基于液相色谱-气相色谱联用测定巧克力中的饱和烃与芳香烃矿物油

谢尧卿，刘玲玲，李冰宁，欧阳杰，武彦文,*

（1.北京市科学技术研究院北京市理化分析测试中心，北京市食品安全测试工程技术研究中心，北京 100094；2.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

矿物油主要来源于石油，包括石油经过物理分离（如萃取、蒸馏）和/或化学转化（如裂解、氢化、烷基化）等炼制的各类石化产品，以及煤、天然气、生物质合成的工业油。矿物油的化学类型复杂，主要包含由直链、支链和环状烷烃组成的饱和烃矿物油（mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH）以及高度烷基化（通常含1～5 个苯环）的芳香烃矿物油（mineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH）[1-4]。食品中的矿物油污染相当普遍，原因是矿物油可以从原料种植、生产加工、包装运输和环境污染多个途径迁移至食品[1,5-8]。欧洲安全局（European Food Safety Authority，EFSA）规定食品中的矿物油为工业来源的C10～C50碳氢化合物[1]。研究发现MOSH是人体内含量最高的污染物，其中C16～C35部分容易蓄积在脂肪组织、淋巴结、脾脏和肝脏中形成微型肉芽肿，含3 个以上苯环的MOAH有致癌和遗传毒性等[1,9-10]。由于矿物油涉及领域广泛，各国目前尚未出台限量标准。不过，矿物油对人体健康有风险，值得关注。

矿物油与油脂互溶，油脂及其含油食品尤其容易受到污染，其中食用油的污染最为严重，因此国际上首先推荐了食用油中矿物油的分析方法[11-12]。研究表明，巧克力中也普遍含有矿物油，Grob等[13]发现巧克力含有高达270 mg/kg的矿物油，其主要来源于包装可可豆的麻袋，原因是麻袋制作需要用软麻油调理纤维，软麻油的主要成分就是矿物油。近年来，部分市场调查中也发现巧克力中普遍含有矿物油[14]。不过，巧克力样品的基质复杂，净化困难；同时现有方法的灵敏度过低，定量限（limit of quantification，LOQ）为5 mg/kg[14]。因此，有必要从提高净化与灵敏度两方面进行改进。课题组以银离子固相萃取柱（Ag+-SPE）净化结合大体积进样-气相色谱建立了巧克力中MOSH的测定方法[15-16]；后续发现，Ag+-SPE难以有效分离MOSH和MOAH两部分，无法获得低含量的MOAH部分[17-20]。

本实验基于液相色谱-气相色谱（on-line liquid chromatography-gas chromatography，LC-GC）联用系统建立巧克力中MOSH和MOAH的测定方法。LC-GC的优势是将LC的净化与气相色谱-氢火焰离子化检测器（gas chromatography-hydrogen flame ionization detector，GC-FID）的测定在线联用，LC的硅胶柱可以吸附油脂，同时分离MOSH和MOAH，然后通过阀切换、保留间隙与溶剂排空阀组成的接口，将LC洗脱流出的MOSH和MOAH全部转入GC分析，真正实现了全样品分析，最大程度地提升了分析方法的灵敏度[21]。不过，LC无法分离MOAH与烯烃，一些巧克力中含有过量天然烯烃会干扰MOAH测定。已有文献报道采用环氧化反应去除食用油中的烯烃[22-23]。本研究尝试采用该方法净化巧克力样品中的烯烃，通过优化环氧化反应条件，最终建立巧克力中MOSH和MOAH的准确测定方法后完成样品分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巧克力购于北京当地的实体超市与京东网上超市。

正己烷、二氯甲烷、无水乙醇（均为色谱纯）美国Fisher Scientific公司；间氯过氧苯甲酸（3-chloroperbenzoic acid，m-CPBA） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；硫代硫酸钠 国药集团化学试剂有限公司。

标准品：液体石蜡、正十一烷（C11）、正十三烷（C13）、环己基环己烷（cyclohexylcyclohexane，Cycy）、5α-胆甾烷（5α-cholestane，Cho）、戊基苯（pentylbenzene，5B）、1,3,5-三叔丁基苯（1,3,5-tri-tertbutylbenzene，TBB）、1-甲基萘（1-methylnaphthalene，1-MN）、2-甲基萘（2-methylnaphthalene，2-MN）、苝（perylene，Per）以及C7～C40正构烷烃混合标准品均购自美国Sigma-Aldrich公司。其中C11和5B分别用于MOSH和MOAH部分的挥发损失考察；Cycy和2-MN分别为MOSH和MOAH的定量内标；C13和1-MN用于考察内标物Cycy和2-MN的响应信号的准确性；此外，Cho、TBB和Per用于监控LC分离情况，它们分别为MOSH流分的末端，MOAH的开端与末端标记物。

分别配制10、25、50、100、150、200、300 mg/mL的系列m-CPBA乙醇溶液；配制100 mg/mL硫代硫酸钠溶液；配制9 种MOSH/MOAH混合标准溶液（溶剂是正己烷和/或甲苯），其中C13的质量浓度150 mg/L，C11、Cycy、5B、TBB、1-MN和2-MN的质量浓度为300 mg/L，Cho和Per的质量浓度为600 mg/L；配制100 mg/L的C7～C40正构烷烃混合标准溶液；配制2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、100.0 mg/L的润滑油（MOSH∶MOAH 85.5∶14.5）系列溶液。

1.2 仪器与设备

LC-GC联用仪（包括配备二元泵和UV检测器的LC 20A液相色谱仪，带有FID的GC 2010 plus气相色谱仪） 日本Shimadzu公司；LC-GC接口 德国Axel Semrau公司；PAL自动进样器 瑞士CTC公司。

SQP分析天平 赛多利斯科学仪器北京有限公司；KQ-800KDE高功率速控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水设备 美国Millipore公司；ZFD-A5040电热鼓风干燥烘箱 上海智城分析仪器制造有限公司；HY-5A回旋式振荡器 江苏荣华仪器制造有限公司；R-100旋转蒸发仪 瑞士步琪有限公司；Biofuge Primo R, Megafuge离心机 美国Thermo公司；F-7000荧光分光光度计 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 仪器条件

LC条件：进样量100 μL，Allure Si色谱柱（250 mm×2.1 mm，5 μm，60 Å，美国Restek公司）；流动相为正己烷与二氯甲烷混合溶剂，以0.3 mL/min梯度洗脱；洗脱程序：0～1.5 min为正己烷，1.6～6.2 min为70%正己烷+30%二氯甲烷；待试液中的MOSH（2.0～3.5 min）和MOAH（4.5～6.0 min）全部流出后，LC运行反冲程序以再生色谱柱，设定二氯甲烷以0.5 mL/min流速在6.3～15.2 min反冲。LC运行过程的流动相变换与MOSH/MOAH流出通过紫外检测器（230 nm）监测。

LC-GC接口：经LC净化、分离后分别得到450 μL的MOSH和MOAH。两段流分通过阀切换（瑞士Vigiag公司），以氢气为载气被导入GC分析。GC仪器配备了由预柱（Restek MXT无涂层毛细管预柱，10 m×0.53 mm）和分析柱（Restek MXT毛细管柱，15 m×0.25 mm，0.25 μm）组成的2 个平行通道。MOSH和MOAH各自进入一个通道，预柱与分析柱之间通过三通与溶剂排空阀连接。溶剂排空阀在LC流分阀切换前0.5 min开启，转移结束后0.3 min关闭。转移到GC系统的MOSH和MOAH中大部分溶剂通过溶剂排空阀去除，剩余少量溶剂与浓缩的溶质聚集在分析柱入口，进行后续GC分离和测定。

GC条件：程序升温的初始温度60 ℃（保持6 min），以15 ℃/min升温至120 ℃，再以25 ℃/min升温至370 ℃（保持6 min）。FID温度为380 ℃；辅助气、燃烧气和助燃气分别为氮气、氢气和空气，流速分别为30、40、400 mL/min。

1.3.2 样品提取与富集

同一巧克力产品2～3 份，全部取出并研磨均匀；称取5 g置于离心管中，分别加入30 μL的9 种MOSH/MOAH混合标准溶液，加入10 mL正己烷于60 ℃超声提取20 min，离心至固液分离；吸取上清液2 mL过硅胶柱（将6 g活化硅胶装入玻璃注射器中），以25 mL混合溶剂（80%正己烷+20%二氯甲烷）洗脱；收集洗脱液至梨形瓶中，旋转蒸干浓缩至1 mL左右。

1.3.3 环氧化反应

取1.3.2节浓缩液1 mL，加入0.25～1 mL的m-CPBA溶液（200 mg/mL），振摇反应15 min，然后加入2 mL硫代硫酸钠溶液（100 mg/mL）和0.5 mL无水乙醇终止反应，振荡均匀后静置，吸取0.5 mL正己烷层至样品瓶（瓶中预先加入少量无水硫酸钠除去水分）用于后续测定。

1.3.4 LC-GC测定

按照1.3.1节条件测定样品试液中的MOSH和MOAH含量。通过观察LC部分UV检测器的响应信号考察LC流动相与MOSH/MOAH分离情况；考察C13和Cycy的峰面积比例是否接近1∶2，1-MN和2-MN的面积是否接近1∶1；积分计算MOSH和MOAH鼓包峰的面积，包括画基线、勾勒鼓包峰轮廓、扣除上端尖峰以及面积的积分计算；最后分别以Cycy和2-MN为内标物计算MOSH和MOAH的含量。

1.3.5 方法学考察

以1.3.1节条件配制润滑油系列溶液，以MOSH和MOAH的峰面积及其对应质量浓度绘制工作曲线，考察矿物油的线性范围。LOQ由进样质量浓度与FID检测鼓包峰的经验值计算得出[18]。准确度考察通过测定添加10、50 mg/kg润滑油溶液的巧克力样品，每个添加水平平行测定6 次，计算MOSH和MOAH的回收率及其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.4 数据处理

使用Lab solution软件进行数据处理。基于内标中的Cycy和2-MN定量计算MOSH和MOAH的含量，采用Excel 2016、Origin 2016进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 提取与富集方法的确定

矿物油为非极性混合物，易溶于非极性或弱极性溶剂中。为了避免溶剂更换，简化实验操作，有必要保证提取、净化与测定溶剂的一致性，本实验选择正己烷作为提取溶剂。通常，升高温度可以提高提取效率。考虑到矿物油目标物为C10～C50烃类化合物，高温会造成低沸点物质损失，因此，确定提取温度为60 ℃。此外，考察提取次数发现，第2次提取的矿物油含量仅为第1次的5%以下，因而确定提取次数为1 次。通常，整块巧克力的矿物油污染并不一定均匀。为了保证样品的均匀性和代表性，本实验将全部包装样品均质后取样。最终确定巧克力的提取方法为：分别取同一巧克力产品的2～3 份（包装），全部取出并研磨均匀或均质；称取其中的5 g样品，加入9 种MOSH/MOAH混合标准溶液和10 mL正己烷，于60 ℃超声提取20 min。

矿物油与脂肪互溶，提取矿物油的同时，样品中的大部分脂肪也一并溶出，因此，需要考虑提取液中的脂肪含量。由于LC-GC仪器中LC硅胶柱的吸附容量为20 mg甘油三酯，因而一般控制进入LC柱中的油脂不超过15 mg。通常，LC-GC仪器测定进样量为50～100 μL，巧克力中的脂肪质量分数约为30%，5 g巧克力提取液中的脂肪超过了LC柱的承载量。因此，必须增加去除脂肪的步骤。本实验自制硅胶固相萃取柱，大约可去除0.5 g脂肪，方法是将6 g经马弗炉活化（400 ℃）的硅胶装入玻璃注射器（弃去内管与针头），轻轻敲实后，以正己烷平衡；然后取2 mL提取液上样，以25 mL由80%正己烷+20%二氯甲烷组成的混合溶剂洗脱，收集洗脱液至梨形瓶中，旋蒸浓缩至1 mL左右。

2.2 环氧化反应条件考察

不同样品基质对矿物油造成的干扰不同，因而矿物油分析与样品基质密切相关，例如油茶籽油等食用油中含有大量干扰MOSH的奇数碳正构烷烃，需要用活化氧化铝净化[15,24-25]。一些巧克力中含有大量的烯烃，这些烯烃可能包括角鲨烯、甾烯和胡萝卜素等[22]。由于烯烃的极性与MOAH接近，LC-GC分析中LC柱无法分离烯烃与MOAH，导致MOAH的GC谱图干扰严重（图1A和图2A）。为了解决这个问题，Biedermann和Grob首先提出环氧化反应。该反应通过间氯过氧苯甲酸（m-CPBA）与烯烃反应生成极性较强的环氧化产物，使其保留在LC硅胶柱上，MOAH部分照旧洗脱流出，从而达到分离MOAH与烯烃分离的目的。不过，这个反应的条件需要低温（0 ℃）并以二氯甲烷为溶剂，存在溶剂转换与反应程度较难控制等问题[22]。为了控制反应速度、简化操作步骤，便于实现自动化，Nestola等[23]提出以乙醇替代二氯甲烷减缓反应速度，使得反应温度升至常温；同时，终止试剂由碳酸钠改为硫代硫酸钠。但此方法仅考察橄榄油、葵花籽与棕榈油等植物油[23]，是否适用于其他样品基质尚待研究。

图1 巧克力（可可脂）环氧化反应前（A）、后（B）的效果Fig.1 Chromatograms of chocolate (cocoa butter) before (A) and after (B) epoxidation

图2 巧克力（代可可脂）环氧化反应前（A）、后（B）的效果Fig.2 Chromatograms of chocolate (cocoa butter substitute) before (A)and after (B) epoxidation

巧克力样品的基质比食用油复杂得多。预实验表明很多样品存在烯烃干扰，如果烯烃的干扰影响到MOAH积分计算（图1A和图2A），则需要净化去除。本实验考察不同样品的烯烃含量及其环氧化反应条件。结果发现烯烃干扰情况与巧克力的组成密切相关。巧克力有可可脂和代可可脂之分，通常代可可脂的烯烃干扰严重，必须净化去除；可可脂中烯烃含量相对较低，如黑巧克力中可可脂含量较高，一般质量分数高于60%，其虽然含有烯烃，但含量较低，不干扰MOAH测定，无需环氧化反应；不过，当可可脂质量分数低于50%时，则大都需要通过环氧化反应除去烯烃，否则无法对MOAH积分计算。环氧化实验表明：不同烯烃含量的样品需要不同的m-CPBA参与反应，低可可脂样品需要50 mg的m-CPBA即可反应完全（图1B），而代可可脂则需要200 mg才能反应完全（图2B），继续增加m-CPBA，MOAH谱图不再发生变化，说明样品中烯烃反应比较完全。研究表明，食品中的烯烃通常为角鲨烯、胡萝卜素和甾烯，其中角鲨烯最容易与m-CPBA发生反应，其次是胡萝卜素和甾烯[22]。因此，不同组成的样品需要适当调整反应条件。

2.3 方法学考察

将系列质量浓度的润滑油溶液注入LC-GC分析，分别以MOSH和MOAH的鼓包峰面积与对应质量浓度绘制曲线，得到线性范围分别为1.7～85.5 mg/kg（MOSH部分）和0.5～14.50 mg/kg（MOAH部分），对应的标准曲线分别为y=106x－859 779和y=818 880x－254 169，R2=0.998，说明线性关系良好。

本方法的LOQ根据进入FID的矿物油质量确定。经验表明，FID对矿物油鼓包峰的灵敏度仅为单体化合物尖峰的1%，通常至少需要50 ng矿物油进入FID才能满足定量分析的不确定度要求[21]。本实验取5 g巧克力，以10 mL正己烷提取，取其中的2 mL提取液富集、浓缩至1 mL（1/5），环氧化反应后注入LC-GC分析，进样体积为100 μL（1/10），计算LOQ，相当于0.1 g巧克力进入FID检测，因此LOQ为0.5 mg/kg。

准确度以巧克力样品中添加润滑油溶液的回收率进行考察。分别以10、20、50 mg/kg三个水平（MOSH和MOAH总量）添加至巧克力中，平行测定6 次，结果表明：MOSH部分的加标回收率为84.2%～93.8%，RSD为1.58%～7.01%；MOAH部分的加标回收率为80.3%～86.0%，RSD为3.61%～8.22%，说明该测定方法的准确度满足检测要求。

2.4 实际样品分析结果

本实验对购买的28 个巧克力产品进行了检测。其中有8 个样品（2 个为铝箔包装，6 个为铝塑复合包装）中的MOSH和MOAH含量低于LOQ值；其余20 个样品检出MOSH，有1 个样品检出了MOSH和MOAH（表1）。总体来看，巧克力样品中MOSH的含量范围为1.83～22.23 mg/kg，平均值为7.28 mg/kg。与2012年EFSA和2015年“Food Watch”的调查数据相比[1,14]，我国巧克力中的矿物油含量范围相对较窄，但平均含量却与国外数据相近，均低于10 mg/kg；其中1 个样品检出MOAH，考虑到MOAH的毒性，值得特别关注。

表1 市售巧克力中矿物油的分析结果Table 1Contents of MOH in commercial chocolate products

此外，市售巧克力的包装材料主要有铝箔、塑料和铝塑复合材料3 种。本次购买的铝箔装巧克力均未检出矿物油；收集的22 个铝塑包装产品中有6 个未检出，其余的均检出MOSH，其中1 个还检出了MOAH。对比不同包装材料的检出情况，塑料包装产品中的MOSH含量为1.83～6.60 mg/kg，铝塑复合材料的含量为2.26～22.23 mg/kg，包装材料与矿物油含量没有显着相关性。前期研究表明奶粉中的脂肪含量与矿物油呈正相关[26]，而各巧克力产品的脂肪含量相近，因此也没有显现出相关性。此外，本实验还比较了夹心与非夹心两类巧克力，其中夹心样品的平均含量为10.84 mg/kg（11 个样品），而非夹心的为4.37 mg/kg（9 个样品），说明夹心产品比非夹心的更易受到污染，这可能与夹心巧克力的工艺复杂度和增加配料相关。

由样品分析谱图可知不同巧克力的矿物油污染来源并不相同。图3为两个巧克力的矿物油谱图，从碳数范围看，样品1的碳数范围在C26～C50之间，中心碳位置大致为C33（图3A）；而样品14的碳数范围在C20～C40之间，中心碳为C27。说明2 种巧克力可能来自不同的白油或润滑油产品。由于不同巧克力的原料、生产工艺不同，仅从碳数范围和谱图特征并不能够明确矿物油迁移途径[1]。图4是唯一检出MOAH的巧克力样品（样品10），其MOSH和MOAH的碳数范围均小于C24，因此可能是空气污染或油墨扩散迁移所致[1,27-29]。此外，相当多的样品分析谱图出现了聚烯烃低聚饱和烃（polyolefin oligomeric saturated hydrocarbons，POSH）的特征峰，特别是塑料包装产品（图3A）[30]，说明塑料制品迁移的POSH非常普遍。

图3 样品1（A）和样品14（B）巧克力的MOSH谱图Fig.3 LC-GC chromatograms of MOSH in ch ocolate samples 1 (A) and 14 (B)

图4 巧克力（样品10）中MOSH（A）和MOAH（B）的谱图Fig.4 LC-GC chromatograms of MOSH (A) and MOAH (B) in chocolate sample 10

3 结 论

本实验提出基于LC-GC准确测定巧克力中MOSH和MOAH的方法，包括优化提取方法，确定除烯烃干扰的环氧化反应条件。与已有的方法相比，本方法的LOQ为0.5 mg/kg，从而实现了低含量MOAH的检测目的。实际样品分析发现，部分巧克力中含矿物油，特别是MOSH污染比较普遍，其中夹心巧克力的污染普遍高于非夹心产品；谱图特征显示中塑料包装迁移的POSH非常普遍，由于POSH与MOSH无法分离，因此，巧克力中MOSH结果是这两种饱和烃的总量。