杨 红，刘晓艳,*，白卫东，黄汉聪
（1.农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室，广东 广州 510225；2.广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室，广东 广州 510225；3.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；4.广州市如丰果子调味食品有限公司，广东 广州 510300）
分子印迹技术起源于免疫学，被定义为“合成聚合物中配体选择性识别位点的构建[1]”，原理与抗原抗体特异性结合理论相类似，一般由模板分子即目标分析物、功能单体、致孔剂或交联剂参与制备，它是通过模板分子与配位功能单体在致孔溶剂中进行共价组装，在组装过程中促进识别位点形成三维分子物质，再利用溶剂去除部分或全部模板后在分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）中腾出模板分子的三维
空间结构，从而达到识别吸附模板的作用。其模板涵盖离子[2]、原子[3]、分子[4]、络合物[5]甚至微生物[6]。稳定的模板-单体络合物的形成对于分子识别的过程至关重要，因此在选择功能单体时应最先考虑其与模板分子之间的相互作用，而致孔剂在聚合中通常充当分散介质和成孔剂，常见的致孔剂包括2-甲氧基乙醇、甲醇、四氢呋喃、乙腈、二氯乙烷、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺和甲苯。在制备MIPs的过程中，单体与模板周围的空间位置是通过与交联剂共聚来固定的，通常交联剂用量过低会导致材料的力学性能不稳定，交联剂用量过高又会减少单位质量MIPs的识别位点数。MIPs与其他识别系统相比，具有结构可预测性[7]、识别特异性[8]和应用广泛性[9]三大特点和高选择性[10]、高稳定性[11]、耐蚀性[12]和重复利用性[13]四大特性，基于这些显着特性，分子印迹技术（molecular imprinting technology，MIT）在很多领域被应用，如分离纯化、催化和传感器检测等。近年来其在食品分析中的应用也越来越广，包括食品的分离检测、传感器的应用等。本文对MIT在分子印迹固相萃取（molecular imprinted solid phase extraction，MISPE）、色谱分离、膜分离和传感器领域应用的最新研究进行总结归纳，以期为推进MIT在食品安全检测中的创新提供理论指导。
1 MIT在食品分离检测中的应用
农兽药残留、非法添加、真菌毒素、污染物、金属元素等是食品安全检测常见的项目，使用传统的食品安全检测方法时存在前处理耗时耗力、基质复杂、干扰因素多、不易检出的难题，而MIT的使用改善了传统检测方法的这些弊端。目前MIT在食品检测中最广泛的应用为MISPE与分离检测。
1.1 MIT在固相萃取中的应用
固相萃取、固相微萃取、液-液萃取、多相钯萃取、超临界流体萃取和柱层析是食品前处理中应用较多的前处理方法，其中固相萃取被认为是提高分析灵敏度最有效的前处理技术[14]。MISPE使用MIPs作为固相萃取的填料，利用其特异性识别的特点与待测物结合，高效分离纯化分析物[15]。MISPE一般包括4 个步骤：预处理（以除去柱中残留洗脱液）、加样、清洗（以去除干扰化合物）和目标分析物的洗脱。MISPE提取目标分析物的方式有两种，一种是“正相”提取法；另一种是“反相”提取法。“正相”提取时，分析物与MIPs的特定相互作用使分析物选择性地保留在萃取柱上，干扰分子可以自由通过萃取柱，随后增大流动相的流动性即可洗脱分析物。而使用“反相”方法时，分析物和干扰物同时保留在MIPs上，需先用溶剂清洗去除干扰物，然后再将分析物洗脱下来。
Guo Xiuchun等[16]以2-甲基-5-硝基咪唑为模板，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂制备了硝基咪唑的MIPs，采用MISPE选择性净化样品，建立了一种可以直接从复杂的蜂蜜样品中同时提取7 种硝基咪唑类化合物的方法，结果表明，该方法回收率在79.7%～110.0%之间，该方法对不同硝基咪唑的定量限为1.0 μg/kg，低于不同权威机构规定的最大残留限量，高回收率和高精密度证明了该方法适用于复杂基质中硝基咪唑的分析。
Wang Gengnan等[17]采用MIPSPE和高效液相色谱法相结合的方法测定牛奶中氟喹诺酮类药物的残留量，以诺氟沙星为基质建立了能识别4 种氟喹诺酮类药物（环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和洛美沙星）的MIPSPE试剂盒，结果显示，MISPE试剂盒对4 种药物具有较高的吸附量（≥4 520 ng）和较高的回收率（≥96%），可重复使用至少50 次。
将MIT应用于固相萃取制备食品样品，能减少溶剂的消耗，且能够选择性地清除分析物，方便快捷，因此在食品的检测项目中的应用备受青睐（表1），但也存在需要改善或进一步研究的问题。首先，对于MISPE技术的理论研究仍需进一步进行，如确定印迹过程和识别过程的机理、结合位点的作用机理、聚合物的结构等基本理论；其次，MISPE的使用过程仍需要进行洗脱，如果能在大部分检测中免除洗脱过程，将大大提升检测效率；另外，MISPE在食品有害物检测中的实际商业应用由于制备MIPs的自动化程度较低而受到限制。
表1 MISPE在食品检测中的应用Table 1 Applications of molecular imprinted solid phase extraction(MISPE) in food detection
1.2 MIT在色谱分离中的应用
由于对目标分析物具有高度的亲和力和选择性，MIPs还可以作为分离色谱的固定相，如高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、毛细管电色谱、毛细管液相色谱、薄层色谱[47]。MIPs模板柱根据功能单体和模板之间的功能具有不同类型的选择性，由于模板与印迹空腔中功能单体之间的作用，在色谱柱洗脱过程中，模板峰总是最后一个峰。因此，MIPs固定相可以通过控制分析物的洗脱顺序，对目标分析物实现选择性分离。MIT应用于色谱柱分离中还可以使低浓度的样品显着富集，在不影响目标分析物的情况下冲走本体基质[48]。与传统填充柱相比，MIPs色谱柱具有更高的孔隙率和更好的渗透性，是继多糖、交联包衣、单分散之后的第四代分离介质，也是当前色谱材料研究的热点之一。基于这些优点，目前整体柱的MIPs已应用于麻黄碱和伪麻黄碱[49]、β-肾上腺素阻滞剂[50]、氨基酸衍生物对映体[51]、布洛芬[52]等的手性分离、异构体分离和对映体分离等领域。
Garcia等开发了一种基于MIT对红酒中4-乙基苯酚代谢途径化合物的测定方法，以香豆酸印迹聚合物为固定相，利用HPLC选择性分离酚类化合物香豆酸、4-乙烯基苯酚、香豆酸乙酯、4-乙基酚与4-乙基愈创木酚，得到了5 种化合物的色谱图，且平均回收率为95.2%～109.2%[53]。
Zhai Haiyun等[54]以氧氟沙星B、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸乙烯分别为模板、功能单体和交联剂，采用水浴原位聚合法，利用MIT包被氧化石墨烯制备了毛细管整体柱来分离测定咖啡豆中的荧光桃红B，在优化选定条件下，于整体柱上分离得到咖啡豆，富集因子达到90 倍以上。
一些研究已经成功地应用MIT实现了对映体的分离。Dong Hongxing等[55]研发了一种新型手性固定相的开发途径，即将MIPs包覆在硅胶表面制备手性固定相。这种手性固定相应用于HPLC分离外消旋1,1’-联萘-2,2’-二胺时显示出较高的分离因子（3.39）。Yue Chunyue等[56]以丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酸酯和L-色氨酸分别为功能单体、交联剂和模板剂制备了MIPs，并将其用作电动色谱中的拟固定相，实现了对映体的有效分离。
MIPs作为色谱固定相在HPLC分析物的分离中广泛应用。然而，将MIPs填充到色谱柱中需要一个繁琐的处理过程。虽然整体柱技术可以简化过程，但仍有许多改进的余地，如可开发新的MIPs合成方法来降低与分析仪器相结合的压力、缩短分析时间、提高重复利用性和再生性。
1.3 MIT在膜分离中的应用
MIT在膜分离方面也有较好的应用。它通过MIPs上的识别位点对目标分子的进行识别，目标分子在膜内的扩散和从膜上释放的过程都伴随着分子的特异性识别，使得膜分离实现了良好的渗透选择性[57]。膜分离的物质一般包括多肽、植酸、氨基酸及其衍生物、阿米替林、阿特拉津和9-乙基腺嘌呤[58]。此外，由MIPs制备而成的分子印迹膜（molecularly imprinted membrane，MIMS）是生物膜领域的一个突破，与其他类型的分离膜相比，它可以预测洗脱顺序，同时具有更好的机械性、稳定性和选择性，且能有效抵抗恶劣环境。
膜的选择性和通量都是膜分离的重要特性，在不降低膜选择性的前提下，提高膜的通量是一个具有挑战性的研究。Sueyoshi等[59]合成了一种分子印迹纳米纤维膜（molecularly imprinted nanofiber membrane，MINFMs），并与传统的MIMs进行了比较，结果表明，在不降低选择性情况下，通过MINFMs的通量比标准的MIPMs高出一到两个数量级。Qiu Xiuzhen等[60]以甲基丙烯酸为功能单体，采用原子转移自由基聚合法在阳极氧化铝（anodic aluminum oxide，AAO）纳米孔表面制备了MIPs纳米管膜。AAO具有高度有序的六边形纳米孔及可调节的孔径、厚度和形状，因此合成的聚合物通常具有均匀的形状和尺寸。与传统方法相比，印迹涂层纳米结构与靶表面富集相结合的方法可以通过增加材料表面结合位点的数量，显着提高印迹材料的结合能力和动力学性能。Wu Yilin等[61]利用MIT制备双层四环素印迹膜，第一层使用表面印迹法合成聚多巴胺基四环素层，第二层利用溶胶-凝胶聚合形成基四环素层，基于双层四环素印迹的结构，成功合成了大量的四环素识别位点，大幅度提高了膜的选择性和吸附能力。
MIMs通过将MIPs印迹识别位点并入膜中，使其分布在膜内并能够专一性识别目标物，从而提高了渗透选择性，为食品中有害物质的检测提供了广阔的应用空间。如表2所示，MIMs与传统的膜分离相比存在很多优点，但印迹分子的洗脱是制备MIMs的难点。洗脱不完全造成结合位点的减少，降低了分子印迹膜的使用价值；对于痕量物质的分析，洗脱不完全又会影响到分析结果的准确性，因此，仍然需要开发性质更优良的MIMs。
表2 MIMs与其他材料膜的比较Table 2 Comparison of molecularly imprinted membrane and other membranes
2 MIT在食品安全检测传感器中的应用
对于复杂基质的食品分析检测，因需要繁琐的预处理过程而导致检测困难。分子印迹传感器（molecularly imprinted sensor，MIS）将表面化学和纳米技术引入到基于MIT的传感器制造中，大大提高了分析灵敏度，降低了检测限，又因其精度高和预处理过程简单的特点，已在食药测定领域被成功广泛应用[66-67]。与传统的检测技术相比，基于MIT的MIS具有很大的优势，包括对复杂混合物的实时分析具有高选择性、高灵敏度、高亲和力、化学稳定性和易制备的特点。基于MIT，同时引入纳米颗粒[68]、磁性纳米颗粒[69]、纳米管[70]、纳米通道[71]、固相合成法[72]等开发的各种纳米复合材料，已经被用作电极修饰剂或新型电极材料应用于多种食品的检测。
2.1 MIT在电化学传感器中的应用
电化学传感器是一种将目标分析物质与电极表面受体的相互作用转化为有用分析信号的装置[73]。电化学传感器中，固定在电极表面的MIPs能够特异地识别目标分子，然后通过电极输出与目标分子结合，并转换成可测量的电信号，从而达到定量分析检测目标物质的目的[74]。分子印迹电化学传感器以其高灵敏度、高选择性、低成本、易于小型化和自动化等优点在食品检测中得到了越来越多的关注。目前基于MIT的电化学传感器发展趋势之一是应用微粒和纳米粒子或纳米结构涂层。
Bougrini等[75]制备了一种新的四环素电化学传感器，通过在电极表面添加MIPs微孔金属有机骨架来实现四环素的检测，结果显示，该传感器对四环素检测的线性范围为2.24×10-13～2.24×10-8mol/L，检测限为2.2×10-16mol/L，且成功应用于蜂蜜中四环素的测定，回收率为101.8%～106.0%，相对标准偏差不超过8.3%。
Eren等[76]制备了一种灵敏的分子印迹石英晶体微天平传感器，用于红曲米中洛伐他汀的检测。此传感器分别以洛伐他汀和甲基丙烯酸为模板与功能单体，在甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中预聚合3 h，加入引发剂偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸2-羟乙基酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯，在氮气中混合制得模板与单体的混合液，使用旋涂法将混合液在提前用丙烯硫醇改性好的石英晶体微天平芯片薄膜表面进行处理，然后在芯片表面系统地进行模板的去除（图1）。结果表明，该传感器对红曲米中洛伐他汀检测的线性范围为0.10×10-9～1.25×10-9mol/L，检出限为0.03×10-9mol/L，并验证了该传感器突出的稳定性和可重复性。
图1 表面聚合法制备石英晶体微天平芯片原理图Fig.1 Schematic diagram of quartz crystal microbalance chip prepared by surface polymerization
Ma Wuwei等[77]以As3+为模板，邻苯二胺为功能单体，在纳米孔金（nanoporous gold，NPG）表面利用点沉积法制备合成离子印迹聚合物（ion imprinted polymer，IIP），使用铁氰化钾和铁氰化钾螯合物作为电化学探针，以离子印迹聚合物和纳米孔金修饰金电极（IIP/NPG/gold electrode，IIP/NPG/GE）为基础，研制了一种可以在不同类型的水中测定As3+的电化学传感器（图2）。结果显示该传感器对As3+检测的线性范围为2.0×10-11～9.0×10-9mol/L，最低检出限为7.1×10-12mol/L（RSN＝3）。该传感器具有良好的稳定性和选择性。
图2 IIP/NPG/GE制备示意图[77]Fig.2 Schematic diagram of ion imprinted polymer (IIP)/nanoporous gold (NPG)/gold electrode (GE) preparation[77]
2.2 MIT在光学传感器中的应用
光学传感器是测量材料的光学特性并将光或光子的变化转换为电子信号的探测器[78]，MIT传感器可以检测到光信号的变化，然后进行转换。由于制备工艺简单、检测限低，荧光检测已成为非常受欢迎的技术。基于MIT的光学传感检测技术主要包括荧光检测、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）检测、表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）检测等。
荧光检测因具有取样量少、灵敏度高等优点[79]而得到广泛应用。由于量子点具有窄发射和抗荧光猝灭的独特光学特性，可作为荧光传感器或探针应用[80]。而将量子点与荧光检测结合使得荧光传感器具有更大的应用潜力。Li Xunjia等[81]基于MIP-FeSe量子点研究了一种快速检测鱼类和沉积食品样品中氟氰菊酯的荧光检测方法，采用反相微乳液聚合法在FeSe量子点上制备分子印迹二氧化硅膜（图3），MIP-FeSe量子点通过离子相互作用、形状选择性和氢键作用对氟氰菊酯进行特异性识别，阻断了FeSe量子点到氟氰菊酯的电荷转移，导致MIP-FeSe量子点的荧光猝灭，更大程度上提高了检测灵敏度。结果表明，该荧光传感器具有良好的准确度和精密度，鱼类样品中的氟氰菊酯检测限达到1.0 μg/kg。此外，Liu Yan等[82]以丙烯酰胺、甲基丙烯酸和乙二醇二甲基丙烯酸酯分别为模板、功能单体和交联剂，在氧化石墨烯表面合成了丙烯酰胺印迹聚合物，将掺杂Mn2+的ZnS量子点加入至聚合物中作为荧光源，印迹和荧光检测相结合大大提高了检测效率，是一种很有前途的检测食品中痕量丙烯酰胺的荧光探针。然而，这些传统的半导体量子点具有生物毒性和环境污染等缺点。因此，碳点因其稳定的光致发光、绿色合成、生物相容性等优良性能而备受关注。Xu Longhua等[83]将碳点嵌入分子印迹聚合物制备了新型荧光传感器用于测定杂色曲霉素，首先，通过一步反应合成了高蓝色发光碳点，然后以1,8-二羟基蒽醌为模板分子，通过溶胶-凝胶法在碳点表面得到碳点印迹聚合物，对杂色曲霉素具有较高的选择性和敏感性，且成功用于谷物中杂色曲霉素含量的测定。
图3 MIP-FeSe量子点的制备Fig.3 Preparation of molecularly imprinted polymer (MIP)-FeSe quantum dots
ECL检测是一种将电化学信号转换为光信号的方法，光电特性结合可以提高传感器的传感能力，具有灵敏度高、线性范围宽、检测限低等优点。如Li Shuhuai等[84]以茜素红掺杂邻苯三酚为功能单体，通过电聚合制备了多西环素ECL-MIP，并成功将其应用于鱼肉中多西环素的检测。但因聚合物薄膜的厚度导致灵敏度受到影响，当循环次数大于20 次时，模板分子由于被MIPs膜覆盖而难以去除。Yao Ting等[85]将涂有金属纳米粒子的MIPs和经还原后的氧化石墨烯作为传感纳米杂化膜，用于对莱克多巴胺的检测。制备的传感器对莱克多巴胺及其类似物具有类特异性选择性，由于金属纳米结构促进了SPR现象，从而提高了检测的灵敏度。
Li Shuhuai等[86]制备了一种基于电化学能量转移检测林可霉素的方法（图4），将碳标记的DNA适配体与林可霉素和邻氨基酚在石墨烯修饰的电极上经电聚合形成MIPs，为了提高整个传感器的选择性和灵敏度，采用MIPs和林可霉素适配体组成的双识别系统制备传感器，预先组装林可霉素碳点标记的适配体复合物作为印迹模板，洗脱后，林可霉素分子被去除，而碳标记的适配体仍在MIPs中，在特定的电压下，标记的适配体被激发产生ECL信号，林可霉素经双重识别后进入MIPs上的识别位点与适配体结合，导致结构变化，减弱了修饰电极向CDs的能量传递。该传感器对林可霉素检测的线性范围为5.0×10-12～1.0×10-9mol/L，检出限为1.6×10-13mol/L，用于肉样品中林可霉素残留量的测定时结果较准确。
图4 林可霉素印迹光学传感器的制备[86]Fig.4 Preparation of lincomycin imprinted optical sensor[86]
SPR传感器自动化适应性强，较为灵活，但由于SPR对分析物的质量敏感，较难检测低分子质量的化合物，将MIPs与SPR相结合后，大大提高了检测的灵敏度，且成本低、制备工艺简单，可以用于实际的样品检测。Shrivastav等[87]利用本体聚合法开发了一种新型的基于印迹纳米结构的光纤SPR传感器用于红霉素的检测，可同时检测牛奶和蜂蜜中的红霉素。但本体聚合法制备的聚合物膜在聚合过程中，由于体系黏度随聚合的进行不断增加，混合和传热困难，反应速率和膜厚度难以控制，导致检测结果重复性差。为了克服这些问题，Li Wei等[88]开发了一种基于电聚合MIPs的SPR传感器，可简单快速地检测三聚氰胺，该方法成本低、无标签检测、制备工艺简单、响应速度快，可用于复杂实际样品中物质的检测。
2.3 MIT在其他传感器中的应用
生物传感器由分子识别元件和信号转换器组成，MIPs在生物传感器中通常以薄膜的形式存在[89]。MIPs在生物传感器中不仅可以将复杂的食品样品基质与分析目标物分离，提高选择性，还能在传感器表面聚集目标物质，提高检测灵敏度。
Ashley等[90]研究开发了一种新型多功能分子印迹聚合物材料的生物传感器，能够低成本、快速、灵敏地检测猪血中的多西环素。MIP复合材料由磁芯和荧光MIPs外壳组成，通过加入少量荧光单体，使用表面印迹法将荧光MIPs层接枝到磁芯上，增强了多西环素的选择性识别。结果表明，与其他常见的残留抗生素相比，该生物传感器对多西环素表现出良好的选择性，回收率为88%～107%。
在各种基于MIT的传感器中，电化学传感器和光学传感器得到了广泛的应用，利用MIT制备的传感器具有便携、快速响应和低成本等优点，其在食品安全检测中已经有许多成功的应用，近几年的相关应用总结见表3。但是，在实际应用中仍有一些关键问题和挑战需要解决，如复杂基质中特定分子的亲和力较低，缺乏具有多路复用传感器的开发，另外，期望能够建立一种用于工业应用的模块化传感器，它可以便捷地检测复杂基体中的任何化合物。因此，基于MIT制备检测食品样品的传感器仍需要深入进行研究，以降低成本且能更好地将实验研究转化为大规模生产，同时提高工业应用的灵敏度、选择性和再现性成为新的挑战。
表3 MIT在食品传感器中的应用Table 3 Applications of sensors based on MIP in food detection
3 结 语
MIPs作为一种新型的仿生识别材料，由于其优异的特异性、高选择性和重复利用性等优点在食品检测中得到了广泛的应用。本文探讨总结了近年MIT在样品前处理、食品检测分离与传感应用中的研究进展，这些研究结果表明，MIT可以为食品安全领域提供许多良好的机遇，促进新兴技术的发展应用。但目前仍存在一些问题需要解决。
首先，MIPs的识别位点大多位于三维结构中，存在识别位点不能充分利用的限制，这对于一些复杂或特定的食品基质来说，不能在其表面形成识别位点，使得印迹过程形成的识别位点数量减少；因此，开发能充分利用MIPs识别位点的技术仍具有较大挑战。
第二，针对研究较少的目标分析物，面临制备方法的限制和功能单体选择性少的问题。此外，制备过程中需要使用大量有毒有害有机溶剂如甲醇去洗脱模板。这不仅在制备过程中危害人体健康，增加安全隐患，也给环境带来较大污染，使制备结果大打折扣。
第三，相比MIT近年来在其他领域的迅速发展[106]，安全性的影响限制了其在食品中除检测以外其他领域的发展。
总的来说，将MIT结合在食品中虽然已经取得了许多成功的应用，但仍有较广的开发空间，随着MIT技术的广泛应用和食品检测技术的迅猛发展，MIT在食品安全检测中受到的关注将会越来越多。
