卫春会，甄 攀，张兰兰，任志强，黄治国，邓 杰,
（1.四川轻化工大学 酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；2.山西杏花村汾酒厂股份有限公司，山西 汾阳 032205）
汾酒是清香型白酒的典型代表，汾酒入口绵、落口甜、尾味余香、回味悠长的特色与其采用传统的地缸固态分离发酵和清蒸二次清工艺有关[1-2]。但是，传统汾酒开放式的生产方式导致了汾酒发酵过程中微生物极其复杂的变化，微生物来源多种多样[3]。甄攀等[4]研究了汾酒酿造微生物的来源，发现汾酒酒醅中微生物主要来自于酿造场地的空气以及生产器具。韩莎等[5]通过可培养技术分析汾酒酿造过程中微生物群落结构，并找出微生物种群与代谢物之间的关系。Xiao Ran等[6]基于核糖体高通量测序分析汾酒发酵过程中的微生物，认为汾酒发酵过程中主要细菌主要是乳杆菌科，真菌主要是酵母科（Saccharomycetaceae）和复膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae）。雷振河[7]通过高通量测序手段分析清香型白酒地缸中心与边缘位置酒醅微生物种群结构差异。王雪山等[8]利用高通量测序技术分析不同层次清香型白酒酒醅中微生物种群结构及演替规律，共检测到161 个细菌属和161 个真菌属，其中乳杆菌属（Lactobacillus）、毕赤酵母属（Pichia）和假丝酵母属（Candida）是酒醅中的绝对优势微生物。不同层次酒醅微生物多样性变化规律不同，而且微生物种群结构及演替规律存在明显差异。目前，国内对清香型白酒酿造微生态的研究多数是针对发酵过程中酒醅微生物种群演替。不同阶段酒醅微生物存在很大的差异，从而造成了不同层次的白酒风味特征，因此，研究汾酒发酵微生物群落种类和发酵规律，对提高汾酒品质有重要理论支撑作用。
微生物传统研究方法主要是菌种分离。随着技术的进步，近几年开始运用分子生物学方法对微生物进行研究，如变性梯度凝胶电泳技术、单链构象多态性、温度梯度凝胶电泳技术、基因文库法和荧光原位杂交技术等[9-12]。传统的菌种分离只能对少数能分离的菌种进行研究，对低频突变检出的敏感性不高，周转时间长、工作量大。相较于此方法，高通量测序技术在微生物群落结构的研究具有明显的先进性，作用位点不断增加，从单个基因分析到多基因分析，具有准确定量、读长长、实时检测等优势[13-14]。
高通量测序技术已经运用于多种分子生物学领域[15-16]，但在汾酒酿造微生物研究中鲜有报道[17]。本研究运用高通量测序技术，对汾酒发酵过程中酒醅样品中的真菌菌落结构进行分析，以求找到发酵过程中的优势微生物；再结合酒醅营养成分、乙醇和主要香味物质的变化，分析优势微生物与营养消耗、物质生成之间的关系，建立一套以高通量测序技术为基准的探究汾酒微生物的方法，以期更加全面地解析汾酒发酵过程中真菌群落结构变化规律。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酒醅由山西杏花村汾酒厂提供：汾酒发酵过程酒醅材料，“大楂”指第1次发酵，“二楂”指第2次发酵。根据汾酒酒醅发酵过程中关键控制点的发酵时间取样，大楂：入缸材料（D0d）、4 d材料（D4d）、7 d材料（D7d）、10 d材料（D10d）、15 d材料（D15d）、21 d材料（D21d）、出缸材料（D28d）；二楂：入缸材料（D0e）、4 d材料（D4e）、7 d材料（D7e）、10 d材料（D10e）、15 d材料（D15e）、21 d材料（D21e）、出缸材料（D28e），选取材料为同一生产班组的同一批次材料，取样时选取地缸中心部位样品。
Premix ExTaqTMHot Start Version、DL2000 DNA Marker宝生物工程（大连）有限公司；蛋白酶K 德国Merck公司；溶菌酶 美国Sigma公司；琼脂糖、丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、去离子甲酰胺 美国Solarbio公司；引物由上海英潍捷基生物技术公司合成。
1.2 仪器与设备
水平电泳仪、凝胶成像分析系统、Thermal Cycler S1000聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司；X1R高速冷冻离心机、酶标仪 美国Thermo公司；MX-S型可调式混匀仪 美国赛洛捷克公司；L96G梯度型PCR仪 杭州朗基科学仪器有限公司；Illumina MiSeq PE300 美国Illumina公司；7890A-5975B气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；DB-WAX色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、2410高效液相色谱仪 美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 酒醅的理化分析
水分测定：采用热干燥法，取10 g酒醅在120 ℃干燥至质量恒定。
淀粉、乙醇、葡萄糖和麦芽糖测定：采用液相色谱法，准确称取50 g酒醅，用100 mL蒸馏水充分浸泡，过滤，取清液，然后色谱检测，流动相：0.002 mol/L H2SO4溶液；色谱柱：离子交换柱；检测器：示差检测器。
代谢产物检测：采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用法，准确称取50 g酒醅，用100 mL 60%乙醇溶液充分浸泡，过滤，取清液检测。色谱条件：进样口温度为230 ℃，载气He（99.999%）；恒流1.0 mL/min，分流比50∶1，进样量1 μL；采用程序升温：初始温度60 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至155 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。质谱条件：离子源温度为230 ℃，电离方式为电子电离源，电子能量为70 eV，扫描质量范围为20～500 u，溶剂延迟3 min。
理化分析利用Excel软件对数据进行整理，然后利用Origin 8作图。
1.3.2 真菌群落结构分析
酒醅总DNA的提取：十六烷基三甲基溴化铵法[5]，将提取的DNA加适量含10 ng/μL RNase的100 μL超纯水溶解，37 ℃孵育1 h，分装两管，置于－20 ℃保存备用。
真菌通用ITS1FI2（5’-GAA CCW GCG GAR GGA TCA-3’）和ITS2（5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’）用于真菌ITS序列的扩增，序列长度205 bp。PCR扩增体系为：模板DNA 100 ng，引物1和引物2各2.5 μL，Premix ExTaqTMHot Start Version12.5 μL，加ddH2O补至25 μL。PCR程序：98 ℃预变性10 s后进行33 个循环，每个循环包括98 ℃变性10 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s；最后一次循环72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[18-19]。
高通量测序：应用Illumina MiSeq PE300分析平台，得到的原始图像数据文件，并经碱基识别分析转化为原始测序序列[20]。
数据分析：对原始测序序列进行过滤、双端拼接，得到优化序列（Tags），将优化序列在97%的相似性水平下进行聚类，划分可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），并根据OTU的序列组成得到其物种分类[21]。利用Qiime软件和Mothur软件[22]进行微生物群落测序数据分析，对测序数据进行总体分析后，再利用Silva[23]数据库进行16S rRNA基因序列的比对，获得OTU分类，确定序列对应微生物的分类学地位和多样性分析，同时利用R语言进行样品间的主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）及作图[21,24]，利用Canoco5进行微生物多样性分析中物种与环境因子相关性分析（redundancy analysis/canonical correspondence analysis，RDA/CCA）及作图[25-26]。
2 结果与分析
2.1 汾酒酒醅中物质的消长规律
汾酒酒醅入缸发酵过程是一个在微生物作用下物质消长的过程，在这个过程中主要的营养消耗物有淀粉、还原糖、葡萄糖和麦芽糖。酒醅中的淀粉、糊精和糖类是酿酒所需要的主要碳源，酒醅中的淀粉被转化为葡萄糖、麦芽糖等还原糖类物质，还原糖类是微生物直接利用的碳源，可以通过糖酵解途径生成丙酮酸，然后进行发酵生成乙醇。水分是细胞的重要组成部分，也是汾酒固态发酵酒醅的主要控制指标之一；根据真菌主要作用产生的酒类主要成分有乙醇、乙酸乙酯和高级醇等，乙醇是酒醅发酵的主要产物，生成量是鉴定酒醅质量的主要指标，也是判断发酵是否正常的重要数据，乙酸乙酯是汾酒中的主要香味物质之一，汾酒中的高级醇主要包括正丙醇、正戊醇、异丁醇和丁二醇等。检测汾酒酒醅中的物质变化反映发酵过程的进展，也反映微生物检测时间点的物质基础。
由图1可见，发酵过程中，大楂酒醅在4～10 d水分含量快速上升，后水分含量稳定，二楂酒醅0～4 d水分含量增加明显，后缓慢上升。大楂酒醅的初始淀粉质量分数为30%左右，在4～10 d之间淀粉含量迅速下降，10 d后缓慢下降，第28天大楂酒醅淀粉为13%，大楂阶段利用淀粉17%左右；二楂酒醅的初始淀粉为13.5%左右，在0～4 d淀粉含量快速下降，后缓慢下降，第28天二楂酒醅淀粉为8%左右，二楂阶段利用淀粉5.5%左右。汾酒大楂发酵过程中，0～4 d酒醅内液化、糖化作用明显，大量的葡萄糖、麦芽糖生成，4～7 d葡萄糖、麦芽糖含量快速下降，说明微生物在快速消耗还原糖，进行发酵，7 d后，葡萄糖含量缓慢上升，麦芽糖含量较为平稳，汾酒二楂发酵过程中，0～7 d葡萄糖、麦芽糖含量迅速下降，7 d后含量较为稳定，说明大楂发酵的残余还原糖直接影响了二楂发酵变化规律。
图1 酒醅中主要营养物质变化规律Fig.1 The changes of main nutrients in fermented grains
由图2可见，在汾酒大楂发酵过程中，4～10 d进入乙醇主发酵期，含量迅速增加，后缓慢上升，说明4～10 d为酒醅产生乙醇的最重要时期，汾酒二楂发酵过程，入缸就进入快速发酵阶段，在0～4 d，乙醇含量迅速上升，后缓慢上升。乙酸乙酯在大楂发酵中，随着时间的延长，含量从无到有逐步上升，7 d后上升速率有所增加，第28天时能达到75 mg/100 g左右，二楂开始阶段乙酸乙酯产生速率较快，中期放缓，后期略有下降，第28天时能达到38 mg/100 g左右。高级醇的变化较为相似，都是在发酵前期产生速率较快，后期基本趋于平稳，在发酵10 d之后基本趋于稳定，二楂酒醅中高级醇含量达到35 mg/100 g左右，大楂酒醅中高级醇含量达到30 mg/100 g左右，二楂中的高级醇含量明显高于大楂，这是二楂酒醅产出的酒质不如大楂的重要原因之一。
图2 酒醅中微生物主要代谢物质变化规律Fig.2 Changes of main microbial metabolites in fermented grains
酒醅中的淀粉包括糊精和糖类，在大楂酒醅发酵的0～4 d中，淀粉相对稳定，糖类（葡萄糖和麦芽糖）有明显的增加，这可能是淀粉转化为糖的过程，这也是酒醅形成一个营养稳态的时期（有利于后期被利用），而7～10 d酒醅中淀粉、糖类含量迅速下降，这时乙醇含量明显增加，这是汾酒大楂酒醅乙醇发酵的主要时期；对于二楂酒醅，由于仅在大楂酒醅蒸馏酒后加入大曲然后进行入缸发酵，酒醅中的挥发性物质流出，而其余环境基本不变，酒醅入缸后迅速进入发酵期，但由于后期营养条件的限制，发酵放缓。综合可以看出，大楂相较于二楂进入发酵期稍晚，造成这样的原因可能是酒醅条件的差异。同时，大楂比二楂物质利用更高，产生乙醇和乙酸乙酯也较高，说明在这些物质产生阶段主要作用微生物比例也较高。
2.2 酒醅中真菌群落结构分析
14 个酒醅样品，经过过滤、拼接后共产生1 131 292 条Tags，平均每个样品产生80 852 条Tags，最多129 661 条Tags，最少36 942 条Tags。在97%的相似度水平下对Tags进行OTU划分后，基于Silva数据库对OTU进行分类学物种注释。酒醅样品Tags聚类共获得98 个真菌OTU，其中大楂98 个OTU，二楂93 个OTU。采用对测序序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们代表OTU数目构建曲线，即稀释性曲线[27-28]。当曲线趋向平坦时，说明测序数量合理，更多的数据量对于发现新的OTU贡献很小，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU[29]。因此，通过作稀释性曲线（图3），对测序深度评估。
图3 稀释曲线Fig.3 Rarefaction curves
为了在物种水平中更少占比出现在others中，在科分类学水平上对酒醅样品真菌物种组成及相对丰度进行统计分析，得到各样品中真菌科水平的分布情况（图4），在属水平对最优势的各属进行了统计分析（图5）。酒醅样本总共检测到29 个科的真菌，其中，大楂酒醅样品中Incertae_sedis、Saccharomycetaceae、Mucoraceae与Lichtheimiaceae是优势菌科，共占已知菌科的90.0%。二楂酒醅样品中Incertae_sedis、Pichiaceae、Saccharomycetaceae、Rhizopodaceae与Lichtheimiaceae是优势菌科，共占已知菌科的94.6%。而相对丰度最高的Incertae_sedis在大楂发酵时期，从0 d占比11.0%，至7 d上升至88.8%，后下降至50%左右，在二楂发酵时期，从0 d占比29.7%，至7 d上升至90.7%，后稳定在90%以上（除D21e为60%左右），说明该科真菌在二楂发酵时的生长繁殖速度明显高于大楂发酵时期。从二楂的样品中可以看出Candida随着发酵的推进，占比逐渐增加，到第15天样品的时期达到最高（94%），在后期发酵中略有下降；Pichia在发酵开始的样品中比例达到60%以上，随着发酵的推进，占比下降。从大楂样品中可以看出，Candida和酵母属（Saccharomycessp.）的占比呈现先上升后下降最后趋于稳定的态势，Candida在7 d占比最高，达到87%，Saccharomycessp.在4 d占比最高，达到41%，Pichia在大楂样品中随着发酵的推进占比逐渐下降，酿酒酵母（S.cerevisiae）在大楂样品中随着发酵的推进占比呈现先上升后下降的趋势。说明大楂酒醅发酵过程的主要优势菌为Candida、Saccharomycessp.、Pichia和S.cerevisiae，二楂酒醅发酵过程的主要优势菌为Candida和Pichia。
图4 大楂（A）和二楂（B）真菌结构及分布规律Fig.4 Fungal community structure and distribution in primary (A) and secondary (B) fermentation
图5 酵母的分布规律Fig.5 Yeast community structure and distribution
酵母是所有样品中的主要微生物，最少的70%，也是两个发酵过程差异性最大的微生物群体。发酵初期大楂样品和二楂样品的酵母结构相似，都是以Pichia为主，Candida其次，S.cerevisiae较少（Saccharomycetaceae包括S.cerevisiae和汉逊酵母（Hanseniaspora），而S.cerevisiae占比更高）；随着发酵的推进，大楂样品和二楂样品的酵母结构出现了较大的差异性，随着发酵的推进大楂样品中的Candida和S.cerevisiae均有所上升，在大楂发酵后期S.cerevisiae比例不低于20%，而二楂样品中Candida是主要优势菌，占比均超过60%（除21 d外均达到80%以上），S.cerevisiae比例最高的28 d也仅6%左右。综上可以看出大楂样品和二楂样品的酵母结构差异主要是Candida和S.cerevisiae的比例，这也可能是两楂生产产酒率差异的主要原因。
2.3 酒醅样品中的物质成分与微生物差异性和关联性分析
从酒醅样品中真菌群落结构出发，利用PCoA探究样品间存在的差异性；酒醅中的淀粉和糖为微生物生长和代谢提供了营养物质，微生物的代谢产物又影响其生存环境[30]，采用RDA/CCA分析探究酒醅中物质成分和微生物的关系。
如图6所示，大楂和二楂酒醅样品的真菌群落结构在发酵开始时（D0d和D0e）相似性高，随着发酵的推进到7 d以后大楂和二楂酒醅样品中的真菌群落结构在发酵开始出现较大的差异性。发酵过程中二楂酒醅样品的真菌群落结构与大楂7 d样品（D7d）真菌群落结构较为相似，大楂酒醅从发酵第10天（D10d）以后的样品真菌群落较为相似。如图7所示，大楂酒醅样品的真菌群落结构，4、10、21 d材料相似性高，0、7、15 d材料相似性低。而二楂酒醅样品的真菌群落结构，7、10、15、28 d材料相似性高，0、4、21 d材料相似性低。也就是说，汾酒发酵过程中，大楂和二楂真菌群落在发酵中后期有较大的差异性，其各自真菌群落在发酵中后期相对较为稳定。
图6 酒醅样品的PCoAFig.6 PCoA plot for similarity in fungal community structure in fermented grains
将群落结构信息作决策曲线分析，轴中梯度最长为2.43，大于1，小于3，选择对酒醅真菌菌落和酒醅中物质成分作RDA（图7），其分析结果蒙特卡洛检验值P值为0.10，PC1为56.7%，PC2为36.3%，二维成分占比达到93%。8 个物质因子（水分、葡萄糖、淀粉、麦芽糖、乙醇、高级醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯）全部用于进行关联性分析。
图7 酒醅中物质成分与真菌群落的关联性Fig.7 RDA analysis of correlation between fungal community structure and nutrients in fermented grains
通过酒醅中物质成分与真菌群落主要微生物的RDA结果可以看出，RDA样品真菌菌落的聚类与PCoA一致。3 个影响最大的微生物是S.cerevisiae、Pichia、Candida，影响大楂酒醅发酵后期最主要微生物是S.cerevisiae，影响二楂酒醅发酵最主要微生物是Candida，Pichia是发酵初期酒醅最主要微生物。发酵初期和大楂发酵后期酒醅中的营养物质（淀粉、葡萄糖和麦芽糖）和真菌群落结构呈正相关，说明营养越充分有利于该阶段真菌群落生长。而二楂酒醅中真菌群落与营养物质呈负相关，与高级醇和水分等物质呈正相关，这种相关性说明二楂酒醅中的物质成分（营养的缺乏）决定了其真菌群落结构与大楂的差异性。高级醇和乳酸乙酯含量与Candida有较强的正相关，乙酸乙酯和乙醇含量与S.cerevisiae呈正相关。
3 结论与讨论
本研究采用Illumina MiSeq测序方法，直接从汾酒发酵酒醅样品中扩增高变区进行测序，避免了采用培养方式研究微生物的多种局限性，客观还原了汾酒发酵过程中菌群结构及丰度的变化规律，为汾酒微生物应用研究提供了理论支撑。结果表明：在97%的相似度水平下，一共获得98 个真菌OTU；在科的分类水平下，大楂酒醅样品中Incertae_sedis、Saccharomycetaceae、Mucoraceae与Lichtheimiaceae是优势菌科。二楂酒醅样品中Incertae_sedis、Pichiaceae、Saccharomycetaceae、Rhizopodaceae与Lichtheimiaceae是优势菌科，三大酵母菌属（S.cerevisiae、Pichia、Candida）为发酵过程真菌的优势菌属；大楂酒醅样品的真菌多样性指数呈现先上升后下降的规律，而二楂酒醅样品的真菌多样性指数在入缸发酵时最高，随着发酵的进行，多样性指数逐步降低；大、二楂样品真菌群落结构发酵后期存在显着差异；从物质的消长角度可以看出，大楂酒醅产生乙醇的时期在4～10 d之间，产生酯类从4 d左右到发酵结束，而二楂从发酵开始就进入乙醇和酯类产生时期，在发酵10 d左右物质产生放缓。汾酒的两楂酒醅发酵过程真菌群落呈现较大差异性，结合酒醅中物质的变化和RDA可以推测这种差异性主要有两方面的原因：
一是营养物质的差异性。大楂在发酵过程消耗淀粉大约为17%，而二楂酒醅发酵过程仅消耗约5.5%，从糖类的消耗也可以看出大楂酒醅中的葡萄糖和麦芽糖含量在各个时期均高于二楂酒醅，同时大楂酒醅中的葡萄糖含量在整个发酵过程均高于1%，而二楂酒醅在发酵15 d左右葡萄糖就处于最低的水平（0.25%），后期可利用的葡糖糖很少，这些都说明二楂酒醅中的营养条件比酒醅匮乏，二楂中最主要的微生物是Candida（最少为D21e号样，达到61%），在营养匮乏的情况下以芽生孢子出芽繁殖，孢子伸长形成芽管，不与母体分离，形成较长的假菌丝，能够克服酒醅营养匮乏，这可能是该类酵母在二楂中高于其他酵母含量的重要原因。Saccharomycetaceae包括S.cerevisiae、Hanseniaspora、有孢圆酵母（Torulaspora）等，该类菌种在营养条件充足情况下有较强的产乙醇和产酯能力，所以该类菌在大楂酒醅中有较高的比例，这有利于酒醅产乙醇和产酯，据报道Hanseniaspora是清香型白酒中乙酸乙酯能力最强的菌种[31]，这可能是大楂乙酸乙酯明显高于二楂的重要原因。所以酒醅中营养物质的动态变化不仅间接反映乙醇的生成情况和发酵状况，而且可以特征反映发酵过程中微生物的生命活动状况，也就是酒醅的环境影响了微生物的群落结构。
二是酒醅环境条件的差异性。在二楂酒醅中酸度高于大楂酒醅，Candida有较强的耐受性，能在极端环境进行生长（微厌氧和高酸度），而Pichia的耐酸性和耐温能力较低，随着发酵的进行，酸度和温度的升高导致Pichia的比例下降，同时由于霉菌的厌氧的耐受性较差，所以在所有的酒醅中霉菌的比例较低。这种营养条件和环境条件的差异性可以下一步进行深入研究，结合微生物变化和工艺条件，可能为汾酒的发酵生产提供更有价值的信息。
大楂酒醅和二楂酒醅入缸后进入乙醇主发酵期有一定的时间差异性，大楂是在发酵4 d后进入乙醇的主发酵期，二楂是在入缸后进入乙醇的主发酵期，这种差异性可能主要是微生物和酒醅环境的影响，大楂酒醅入缸后由于是糊化后的粮食和曲混合，酒醅比较疏松，氧气含量充足，糖化速度快，底物浓度高，水分、温度、酸度比较适宜，酵母细胞出芽、裂殖成倍增加，酵母菌迅速达到峰值，通过该时期后迅速进入乙醇的主发酵期，而二楂酒醅是在大楂酒醅蒸馏酒后伴曲直接发酵，酒醅的黏稠度、酸度、水分和大楂初始发酵酒醅完全不同，此环境是对接入的大曲微生物进行筛选，同时环境的还原糖含量较高，有利于微生物利用，酒醅迅速进入乙醇的主发酵期，但是由于营养物质的缺乏，发酵10 d基本趋于平稳，生成的乙醇量仅为大楂酒醅的一半。在乙醇和高级醇的产生时期（大楂4～15 d，二楂0～10 d），Candida含量较高，该菌属鲜见有高产醇类的报道，关于Candida在汾酒酒醅主发酵期的作用是后期的一个研究点。
本研究解析了汾酒两楂酒醅发酵过程的真菌群落结构，找到了其差异性和差异的优势真菌属，同时推测了真菌群落结构差异原因和酒醅乙醇主发酵期差异性的原因，为汾酒的生产工艺优化和提高生产质量提供基础数据支撑。
