，证明高脂肥胖小鼠模型诱导成功。经过胡柚黄酮干预后，同样喂食高脂饲料的FLS组与HFD组相比较TC、TG和LDL-C浓度则显着降低，HDL-C浓度显着升高（P＜0.05），其中LDL-C浓度基本恢复至正常水平。

2.3 FLS对高脂肥胖小鼠肝脏病理的影响

图4 小鼠肝脏组织学观察（×200）Fig. 4 Histological observation of liver tissue (× 200)

由图4可知，CONT组小鼠肝脏组织油红O染色面积较小，脂滴也很小，肝细胞形态正常；而HFD组肝脏组织中出现肝细胞脂肪变性，脂滴数目明显增多且呈堆积状，融合为大块的红色脂滴；相比之下，FLS组肝脏切片红色脂滴体积明显减小，较为稀疏，呈小颗粒状不均匀分布，肝细胞脂肪轻度变性。

2.4 FLS对高脂肥胖小鼠肠道菌群多样性的影响

为了评价高脂饮食和FLS处理对肠道菌群多样性的影响，利用Illumina MiSeq测序平台对第0、2、4、8周小鼠粪便样本进行16S rDNA测序。利用显示组间重叠部分的Venn图可以直观地理解各组之间共有和独有的OTU。由图5A可见，所有样品中共享1 284 个OTU总丰富度中的219 个，灌胃FLS后观察到的OTU＞17%，与实验初始时相同。

图5 FLS对肥胖小鼠肠道菌群多样性的影响Fig. 5 Effect of FLS on the diversity of gut microbiota in obese mice

表2 FLS对肥胖小鼠肠道菌群多样性的影响Table 2 Effect of FLS on the diversity of gut microbiota in obese mice

Alpha多样性主要反映物种丰富度和均匀度。由表2可知，随着FLS的灌胃，与实验第0周相比，第8周FLS组的Observed species和Chao1指数显着升高，表明第8周小鼠肠道菌群的物种数目显着高于实验初期（P＜0.05）。Shannon和Simpson指数也随着FLS处理时间的延长分别发生了显着升高和降低（P＜0.05），肠道菌群多样性逐渐增加并在第8周达到最大值。结果表明，FLS能够增加高脂饮食诱导的肥胖小鼠肠道菌群的多样性。

为了比较微生物群落之间的相似性程度，通过未加权的UniFrac计算Beta多样性并进行主坐标分析。由图5B可看出，虽然存在个体间差异，但经过FLS干预的肥胖小鼠肠道菌群在不同时间点彼此分开聚集，表明在8 周时间内FLS干预对肠道菌群组成有明显影响。

2.5 FLS对高脂肥胖小鼠肠道菌群组成结构的影响

图6 FLS对肥胖小鼠肠道菌群组成结构的影响Fig. 6 Effect of FLS on the composition of gut microbiota in obese mice

表3 拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度变化Table 3 Changes in relative abundance of Bacteroidetes and Firmicutes

为了进一步分析FLS对肠道菌群组成结构的影响，对不同分类水平上优势菌的相对丰度进行统计分析。门水平的聚类柱状图（图6A）显示，小鼠肠道中的优势菌群为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）。随着FLS的干预，从第0周（FLS 0）到第8周（FLS 8），小鼠肠道菌群的结构逐渐改变，Bacteroidetes的相对丰度增加，Firmicutes的相对丰度减少。据文献报道，Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）的比值可能反映肠道微生态的平衡状态，被视为生物体健康状况的典型参数[4]。对3 组小鼠肠道菌群第0周和第8周Bacteroidetes和Firmicutes的相对丰度变化进行统计（表3）发现，HFD组小鼠的Bacteroidetes显着降低，Firmicutes显着增加，F/B比值相应增加（P＜0.05），反映出肥胖小鼠肠道微生态的失调。而随着FLS处理时间的延长，FLS组的F/B比值从0.81逐渐下降到0.48。表明FLS能够调节高脂饮食诱导的肥胖小鼠肠道菌群在门水平上的组成。

科水平上小鼠肠道菌群相对丰度的前2 0 名如图6 B 所示，可以看出，拟杆菌门的普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）以及厚壁菌门的毛螺菌科（Lachnospiraceae）等为主要优势菌科。灌胃FLS后，与实验初期（FLS 0）相比，Prevotellaceae、Bacteroidaceae、Porphyromonadaceae的相对丰度增加，Lachnospiraceae、Ruminococcaceae的相对丰度逐渐减少。表明FLS能够调节肥胖小鼠肠道菌群在科水平上的组成结构。

用热图来比较属水平上各个菌属的相对丰度变化，由图6C可知，随着FLS干预时间延长，普雷沃菌属（Prevotella）、拟杆菌属（Bacteroides）、布劳特氏菌属（Blautia）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、艾克曼菌属（Akkermansia）等相对丰度明显增加，而瘤胃球菌属（Ruminococcus）、毛螺菌属（Lachnoclostridium）、嗜胆菌属（Bilophila）等相对丰度逐渐下降，这与科水平上的菌群变化趋势一致。

3 讨 论

与肥胖相关的血脂水平异常，尤其是较高水平的TC、TG和LDL-C是心血管疾病的主要决定因素[17]。本研究表明，高脂肥胖小鼠经胡柚黄酮灌胃后，与HFD组相比FLS组小鼠体质量增长呈下降趋势，血清TC、TG和LDL-C的含量显着降低，HDL-C的含量显着升高，肝脏组织的脂质积累程度也得到了缓解。胡柚黄酮体现的这些效果与相关文献所报道血脂水平TC、TG和LDL-C指标相关结果一致[18-20]。此外，血清中的HDL-C水平可作为判断动脉硬化性心血管疾病发展程度的指标[21]。胡柚黄酮能降低血清TC、TG和LDL-C水平，使血脂组成向高密度脂蛋白转变，在一定程度上调节高脂肥胖小鼠的体内血脂水平，降低肥胖和动脉粥样硬化等疾病的风险。肝脏是机体内脂类代谢的主要器官，摄入脂肪过多时，肝细胞会大量积累脂肪，甚至可能发生病变，形成脂肪肝[22-23]。实验表明，HFD组小鼠肝脏细胞脂质沉积严重，而胡柚黄酮能够明显地抑制高脂饮食导致的肝脏组织脂质积累，改善肝脏脂肪变性程度，防止脂肪肝等肝脏病变的发生。

肠道菌群可能是肥胖发展过程中最重要的可变因素[24-25]，其中的几个特定种属可以在宿主代谢和肥胖发展中发挥重要作用[26-27]。从FLS的干预对肥胖小鼠肠道菌群变化的影响结果可以看出，胡柚黄酮的干预显着提高了肥胖小鼠肠道菌群的多样性，对肠道菌群的组成结构发挥了积极的调节作用，且具有一定的时间效应。由2.5节结果可知，FLS能够促进Bifidobacterium、Blautia、Akkermansia等有益菌属的增殖。Bifidobacterium能够改善肠道环境、抑制肠道有害细菌的生长、提高肌体免疫力、预防便秘等，对人体健康有重要作用[28]；另有研究报道，Bifidobacterium可通过调节肠道屏障、缓解炎症等降低体质量[27]，近几年作为益生菌被广泛用于针对肥胖、糖尿病等代谢疾病[29]。Blautia的相对丰度与机体肠道内短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）的含量呈正相关[30]，菌群代谢产物SCFAs对肠道屏障、菌群组成和肥胖控制有益[31]。研究证明，结肠中高浓度的丙酸和丁酸对于防止低胆固醇血症和肿瘤的发生具有良好的效果[32]。本研究结果发现，FLS能够显着降低肥胖小鼠血清中LDL-C的含量，可能是通过提高肠道中Blautia等SCFAs产生菌属的相对丰度来实现的。黏蛋白降解菌属Akkermansia有助于改善肝功能异常和机体炎症[27]，通过补充益生元增加肥胖小鼠体内Akkermansia的丰度可以改善相关代谢特征，逆转高脂饮食带来的代谢紊乱[33]。FLS的干预使Akkermansia属丰度提高，从而改善肥胖小鼠的代谢指标。实验结果表明FLS对肥胖小鼠肠道菌群的组成结构具有积极的调节作用，能够增加有益菌群的相对丰度，从而对肥胖宿主的代谢产生积极的影响。

4 结 论

通过研究胡柚黄酮对高脂饮食诱导的肥胖小鼠血清和肝脏病理学及肠道菌群的调节作用，结果表明，摄入胡柚黄酮能够明显抑制体质量增加，使肥胖小鼠的血脂水平和肝脏脂质积累程度向正常化恢复，降低肥胖和脂肪肝等疾病的风险；能够显着提高肥胖小鼠肠道菌群的多样性，在门水平上增加了Bacteroidetes的相对丰度，降低了Firmicutes的相对丰度，逆转了菌群失调的肥胖小鼠F/B比值的升高，并通过增加特定的有益菌属（如Bifidobacterium、Blautia、Akkermansia等）的相对丰度使肥胖小鼠的肠道菌群发生有利改变，促进细菌生成SCFAs，调节肠道屏障，改善肥胖引起的代谢紊乱。因此，胡柚黄酮在肠道菌群的调节中呈现良好的益生作用，可作为功能性食品成分预防肠道微生态的失调，通过调节肠道菌群的结构实现降脂减肥的目的。