周丽丽，朱艳雯，姜晓霞，张 旋，檀德宏，刘 玲，白 冰*
（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）
血栓性疾病包括动脉粥样硬化、动脉血栓形成和深静脉血栓形成[1]，越来越多的患者受此类疾病的困扰。止血作为有效的生理防御机制能够保证血液在循环中正常流动，而止血障碍会加速血栓的形成[2]。除了血小板和凝血因子，凝血酶的激活和抑制在止血中也发挥了关键性作用[3]。凝血酶是一种损伤处血管内皮细胞产生的多功能蛋白酶，它参与凝血过程中各个关键性环节，主要将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，并与后者交联形成血栓[4-5]。目前，抗凝血研究通常围绕内源性抗凝血途径（活化时间凝血酶时间（activation time thrombin time，APTT））、外源性抗凝血途径（凝血酶原时间（prothrombin time，PT））、共同抗凝血途径（凝血酶时间（thrombin time，TT））以及降低纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）开展。口服抑制凝血酶的抗凝血药物（如华法林）是预防和治疗血栓的常用方法。但目前常用的抗凝血药物可能会带来出血等健康风险[6-7]。因此，寻找安全有效的抗凝血成分一直是人们关注的焦点。最新的研究表明大蒜苗能够通过改变APTT、PT、TT、FIB含量而发挥抗凝血作用[8-9]，揭示了葱属抗凝血活性的潜能[10]。
大蒜油是一种辛辣味的挥发油，具有多种生理活性，还有抗肿瘤[11]、抗癌[12]、抗动脉粥样硬化[13]、抗血栓[14]、抗糖尿病[15]、抗血小板聚集[16-17]、抗炎[18]、降血脂[19]等多种药理作用。大蒜油成分主要以硫醚类（二烯丙基硫醚（allyl sulfide，DAS）、二烯丙基二硫醚（allyl disulfide，DADS）、二烯丙基三硫醚（allyl trisulfide，DATS）为主，还包括少量的噻吩类阿霍烯类[20]等。以硫醚为代表的脂溶性硫化物在抗凝血方面的研究还鲜有报道。本研究从大蒜中分离提取大蒜油，通过紫外光谱、分子荧光光谱、动力学分析等探究大蒜油及其主要成分的抗凝血作用，旨在为大蒜油抗凝血功能的研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
48 只6～8 周龄SD大鼠，平均体质量为（220.0±4.5）g，由沈阳陆军总院动物实验室提供并饲养，使用许可证号：SYXK（辽）2018-0009。大鼠喂养及干预期间自由饮水，12 h/12 h明暗周期，动物房温度为（22±2）℃，相对湿度为（50±10）%。动物处理及饲养条件按照动物福利的相关规定及《中华人民共和国实验动物管理条例》和《实验动物质量管理办法》实施。
大蒜 沈阳农业大学农贸市场；凝血酶 安徽经科公司；凝血酶发色底物S2238 上海源叶公司；DAS、DADS、DATS 沈阳农业大学食品化学实验室；谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒、谷胱甘肽还原酶（glutathion reductase，GR）试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒、总蛋白（total protein，TP）定量试剂盒 南京建成研究所；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；F-4600荧光光谱仪 日本Hitachi公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；CA1500全自动血凝分析仪 日本SYSMEX公司。
1.3 方法
1.3.1 大蒜油的制备
参考文献[21]制备大蒜油。200 g大蒜加入200 mL蒸馏水，匀浆2～3 min并37 ℃搅拌4 h，令蒜氨酸酶与底物接触，使脂溶性硫化物充分形成。含有大蒜油的溶液进一步加热至沸腾，经冷凝管后形成油-水混合物馏出，静置分层取油相，得到大蒜油。
1.3.2 大蒜油气相色谱-质谱联用分析
地方政府官员微博不仅要及时公布自己的行程，让网民了解官员的日常生活状态，知道官员都干了些什幺，还要将自己职权范围内可以公开的所在机构的最新动向公布到微博上，使网民更好地了解这些部门的工作情况。在表达个人意见和观点的同时，官员要准确把握官员个人和公职身份之间的关系，避免发布与自身身份相冲突的个性化观点，特别要注意不能挑战社会常识和伦理底线。官员应了解民众的需求，敢说敢言，面对网友的质疑应积极应对，多做解释，尽量避免与网友的激烈争辩，在无法解决问题时，政府官员应主动“休战”，做到求同存异。
参考文献[22]，用乙酸乙酯溶液配制大蒜油剂量为10 µL/mL的混合液体，经0.22 µm过滤膜过滤后进行气相色谱-质谱联用分析。色谱柱：DB-17MS（30 m×0.25 µm）；进样量：1 µL；分流比：1∶50；进样口温度：250 ℃；检测器温度：250 ℃；载气：He（纯度99.999%）；流速：4.0 mL/min；电子轰击离子源：70 eV；离子源温度：30 ℃；四极杆温度：450 ℃；升温程序：90 ℃保持1 min后以13 ℃/min速率升温至250 ℃，保持3 min。
1.3.3 凝血酶活力测定
参考文献[23]测定凝血酶活力。大蒜油原液、DAS、DADS、DATS经2%（体积分数）乙醇溶液溶解，其中大蒜油原液分别稀释102、103、104倍，DAS、DADS、DATS分别制成浓度为1.0、2.5、5.0 mmol/L溶液，将上述液体分别与质量浓度为1 mg/mL的凝血酶溶液以1∶1（V/V）混匀，37 ℃放置30 min，作为酶处理液。
凝血酶活力检测体系（3 mL）：0.2 mL凝血酶发色底物S2238（1 mmol/L）、10 µL酶处理液，用0.1 mol/L pH 8.4 Tris-HCl缓冲液补足至3 mL，以10 s为间隔，记录405 nm波长处吸光度，吸光度越高，酶活力越强。
1.3.4 分子荧光光谱分析
凝血酶（4 mg/mL、0.2 mL）分别与大蒜油、DAS、DADS、DATS（5 mmol/L、0.2 mL）以1∶1（V/V）混匀，37 ℃水浴30 min，激发波长280 nm，扫描300～800 nm处的荧光光谱。
1.3.5 分子对接
1.3.6 动物分组和血液样本采集
参考文献[25-26]进行分组和注射操作。将大鼠随机分成6 组，每组8 只，包括空白组、对照组（橄榄油）、大蒜油组、DAS组、DADS组和DATS组。以100 µmol/（kgmb·d）剂量对大鼠连续3 d进行腹腔注射，第4天进行颈动脉采血，进行抗凝血指标（凝血四项）的检测，剩余血液样品于-80 ℃保存，用于抗氧化指标的测定。
1.3.7 凝血四项的检测
采用全自动血凝仪分析凝血四项（PT、TT、APTT、FIB质量浓度）：将0.3 mL浓度为1.109 mmol/L枸缘酸钠溶液与0.3 mL待测血液样品混合，10 000 r/min离心15 min，离心后取血浆检测凝血四项。
1.3.8 抗氧化指标测定
将血液样品以10 000 r/min离心10 min得到血清，分别用GSH、GR、TP、T-AOC试剂盒测定抗氧化指标GSH、GR、TP、T-AOC水平。
1.4 数据处理与分析
采用Origin 8.5软件绘图，采用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据采用平均值±标准差表示，结果进行正态性和方差同质性检验，采用t检验进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显着，P＜0.01表示差异极显着。
2 结果与分析
2.1 大蒜油气相色谱质-谱联用分析结果
如图1所示，大蒜油分别在6.5、8.5、10.3 min处存在3 个色谱峰，经面积归一化分析，总硫醚含量大于90%。定性分析可以看出，质荷比（m/z）41、73、114、146、178是主要碎片。m/z114（Ma）、m/z146（Mb）和m/z178（Mc）分别为DAS（C6H10S，114.21）、DADS（C6H10S2，146.26）和DATS（C6H10S3，178.33）的分子离子碎片。m/z41（对应CH2＝CH-CH2-）和m/z73（对应CH2＝CH-CH2-S-）是以上3 种物质的共有碎片[27]。
图1 大蒜油总离子流图及质谱图Fig.1 Total ion current chromatogram and mass spectrum of crude garlic oil
2.2 大蒜油、DAS、DADS、DATS对凝血酶活性的影响
大蒜及其不同的制剂可以抑制交原刺激的血小板聚集，表现出抗凝血作用[28]。如图2所示，本研究利用大蒜油、DAS、DADS、DATS与凝血酶进行相互作用后检测凝血酶活性的变化，不同浓度硫化物对凝血酶活性有部分抑制作用，且存在浓度依赖关系，浓度越高，活性抑制越强。进一步以DAS、DADS、DATS与凝血酶作用，1～5 mmol/L浓度范围均对酶活性起到部分抑制效果，其中DATS作用最强，DADS次之，DAS最弱（图2B～D）。
图2 大蒜油（A）、DAS（B）、DADS（C）、DATS（D）对凝血酶活性的影响Fig.2 Effects of garlic oil (A), DAS (B), DADS (C) and DATS (D) on thrombin activity
2.3 酶动力学分析结果
利用Lineweaver-Burk双倒数作图法进行酶动力学分析，结果如图3所示，经DAS、DADS、DATS处理的凝血酶，Vmax和Km同时发生变化，将直线交点不在横坐标轴上和纵坐标轴上的情况判定为混合型抑制（或共同型抑制）[29-30]，说明该抑制作用属于竞争性和非竞争性的共同型抑制。这意味两种作用方式产生抑制：即与底物竞争酶结合部位方式以及与酶的非活性部位结合形成抑制物-酶复合物的方式，不影响酶与底物的再次结合[29-30]。
图3 DAS（A）、DADS（B）、DATS（C）酶动力学Lineweaver-Burk图Fig.3 Lineweaver-Burk plots for DAS (A), DADS (B) and DATS (C)
2.4 荧光分析及分子对接分析结果
Trp、Tyr、Phe在300～400 nm波长处荧光变化可以反映蛋白质周围环境变化导致的立体结构改变[31]。如图4A所示，处理后的凝血酶，346 nm波长处处荧光强度降低，且位置和峰形不变，说明大蒜油、DAS、DADS、DATS都能不同程度地与酶发生作用，结合图2分析可知，大蒜油中起到酶活性抑制的物质主要是DADS和DATS，它们单独的作用效果要优于大蒜油和DAS单独作用的效果。如图4B所示，随着DATS浓度增加，346 nm波长处荧光强度逐渐降低，说明DATS与酶蛋白中发色基团相互作用发生荧光猝灭。在本实验条件下，大蒜油、DAS、DADS、DATS本身无荧光。
进一步利用分子对接技术深入探讨DATS对凝血酶三维结构[PDBID：1ETT]相互作用机制。利用三维分子对接技术，DATS与凝血酶的结合能为-4.55 kJ/mol，属自发反应，结合性能良好（图4C）。利用二维分子对接技术，DATS中心位置的硫原子能与酶分子活性位点氨基酸残基Asp189、Gly219和Ala190中的氧原子形成氢键，键长分别为3.06、3.11 Å和2.97 Å，与活性位点氨基酸残基Gly216、Ser195、Trp215形成疏水作用力（图4D），以上氢键及疏水作用力提供了竞争性抑制。DATS与酶分子非活性位点周围的Gly226、Asp221A、Tyr225、Glu217、Cys191、Val213形成疏水作用力（图4D），提供了非竞争性抑制[32-33]。分子对接结果与动力学结果一致。
图4 大蒜油、DAS、DADS、DATS与凝血酶的作用机制Fig.4 Action mechanisms of garlic oil, DAS, DADS and DATS on thrombin
2.5 大鼠体内实验分析结果
2.5.1 凝血四项指标分析结果
如表1所示，与空白组相比，大蒜油、DAS、DADS、DATS处理组的PT、APTT和TT均出现显着增高的趋势，其中DATS组极显着升高（P＜0.01），说明大蒜油、DAS、DADS、DATS均是通过改变内源性（APTT）、外源性（PT）、共同凝血途径（TT）凝血系统而起到抗凝作用；大蒜油、DAS、DADS、DATS组FIB质量浓度极显着下降，分别从（2.13±0.66）g/L降低至（1.48±0.23）、（1.54±0.48）、（1.31±0.35）、（1.16±0.13）g/L，说明大蒜油、DAS、DADS和DATS干预可以降低大鼠血液FIB含量从而发挥抗凝血活性。综合图2和图3结果可知DADS和DATS是大蒜油中主要的抗凝血硫化物，且DATS的抗凝血效果更优于DADS。
表1 大蒜油、DAS、DADS、DATS对大鼠凝血四项的影响Table 1 Effects of garlic oil, DAS, DADS and DATS on blood coagulation parameters in rats
2.5.2 抗氧化与抗凝血能力
如图5所示，大蒜油、DAS、DADS、DATS处理组的GSH、GR、TP、T-AOC水平均比空白组略有升高，但都不具有显着性差异（P＞0.05）。这说明大蒜油、DAS、DADS、DATS只有微弱的抗氧化能力，与大蒜油、DAS、DADS、DATS具有显着抗凝血能力的结果并不一致。因此，本实验所揭示的大蒜油、DAS、DADS、DATS抗凝血能力应该与其抗氧化能力无关。
图5 大蒜油、DAS、DADS、DATS对大鼠血清抗氧化指标的影响Fig.5 Effects of garlic oil, DAS, DADS and DATS on serum antioxidant indexes of rats
3 结 论
本研究通过体内和体外实验探索了大蒜油、DAS、DADS、DATS的抗凝血功能，紫外光谱、分子荧光光谱、动力学分析结果表明DAS、DADS、DATS对凝血酶的抑制作用属于竞争性/非竞争的共同抑制效果；二维、三维分子对接分析结果表明抑制属竞争性和非竞争抑制并存的作用方式；大鼠凝血四项的结果从体内的角度印证了大蒜油、DAS、DADS、DATS具有抗凝血功能；大鼠抗氧化实验结果提示大蒜硫醚类抗凝血功能应与抗氧化能力不相关。
