不同酒龄传统绍兴黄酒的特征风味物质分析

赵培城，蔡际豪，顾赛麒，钱 斌，王 兰，吕 飞,，丁玉庭,

（1.浙江工业大学食品科学与工程学院，浙江 杭州 310000；2.绍兴国家黄酒工程技术研究中心有限公司，浙江 绍兴 312000）

陈酿是黄酒生产工艺中重要的过程之一，黄酒的陈酿时间也称为酒龄，是评价黄酒优劣的重要指标[1-2]。传统绍兴黄酒在陈酿的过程中发生大量的化学和物理变化，这些变化对于酒体的稳定性和协调性起关键的作用[3]。早期对黄酒陈酿风味的研究多集中于黄酒陈酿过程中还原糖、乙醇体积分数、游离氨基酸、总酸等基本理化指标的变化分析[4-6]。Xiang Wenliang等[7]对嘉兴喂饭酒贮存过程中理化指标总酸、还原糖、挥发酯、非糖固形物、游离氨基酸等变化进行分析，并对风味转化机理进行初探。随后气相色谱、气相色谱-质谱等技术及各种样品前处理方式开始广泛应用于黄酒挥发性组分的研究。江伟等[8]采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱对不同陈酿时间的黄酒进行挥发性化合物包括醇、酸、酯、醛、酚类共34 个物质进行全定量分析，并且对这些物质在陈酿过程中的变化规律进行研究。随着基于传感器的人工味觉和人工嗅觉在食品行业的应用，江涛等[9]使用Flash气相色谱型电子鼻对黄酒进行酒龄定量研究，建立了偏最小二乘回归模型判定酒样酒龄，可信度高。

当前，将风味物质的化学分析与感官评价相结合，尤其是滋味物质与黄酒感官特性的相关性研究鲜见报道。因此本实验采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术检测黄酒陈酿过程中挥发性风味物质，采用高效液相色谱法测定有机酸和游离氨基酸含量，同时对不同陈酿年份绍兴黄酒的气味和滋味进行感官描述性分析，结合SPSS应用主成分分析确定不同酒龄黄酒的特征香气物质和滋味物质。本实验为高质量的传统绍兴黄酒的酿造提供理论基础，保证传统绍兴黄酒的风味保真性与稳定性，对传统绍兴黄酒提升市场竞争力提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

传统绍兴黄酒（1、3、5、8 a与10 a陈），取自代表性绍兴黄酒厂家的不同陈酿酒缸中。每个年份各取3 批次，重复3 次，样本存放于－4 ℃冰箱中，于15 d内用完。

2-辛醇（色谱纯） 美国Sigma-Aldrich公司；氯化钠、磷酸氢二钾、异硫氰酸苯酯乙腈、三乙胺乙腈、酒石酸、苹果酸、丙酮酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、琥珀酸、半胱氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

E2695型高效液相色谱仪 美国Waters公司；HYJD超纯水器 杭州永洁达净化科技有限公司；FA2004型电子分析天平 常州市衡正电子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 挥发性风味物质测定

1.3.1.1 样品预处理

取10 mL各酒龄的传统绍兴黄酒，25 ℃、3 000 r/min离心20 min，处理好的黄酒样品待用[10-12]。

1.3.1.2 顶空固相微萃取

取5 mL完成离心的黄酒样品，放入20 mL顶空瓶，加入5 μL内标物（2-辛醇，质量浓度为89.65 μg/L），2.5 g氯化钠，萃取温度50 ℃，预热15 min，萃取时间40 min，解吸5 min（250 ℃），采用50/30 μm DVB/CAR/PDMV萃取头[13-15]。

1.3.1.3 气相色谱-质谱测定

色谱条件：DB-Wax毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：柱初始温度40 ℃保持5 min，以5 ℃/min上升至150 ℃，再以10 ℃/min上升至230 ℃，然后保持10 min。载气为高纯度氦气，流速1.0 mL/min，进样口温度250 ℃，进样方式为不分流进样[16-18]。

质谱条件：电子电离源；接口温度230 ℃；电子能量70 eV；离子源温度210 ℃；质量扫描范围30～550 u。

1.3.2 有机酸含量测定

1.3.2.1 样品预处理

取5 mL离心酒样至25 mL容量瓶中，用流动相定容到刻度，酒样需经0.22 μm混合纤维树酯膜抽真空过滤，直接进样[19]。

1.3.2.2 流动相配制

称取磷酸氢二钾10.88 g置于1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容，浓度为0.08 mol/L。通过磷酸调节pH值至2.80，在经0.22 μm混合纤维树酯膜抽真空过滤后使用[20]。

1.3.2.3 有机酸标准样配制

分别准确称取8 种有机酸置于50 mL烧杯中，用流动相溶解并定容配制成有机酸标样系列溶液及有机酸混合标准液，见表1。

表1 有机酸标准样品混合液Table 1 Concentration of mixed solution of organic acids

1.3.2.4 高效液相色谱条件

Kromasil 100-5 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.08 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值为2.80）；流速0.8 mL/min；进样量20 μL；检测波长215 nm；柱温30 ℃[21-22]。

1.3.3 游离氨基酸含量测定

1.3.3.1 样品预处理

取对照品混合溶液（半胱氨酸为1.25 mmol/L，其他16 种游离氨基酸浓度为2.5 mmol/L）或黄酒基酒样品50 μL，置于2 mL离心管中，加150 μL高纯水，再加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯-乙腈溶液100 μL、1 mol/L三乙胺-乙腈溶液100 μL，混匀。室温放置1 h后，加入400 μL正己烷，旋涡混合器振荡1 min，静置10 min。下层溶液经0.22 μm滤膜过滤后进样，进行色谱分析[23-24]。

1.3.3.2 高效液相色谱条件

Kromasil 100-5 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温38 ℃；二极管阵列检测器：检测波长254 nm；进样量10 μL；1 mL/min流速梯度洗脱；流动相及其梯度洗脱程序见表2[25]。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Mobile phase gradient program

1.3.4 感官描述

进行气味和滋味的感官描述性分析。气味包括醇香、酱香、曲香、酯香、米香、焦香、异香、协调和留香。滋味指标包括甜、酸、苦、鲜、辣、麻、涩、醇厚、绵延度和酒体。分值为0～5 分，5 分为对应特征最强，例如，气味的协调性，5 分非常协调，4 分较协调，3 分一般协调，2 分较不协调，1 分不协调，0 分极不协调[26]。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行主成分分析。气味特征分析将香气活力值大于1的挥发性风味物质与气味描述性感官评分进行主成分分析，再与不同年份绍兴黄酒气味成分得分散点图进行拟合，评价不同酒龄传统绍兴黄酒的优势气味特征。滋味特征分析将滋味活力值大于1的有机酸和游离氨基酸与滋味感官评分进行主成分分析，再与不同年份绍兴黄酒滋味成分得分散点图进行拟合，评价不同酒龄传统绍兴黄酒的优势滋味特征[27-30]。

2 结果与分析

2.1 传统绍兴黄酒气味特征分析

2.1.1 挥发性风味物质含量与香气活力值

图1 不同酒龄传统绍兴黄酒挥发性风味物质总量Fig. 1 Amount of various classes of volatile flavor substances in traditional Shaoxing rice wines of different ages

如表3所示，从不同年份传统绍兴黄酒中共检测鉴定出50 种主要挥发性风味化合物，其中主要包括16 种醇类、20 种酯类、7 种醛类、4 种酸类，3 种其他物质。

如表3所示，传统绍兴黄酒挥发性物质主要为醇类、酯类、醛类、酸类。醇类物质含量最高，1、3、5、8、10 a陈绍兴黄酒总醇类质量浓度分别为740.74、677.83、625.98、603.41、523.85 mg/L，其中β-苯乙醇和异戊醇在醇类中占比较大，1、3、5、8、10 a陈绍兴黄酒苯乙醇和异戊醇质量浓度分别为75.42、81.46、85.63、98.64、107.26 mg/L和94.34、85.58、73.84、64.18、52.44 mg/L，分别占醇类总量的10.1%～20.4%和12.7%～10.01%。传统绍兴黄酒检出20 种酯类物质，其含量也相对较高，其中1、3、5、8 a陈和10 a陈传统绍兴黄酒乳酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯的质量浓度分别为18.34、28.62、48.63、68.12、84.56 mg/L，38.35、42.28、44.36、41.22、48.12 mg/L和8.68、14.26、18.98、21.86、24.76 mg/L。1、3、5、8 a陈和10 a陈传统绍兴黄酒挥发性醛类物质物质总量分别为283.42、244.65、215.52、179.81、154.28 mg/L，比醇类物质含量低。相对含量较高的是苯甲醛、苯乙醛和糠醛。挥发性酸类物质的质量浓度较低，为39.42～68.81 mg/L，黄酒挥发性酸类物质中主要为乙酸和戊酸，质量浓度为10.24～25.83 mg/L和14.87～55.63 mg/L。表3中香气活力值大于1的挥发性风味物质主要有乙酸乙酯、己醇、异戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲醛、5-甲基糠醛、辛醇、戊酸、苯乙醛、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、γ-壬内酯和辛酸等。如图1所示，方差分析差异显着。挥发性醇类物质含量逐年下降，而挥发性酯类含量物质逐年增加，这和随着陈酿时间延长，部分挥发性醇类物质酯化形成挥发性酯类物质有关。同时挥发性醛类物质含量也是逐年下降，挥发性酸类物质变化较小。

2.1.2 气味描述性分析

图2 不同酒龄传统绍兴黄酒基酒气味感官评分Fig. 2 Sensory scores for smell of traditional Shaoxing rice wines of different ages

如图2所示，1 a陈和3 a陈传统绍兴黄酒醇香、酱香和曲香得分较高，高年份传统绍兴黄酒则在酯香、协调和留香得分较高，其他方面得分相差不大。

2.1.3 传统绍兴黄酒特征挥发性风味物质分析

图3 挥发性风味物质和气味描述分析主成分载荷图Fig. 3 PCA loading plot of volatile flavor and odor description

以15 个样本的香气物质的香气活力值、气味描述分析结果利用SPSS进行主成分分析，并与传统绍兴黄酒的年份联立。经过有限次剔除后，保留的成分有乙酸乙酯、己醇、异戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲醛、5-甲基糠醛、辛醇、戊酸、苯乙醛、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、γ-壬内酯和辛酸。提取的第1、2主成分的方差贡献率累计达到了87.56%，第1主成分构成的信息量占总信息量的77.59%，第2主成分占9.97%。

表4 不同酒龄传统绍兴黄酒有机酸含量与滋味活力值Table 4 Organic acid contents and taste activity values of traditional Shaoxing rice wines of different ages

表5 不同酒龄传统绍兴黄酒游离氨基酸含量与滋味活力值Table 5 Free amino acid contents and taste activity values of traditional Shaoxing rice wines of different ages

如图3所示，与第1主成分相关系数较大的化合物为乙酸苯乙酯、苯甲醛、乙酰基苯、糠醇、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、戊酸、异戊醇、辛酸乙酯、乳酸乙酯和5-甲基糠醛。其中，乙酸苯乙酯、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乳酸乙酯对样品的香气呈正相关且系数很大。结合图3可以看出，10 a陈的黄酒受乙酸苯乙酯、糠醇、苯乙酸乙酯和乙酸乙酯的影响较大，8 a陈的黄酒受乙酰基苯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、γ-壬内酯和己酸乙酯香气成分的影响较大。5 a陈黄酒样品与之对应的香气物质是辛酸。异戊醇和苯甲醛与3 a陈黄酒样品香气有关。苯乙醇、5-甲基糠醛、辛醇、苯乙醛和戊酸对1 a陈的黄酒样品有显着影响。由此看出，高低年份的传统绍兴黄酒在香气物质上有显着区别。结合感官描述性分析，5 个年份的传统绍兴黄酒基本区分开。其中低年份黄酒更为醇香、曲香，与苯乙醇、异戊醇和苯甲醛为主要特征风味物质有关，高年份黄酒更为酯香、留香和协调，与乙酸苯乙酯、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯和乳酸乙酯为主要特征风味物质有关。

2.2 滋味特征分析

2.2.1 有机酸与游离氨基酸含量与滋味活力值

从不同年份传统绍兴黄酒中共定量检测出7 种有机酸：醋酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸和丙酮酸。16 种游离氨基酸：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸。

如表4、5所示，传统绍兴黄酒中有机酸含量最高的为醋酸和乳酸，1、3、5、8、10 a陈传统绍兴黄酒中醋酸和乳酸质量浓度分别为627.84、662.0、715.9、725.5、713.2 mg/L和356.2、382.9、401.8、407.4、427.5 mg/L，含量随着陈酿时间延长逐渐增加，除了丙酮酸以外其他种类的有机酸含量则逐年减少。游离氨基酸中蛋氨酸与组氨酸的质量浓度较低，分别为7.4～19.0 mg/L和65.6～113.0 mg/L，其他种类游离氨基酸含量差别不大，质量浓度最多的为丙氨酸，为374.2～444.4 mg/L。1 a陈和10 a陈绍兴黄酒中游离氨基酸变化幅度最大的为蛋氨酸，10 a陈绍兴黄酒蛋氨酸含量比1 a陈减少了约60%。滋味活力值较大的有机酸和游离氨基酸分别为乳酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、组氨酸、酒石酸、天冬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和精氨酸。

2.2.2 滋味描述性分析

图4 不同酒龄传统绍兴黄酒滋味感官评分Fig. 4 Sensory scores for taste of traditional Shaoxing rice wines of different ages

如图4所示，1 a陈和3 a陈传统绍兴黄酒酸、鲜和辣的得分较高，高年份传统绍兴黄酒则在醇厚和绵延度的得分较高，而在其他方面分数相差不大。

2.2.3 传统绍兴黄酒特征滋味物质分析

图5 有机酸、游离氨基酸和滋味感官评分主成分载荷图Fig. 5 PCA loading plot of organic acids, free amino acids and sensory scores for taste

以15 个样本滋味活力值大于1的滋味物质和滋味感官评分利用SPSS进行主成分分析，经过有限次剔除后，保留的成分有乳酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、苏氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和酒石酸。如图5所示，提取的第1、2主成分的方差贡献率累计达到了91.32%，第1主成分构成的信息量占总信息量的79.25%，第2主成分占12.07%。

如图5所示，与第1主成分相关系数较大的化合物分别为乳酸、柠檬酸、天冬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。其中乳酸、柠檬酸、蛋氨酸、天冬氨酸和甘氨酸对样品的滋味呈正相关且系数较大。可以看出10 a陈的黄酒受柠檬酸、乳酸和蛋氨酸影响较大，8 a陈的黄酒受酒石酸、丙氨酸和天冬氨酸影响较大，5 a陈的黄酒受酪氨酸、苹果酸和精氨酸影响较大，3 a陈的黄酒受苏氨酸影响，苯丙氨酸、琥珀酸和异亮氨酸对1 a陈的黄酒滋味贡献度最大。结合感官评分分析，其中低年份黄酒更为甜、酸和辣，与琥珀酸和异亮氨酸为主要特征滋味物质有关，高年份黄酒更为醇厚、绵延与柠檬酸、乳酸和蛋氨酸为主要特征滋味物质有关。

3 结 论

不同年份传统绍兴黄酒挥发性风味组分共检测鉴定出50 种，其中主要包括16 种醇类、20 种酯类、7 种醛类、4 种挥发性酸类，3 种其他物质。利用香气活力值进行主成分分析不同年份传统绍兴黄酒的特征挥发性风味物质，其中10 a陈的黄酒受乙酸苯乙酯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯和辛酸乙酯的影响较大，8 a陈的黄酒受乙酰基苯、乳酸乙酯、γ-壬内酯和己酸乙酯香气成分的影响较大。5 a陈黄酒样品与之对应的香气物质为辛酸。异戊醇和苯甲醛与3 a陈黄酒样品香气有关。苯乙醇、5-甲基糠醛、辛醇、苯乙醛和戊酸对1 a陈的黄酒样品有显着影响。由此看出，高低年份的传统绍兴黄酒在香气物质上有显着区别。结合气味描述性分析，5 个年份的传统绍兴黄酒基本区分开。其中低年份黄酒更为醇香、曲香，与苯乙醇、异戊醇和苯甲醛为主要特征风味物质有关，高年份黄酒更为酯香、留香和协调，与乙酸苯乙酯、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯和乳酸乙酯为主要特征风味物质有关。测定7 种有机酸与17 种游离氨基酸，结合滋味活力值进行主成分分析，10 a陈的黄酒受柠檬酸、乳酸和蛋氨酸影响较大，8 a陈的黄酒受酒石酸、丙氨酸和天冬氨酸影响较大，5 a陈的黄酒受酪氨酸、苹果酸和精氨酸影响较大，3 a陈的黄酒受苏氨酸影响，苯丙氨酸、琥珀酸和异亮氨酸对1 a陈的黄酒滋味贡献度最大。结合滋味描述性分析，其中低年份黄酒更为甜、酸和辣，与琥珀酸和异亮氨酸为主要特征滋味物质有关，高年份黄酒更为醇厚、绵延，与柠檬酸、乳酸和蛋氨酸为主要特征滋味物质有关。传统绍兴黄酒风味差异的原因主要是陈酿过程中乙醇和其他少量的高级醇在贮存过程中与有机酸发生酯化反应，生成相关酯，各种酯又有其特殊的香味，同时陈酿过程中会有少量醇挥发，加上乙醇氧化、乙醛缩合以及乙醇与水的缔合作用，一系列复杂的氧化与还原作用，使风味物质之间产生差异。