邓永建，陆震鸣，张晓娟，柴丽娟，李 信，余永建，李华钟，史劲松，许正宏,
（1.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214122；3.江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏 镇江 212143；4.江南大学药学院，江苏 无锡 214122）
按照醋酸发酵方式的差异，酿造食醋可分为固态发酵食醋、液态发酵食醋、固液复合发酵食醋等，其中固态发酵食醋以东方谷物醋为主，如我国的山西老陈醋、镇江香醋、四川麸醋等[1]，而液态发酵食醋广泛存在于世界各地，如德国酒精醋、英国麦芽醋、意大利葡萄醋等。液态发酵法又可分为表面静态发酵法、深层通风发酵法和滴淋发酵法等[2]，其中深层通风发酵法由于具有生产速度快、生产效率高等优点而应用广泛[3]。
液态发酵米醋主要以大米为原料，经蒸煮、糖化、乙醇发酵获得米酒，进而接种醋酸菌进行醋酸发酵而成[4]。与传统多菌种固态酿醋工艺相比，液态发酵制醋的原料和酿造菌种相对单一，发酵周期较短，产酸以醋酸为主，产品酸感刺激、风味寡淡、口感单调。目前，国内外针对液态发酵食醋的研究主要集中在筛选产酸速率快、耐酸、耐乙醇的醋酸菌以及设计新型、产酸效率高的发酵罐等，但对改善液态发酵食醋口感和风味方面的研究较少。有研究[5-6]在传统食醋醋醅中筛选了能够耐受10%（体积分数）乙醇、3%乙酸、40 ℃温度的醋酸菌，并将其用于西瓜醋的酿造；吴光忠等[7]采用猕猴桃和糯米为原料酿造果香型米醋，改善了米醋的风味品质；方冠宇[8]研究了不同发酵罐结构对浙江玫瑰醋品质的影响，发现用气动搅拌发酵罐酿造的玫瑰醋与传统玫瑰醋最接近。
我国传统食醋酿造过程中，大量乳酸菌参与了发酵，能够产生适量乳酸，柔和食醋酸感，同时促进食醋产品中多种风味物质的形成[9-10]。本研究尝试在液态发酵食醋生产前期，将麸皮浸出液用乳酸菌静置发酵，然后加入米酒并接种醋酸菌启动醋酸发酵。通过增加底物和微生物种类，以期达到改善液态发酵米醋风味品质的目标，为优化米醋酿造工艺提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
麸皮和米酒由江苏恒顺醋业股份有限公司提供，其中米酒乙醇体积分数为10%。
氢氧化钠、硫酸锌、亚铁氰化钾（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；2-辛醇、草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸（均为色谱纯）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
实验菌种见表1。
表1 本研究所用菌种信息Table 1 Information about bacterial strains used in this study
1.2 仪器与设备
全温摇瓶柜 太仓市强乐实验设备厂；生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司；e2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 米醋的液态发酵
麸皮浸出液的制备：将麸皮与水按质量比1∶4混合，超声处理20 min，用双层纱布过滤，得到麸皮浸出液。
乳酸发酵：取50 mL麸皮浸出液，分别接种10 株不同的乳酸菌，置于37 ℃生化培养箱中静置发酵24 h，得到乳酸发酵液。
醋酸发酵：实验组取40 mL乳酸发酵液，对照组取40 mL麸皮浸出液，分别加入60 mL米酒，并接种醋酸菌，置于30 ℃全温摇瓶柜中，转速200 r/min进行醋酸发酵。
1.3.2 总酸的测定
参考GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》[11]。
1.3.3 有机酸的测定
参考GB/T 18623—2011《国家地理标志产品 镇江香醋》[12]。
1.3.4 挥发性化合物的检测[13]
样品预处理：取1 mL米醋加入20 mL顶空萃取瓶中，加5 mL水、2.5 g氯化钠、10 μL 2-辛醇内标（25 mg/L），放入1 颗磁力搅拌子，置于恒温加热磁力搅拌器中，50 ℃水浴预热5 min，随后将老化过后的萃取头插入萃取瓶，50 ℃顶空萃取40 min。
气相色谱条件： 色谱柱：DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气，柱流量1 mL/min，不分流；进样口温度250 ℃；升温程序：起始40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至120 ℃，然后以10 ℃/min升至240 ℃，保持5 min，后运行温度240 ℃，后运行5 min。
质谱条件：传输线温度280 ℃，连接杆温度150 ℃；离子源为电子电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，质量扫描范围m/z33～450；ACQ方式Scan。
定性方法：将测得的质谱图与NIST17.L谱库进行检索比对，确认各个色谱峰对应的化学成分。
定量方法：采用半定量的方法，以测得的2-辛醇内标峰面积与被测物峰面积比值计算米醋中各种挥发性风味物质含量。
1.3.5 米醋的感官评价[14-16]
由10 名（5 男，5 女）经过培训的专业人员组成感官评价小组，按照表2的评价标准（100 分制）对所得的11 个米醋样品进行感官评价，以平均得分为最终结果。
表2 米醋感官评价标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of rice vinegar
1.4 数据分析
采用Microsoft Excel 2010进行数据处理，采用MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca/）在线工具进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 不同乳酸菌发酵麸皮浸出液的总酸及有机酸组成
麸皮是固态发酵食醋酿造的重要辅料之一，富含多种营养物质，包括小分子糖类、氨基酸、维生素和矿物质等[17-18]。表3为麸皮浸出液经不同乳酸菌发酵24 h后发酵液的总酸和有机酸组成。麸皮浸出液的总酸为1.62 g/L（以乳酸计），以酒石酸为主要有机酸；经不同乳酸菌发酵后，总酸为7.2～14.5 g/L（以乳酸计）；有机酸组成发生了明显改变，乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸含量显着上升，而草酸和丙酮酸含量变化不明显。短乳杆菌L-02的产酸能力最弱，而副干酪乳杆菌L-06的产酸能力最强。
表3 乳酸菌发酵24 h后总酸及有机酸组成Table 3 Total acidity and organic acid composition of lactic acid bacteria-fermented bran leachate at 24 h
2.2 醋酸发酵过程的总酸变化
图1 醋酸发酵过程总酸变化Fig. 1 Changes in total acidity during acetic acid fermentation
从图1可知，所有实验组醋酸发酵起始时总酸质量浓度（以乙酸计）为5.0 g/L左右，随着醋酸发酵的进行，总酸逐渐升高，到第6～8天时达50.0 g/L左右。与对照组相比，罗伊氏乳杆菌L-05和桥乳杆菌L-09强化组的产酸速率相似，但嗜酸乳杆菌L-10、发酵乳杆菌L-03和植物乳杆菌L-04强化组的产酸速率较慢，这可能与嗜酸乳杆菌等乳酸菌能产生细菌素、类细菌素和过氧化氢等抑菌物质有关[19-21]。
2.3 液态发酵米醋的有机酸组成
表4 液态发酵米醋的有机酸组成Table 4 Organic acid composition of rice vinegar
如表4所示，各组液态发酵米醋的有机酸组成均以乙酸为主。接种乳酸菌发酵的麸皮浸出液后，液态发酵米醋含有乳酸，另有少量琥珀酸、酒石酸和柠檬酸，基本不含草酸和丙酮酸。
2.4 液态发酵米醋的挥发性风味物质组成分析
图2 米醋代表性样品挥发性风味物质总离子流图Fig. 2 Total iron current chromatograms of volatile compounds in representative samples of rice vinegar
采用气相色谱-质谱联用仪对11 个米醋样品的挥发性风味物质进行检测，图2为其中3 个代表性米醋样品的总离子流图，可以看出在该检测条件下样品中的挥发性风味物质的分离度良好。
食醋中挥发性风味物质的种数和含量可以影响风味的复杂性[22-23]。与对照组相比，短乳杆菌L-02、发酵乳杆菌L-03、植物乳杆菌L-04和罗伊氏乳杆菌L-05强化组中酯类、醇类、酮类和含氮类挥发性风味物质种类明显更多，而其他乳酸菌强化组的挥发性酸类风味物种数则比对照组少（图3A）。
与对照组相比，除嗜酸乳杆菌L-10强化组外，其他乳酸菌强化组的挥发性风味物质总含量更高，这主要是由于酯类、醇类、醛类和酮类的含量升高导致，嗜酸乳杆菌L-10强化组的醇类物质含量升高，但酮类物质含量明显下降（图3B）。
图3 液态发酵米醋中挥发性风味物质种类（A）和含量（B）分布Fig. 3 Types (A) and contents (B) of volatile compounds in rice vinegar
如图4所示，从11 个食醋样品中共检测到了81 种挥发性风味物质，包括酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、酚类、醚类、烷类、含氮类和杂环类10大类，主要为酯类物质（27 种）和醇类物质（17 种）。 酯类物质中乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯和丁二酸二乙酯含量最高，它们能赋予食醋水果香气[24-25]；醇类物质中苯乙醇、异戊醇和2,3-丁二醇含量最高，苯乙醇具有玫瑰花香和蜜香，异戊醇具有醇味和涩味，2,3-丁二醇具有焦香和奶油香气[26]；乙酸是食醋中最重要的物质，也是最主要的挥发性酸类物质；苯甲醛是最主要的醛类物质，其具有杏仁香气[27]；3-羟基-2丁酮和2,3-丁二酮是两种最主要的酮类物质，都具有奶油香气[28-32]。
根据聚类分析结果（图5），11 个米醋样品可以被分为3 个大类，其中直接以麸皮浸出液与米酒混合接种醋酸菌进行醋酸发酵酿造的食醋被单独聚为一类，短乳杆菌L-02、发酵乳杆菌L-03和罗伊氏乳杆菌L-05强化组被聚为一类，其他乳酸菌强化组被聚为一类。
图4 米醋挥发性化合物组成Fig. 4 Composition of volatile compounds of rice vinegar
图5 米醋挥发性风味物质含量聚类分析Fig. 5 Cluster analysis of concentrations of volatile flavor compounds of rice vinegar
2.5 米醋感官评价结果
图6 米醋感官评分结果Fig. 6 Results of sensory evaluation of rice vinegar
如图6所示，所有米醋的色泽和体态得分均在20 分以上，视觉观察差异不大；但滋味和风味的得分有较大差异，罗伊氏乳杆菌L-05强化组得分最高，短乳杆菌L-02强化组得分次之，而未强化组乳酸杆菌的对照组BL的得分最少。这表明，乳酸菌强化能改善米醋的风味品质，其中强化罗伊氏乳杆菌L-05的效果最佳。
3 结 论
本研究将不同乳酸菌发酵麸皮浸出液后，将其与米酒混合并接种醋酸菌进行发酵酿造米醋。结果表明，不同乳酸菌发酵均能够增加米醋中乳酸含量，其中罗伊氏乳杆菌L-05和桥乳杆菌L-09强化组产酸速率比对照快；短乳杆菌L-02、发酵乳杆菌L-03和罗伊氏乳杆菌L-05强化能增加米醋的挥发性风味物质种类和含量。本研究为乳酸菌强化改善液态发酵米醋的风味提供了理论支持。
