黑木耳多糖/壳聚糖可食性复合膜的制备及对鲜牛肉的保鲜效果

秦丹丹，吴 琼，白 洋，曹慧馨，刘梦林

（长春大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130022）

随着人们生活水平的提高，对食品安全的要求也越来越高，食品的包装质量也引起了人们的关注。与传统的塑料包装膜相比，可食性包装膜因其具有无毒、无害、可生物降解性、可再生性和良好的生物相容性、阻气性和阻水性等优点成为食品包装领域的研究热点[1-3]。研究表明，可食性包装膜多以自然界中多糖类高分子物质为材料，如淀粉、维生素、海藻酸钠等。近几年，虽然以壳聚糖为材料制备可食性包装膜的研究很多，但单一的壳聚糖膜因其性能存在缺陷，限制了其在食品包装领域的应用。通过将功能化合物添加到壳聚糖中[4-5]，可以弥补单一壳聚糖膜的性能缺陷，提高膜的性能，生产出具有一定功能作用的可食性包装膜，使其更好地应用于食品包装领域。

黑木耳（Auricularia auricular）富含多糖、维生素及矿物质元素等多种功能性物质，是一种珍贵的药食兼用胶质真菌[6]。多糖是黑木耳中最主要的活性成分[7-9]，具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、增强免疫力等多种生理活性[10-14]。因此，将黑木耳多糖作为功能性物质添加到壳聚糖中，可以制备出一种环保、健康、安全、性能优良、抑菌、抗氧化、可降解的可食性包装膜。

冷鲜牛肉因其具有鲜嫩、美味、安全、卫生等优点而深受消费者喜爱。但0～4 ℃贮存并不能完全抑制脂质过氧化和微生物的生长，容易造成冷鲜牛肉在贮藏、运输、销售过程中发生腐败变质，导致营养价值降低、货架期变短，因此对冷鲜牛肉的保鲜具有重大意义。采用黑木耳多糖/壳聚糖（auricularia auricularpolysaccharide/chitosan，AAP/CS）复合膜对冷鲜牛肉进行包装，黑木耳多糖能够从膜包装材料中渗透进入食品，在食品表面保持一定浓度，可以缓解冷鲜牛肉在贮藏过程中的水分流失以及包装过程中汁液的流失，减少腐败菌和致病菌的繁殖，从而延长食品的货架期，保持其质量和感官特性。

本实验将黑木耳多糖作为功能性物质添加到壳聚糖中，通过流延法制备A A P/C S 复合膜，研究黑木耳多糖添加量对复合膜物理性能、机械性能、结构及抗氧化活性的影响，并用制备的复合膜、壳聚糖膜及聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚乙烯（polyethylene terephthalate/polyethylene，PET/PE）复合真空包装袋对冷鲜牛肉进行真空包装保鲜，模拟超市环境4 ℃条件下贮藏，对冷鲜牛肉进行感官评价、pH值、菌落总数及硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的测定，研究复合膜对肉品的保鲜效果，以期为黑木耳多糖的进一步研究及其在食品中的开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干黑木耳、牛肉（屠宰后的牛后腿精瘦肉）市售；平板计数琼脂培养基北京博星生物技术责任有限公司；壳聚糖（脱乙酰度≥95%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、丙二醛乙缩醛（纯度≥95%）上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯北京化工厂。

1.2 仪器与设备

UV-2700型紫外-可见分光光度计、Nicolet iS5型傅里叶变换红外光谱仪日本岛津公司；JJ-1BA型搅拌器常州润华电器有限公司；QJ210A型电子万能实验机上海倾技仪器仪表科技有限公司；DHP-9082型电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司；Jipad-20型拍打式无菌均质器上海旌派仪器有限公司；PHS-3C型pH计上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取

黑木耳多糖的提取采用Bao Honghui等[15]的方法，略有改进。称取已粉碎好的黑木耳粉末40 g，加入400 mL、体积分数80%乙醇溶液，70 ℃下浸提2 h，以除去黑木耳中低分子质量物质，过滤，将滤渣干燥后加入30 倍体积的蒸馏水，90 ℃浸提2 h，4 000 r/min离心20 min，收集上清液。向上清液中按体积比5∶1加入质量分数10%的三氯乙酸溶液除去蛋白，浓缩、醇沉，冷冻干燥后得到AAP。采用Wu Qiqiong等[16]的方法测定出AAP的分子质量为3.57×106Da。

1.3.2 AAP/CS的制备

将0.6 g CS溶于20 mL体积分数为2%的乙酸溶液中，磁力搅拌至完全溶解，得到CS溶液。将不同添加量（CS质量的5%、10%、15%、20%、25%和30%）的AAP溶于20 mL蒸馏水中，制得AAP溶液。将CS溶液与AAP溶液混合，并加入0.24 g甘油，50 ℃水浴搅拌30 min，制得AAP/CS复合膜溶液。取20 g复合膜溶液缓慢倒入直径为90 mm的塑料培养皿上，50 ℃干燥成膜。

1.3.3 复合膜理化性能测定

用螺旋测微仪测定厚度，每种膜选取5 个点，取平均值作为结果。

密度的测定采用孙彦峰等[17]的方法。

溶解度的测定采用Khoshgozaran-Abras等[18]的方法。

溶胀度的测定采用Mayachiew等[19]的方法。

不透明度的测定采用王坤等[20]的方法。

水蒸气透过率的测定采用GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法 杯式法》[21]的方法。

按照GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测定 第3部分：薄塑和薄片的试验条件》[22]，采用电子万能实验机测定复合膜的抗拉强度及断裂伸长率。

1.3.4 复合膜结构测定

将膜烘干剪碎后与溴化钾按质量比1∶100混合，研磨均匀后压片，在4 000～400 cm-1处进行傅里叶变换红外光谱扫描。

1.3.5 复合膜抗氧化性测定

将试样膜用2 g/100 mL的NaOH溶液浸泡1 h后，置于50 ℃烘箱中烘干至恒质量。取0.2 g干燥后的复合膜置于10 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L）中，室温避光静置24 h，在517 nm波长处测定吸光度（AS），并测定DPPH-乙醇溶液在517 nm波长处的吸光度（ADPPH）。根据下式计算膜的DPPH自由基清除率。

1.3.6 牛肉的保鲜实验

1.3.6.1 牛肉处理

在无菌条件下，将冷鲜牛肉进行均匀分割处理，分别用PET/PE复合真空包装袋、CS膜以及AAP添加量为30%的AAP/CS复合膜对冷鲜牛肉进行真空包装保鲜，于4 ℃条件下贮藏10 d，每隔2 d取样一次，对冷鲜牛肉进行感官评价，并测定肉品中pH值、菌落总数以及TBARS值。

1.3.6.2 感官评价

由10 名食品专业人员组成评定小组，参照GB/T 17238—2008《鲜、冻分割牛肉》[23]对冷鲜牛肉进行感官评定。感官评分标准见表1。

表 1 感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of beef

1.3.6.3 pH值的测定

按照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[24]对冷鲜牛肉的pH值进行测定。

1.3.6.4 菌落总数的测定

按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[25]对冷鲜牛肉的菌落总数进行测定。

1.3.6.5 TBARS值的测定

按照GB 5009.18—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》[26]对冷鲜牛肉的TBARS值进行测定。

1.4 数据统计分析

使用SPSS Statistics 20.0统计软件进行实验数据分析，结果以平均值±标准差表示，采用Duncan多重比较检验法进行显着性差异分析，P＜0.05表示差异显着，使用OriginPro 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 复合膜的理化性能测定结果

表 2 AAP添加量对复合膜厚度、密度、溶解度和溶胀度的影响Table 2 Effect of AAP content on thickness, density, solubility and swelling rate of composite films

从表2可以看出，AAP添加量的增加对复合膜厚度、密度、溶解度、溶胀度有显着性影响（P＜0.05）。这可能是因为AAP可以填补CS分子之间的间隙，使膜的结构更为紧密，从而导致复合膜的厚度和膜密度增加。复合膜的溶解度和溶胀度随着AAP添加量的增加而增加，可能是因为AAP含有大量羟基，具有较强的亲水性，导致水分子更易进入复合膜中，促进了膜的溶解和溶胀。

从表3可以看出，AAP添加量对复合膜不透明度、水蒸气透过率、抗拉强度和断裂伸长率都有显着影响（P＜0.05）。AAP本身具有颜色，AAP的加入使复合膜逐渐呈现土黄色，导致透明度逐渐降低。通常，水蒸气透过率取决于水分子在薄膜基质中的扩散率和溶解度。随AAP添加量增加，AAP/CS复合膜水蒸气透过率降低，一方面可能是AAP与CS之间的相互作用减少了它们中亲水基与水的相互作用；另一方面，AAP/CS复合膜密度增加，说明CS基质中的间隙空间减少，从而降低了水分子通过膜的扩散速率。同时随着AAP添加量的增加，溶液黏稠度增大，导致溶液流动性变差，抗拉强度增加，断裂伸长率降低。

表 3 AAP添加量对复合膜不透明度、水蒸气透过率、抗拉强度和断裂伸长率的影响Table 3 Effect of AAP content on opacity, water vapor permeability,tensile strength and elongation at break of composite films

2.2 复合膜的结构分析结果

图 1 复合膜的傅里叶变换红外光谱图Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of composite films

由图1可知，复合膜在3 424 cm-1处为—OH与—NH伸缩振动吸收峰，宽峰表明存在分子内和分子间氨键；在2 921 cm-1和2 850 cm-1处主要是C—H的伸缩振动吸收峰，1 629 cm-1处主要是酰胺C＝O伸缩振动吸收峰。AAP的添加使复合膜在1 401 cm-1处出现了新峰，这归因于AAP中C—O的伸缩振动，说明复合膜中AAP和CS发生了相互作用。复合膜在1 101 cm-1和621 cm-1处主要是CS的结晶敏感峰。

2.3 复合膜抗氧化性分析结果

图 2 AAP添加量对复合膜DPPH自由基清除率的影响Fig. 2 Effect of AAP content on DPPH radical scavenging capacity of composite films

由图2可知，随着AAP添加量的增加，DPPH自由基清除率逐渐增加。CS膜的DPPH自由基清除率为37.33%，当AAP的添加量上升至30%时，复合膜的DPPH自由基清除率为51.73%，是CS膜的1.39 倍。这表明复合膜具有较强的抗氧化性，可能是因为AAP中的羟基供氢能力较强，阻止了自由基之间反应的进行，从而使AAP/CS复合膜具有更高的DPPH自由基清除率。

综上，AAP添加量为30%的复合膜综合性能较好，该复合膜的水蒸气透过率最低，可以有效抑制食品中水分的散失，且具有最高的DPPH自由基清除率。后续实验采用AAP添加量为30%的AAP/CS复合膜对冷鲜牛肉进行真空包装。

2.4 肉品品质指标分析结果

2.4.1 感官评价

图 3 牛肉在不同包装材料中4 ℃冷藏条件下的感官评价Fig. 3 Sensory evaluation of beef packaged with different materials during storage at 4 ℃

由图3可知，随着冷藏时间的延长，不同包装材料中牛肉的感官得分逐渐减小，这与付丽等[27]的研究结果相似。牛肉在贮藏时期颜色的变化、腐败气味的产生以及状态的变差，主要是微生物生长和脂质氧化所致。在0～10 d冷藏过程中，PET/PE复合真空包装袋中的牛肉感官得分最低，其次是CS包装组，最后是AAP（30%）/CS包装组，这可能是因为AAP具有抗氧化活性和抑菌性，可以抑制微生物生长和脂质氧化，从而抑制冷鲜牛肉腐败变质，维持冷鲜牛肉感官品质和延长保质期。

2.4.2 pH值

由图4可知，随着冷藏时间的延长，不同包装材料中牛肉的pH值逐渐减小。牛肉pH值在宰前呈中性，宰后由于肌肉糖酵解作用使乳酸在肌肉中累积导致pH值减小[28]。在0～10 d冷藏过程中，PET/PE复合包装的牛肉pH值减小得最快，pH值从5.90减小到5.30（P＜0.05）；CS包装的牛肉pH值减小得较慢，pH值从5.90减小到5.60（P＜0.05）；AAP（30%）/CS包装的牛肉pH值从5.90增加到6.15（2 d）又减小到6.02（P＜0.05），这可能是因为CS在低pH值条件下发生降解反应，从而改变了牛肉表面的酸性环境[29]；另一方面可能是因为AAP渗透到冷鲜牛肉表面，有效抑制了冷鲜牛肉pH值的降低。但杨斌等[30]的研究结果与本实验结果略有不同，其发现纳米银酯化淀粉薄膜可以抑制冷鲜牛肉在贮藏期间pH值的增加趋势。这可能与肉的成熟有关，牛肉的pH值在屠宰后先降低后升高，本实验研究的是牛肉pH值因为糖酵解作用逐渐降低的过程，与刘伟[29]的实验结果相似。

2.4.3 菌落总数

图 5 牛肉在不同包装材料中4 ℃冷藏条件下的菌落总数Fig. 5 Total bacterial counts in beef packaged with different materials during storage at 4 ℃

由图5可知，随着冷藏时间的延长，不同包装材料中的牛肉菌落总数逐渐增加。经过10 d冷藏，PET/PE复合包装组牛肉的菌落总数从4.80（lg（CFU/g））增加到7.53（lg（CFU/g））（P＜0.05），增加了57%。贮藏前期PET/PE复合包装的牛肉在冷藏前期（0～2 d）菌落总数小于6.0（lg（CFU/g）），说明未变质[31]，这可能是因为真空包装组前期氧气浓度低，抑制了需氧微生物的生长和繁殖；CS包装组牛肉的菌落总数从4.80（lg（CFU/g））增加到6.58（lg（CFU/g））（P＜0.05），总量增加了37%，这可能是因为CS分子上带正电的氨基与带负电的微生物生物膜发生静电作用，从而抑制了微生物的生长繁殖[32]；AAP（30%）/CS包装的牛肉菌落总数从4.80（lg（CFU/g））增加到5.69（lg（CFU/g））（P＜0.05），总量增加了19%，这可能是因为AAP抑菌作用使AAP（30%）/CS包装的牛肉中微生物生长缓慢。经过10 d冷藏，只有AAP（30%）/CS包装的牛肉未变质。李天密等[33]发现CS/姜黄素/γ-聚谷氨酸可食性复合膜可以抑制培根和火腿贮藏过程中的菌落总数增加，与本实验结果相符。

2.4.4 TBARS值

图 6 牛肉在不同包装材料中4 ℃冷藏条件下的TBARS值Fig. 6 TBARS values of beef packaged with different materials during storage at 4 ℃

由图6可知，随着冷藏时间的延长，不同包装材料中牛肉的TBARS值逐渐增加，这与高晓冉等[34]的研究结果相似。经过10 d冷藏，PET/PE复合包装、CS包装、AAP（30%）/CS包装组牛肉的TBARS从0.12 mg/kg分别增加到2.54、1.44、0.45 mg/kg（P＜0.05）。Sheard等[35]发现，当新鲜肉类产品中TBARS值大于0.5 mg/kg时，消费者能感受到酸败的味道。经过10 d冷藏，只有AAP（30%）/CS包装的牛肉符合要求。这是因为AAP具有清除自由基的作用，进而抑制了脂质过氧化反应，减少了丙二醛的生成。

3 结 论

本实验将AAP与CS共混，以达到改善纯CS膜性能的目的。结果显示，与没有添加AAP的CS膜相比，加AAP后复合膜的厚度、密度、溶解度、溶胀度、抗拉强度均显着提高，水蒸气透过率显着降低，APP添加量为30%的AAP/CS复合膜DPPH自由基清除率达到了51.73%。说明AAP作为天然活性物质能很好地溶入CS膜中，制备出具有优良性能、高抗氧化活性的复合膜，适合用于食品包装。但是，添加30%的AAP会使复合膜的断裂伸长率和透明度降低，因此，还需继续优化AAP/CS复合膜的制备工艺，进一步提高其品质。

利用AAP/CS复合膜对冷鲜牛肉进行真空包装处理，结果显示，相较于PET/PE复合真空包装袋和CS膜，AAP/CS复合膜明显降低了牛肉贮藏过程中菌落总数及TBARS值，延缓了牛肉贮藏过程感官品质和pH值的降低。说明AAP/CS复合膜对冷鲜牛肉保鲜具有良好的效果。