盐酸小檗碱抑制指状青霉的作用机制

林 波，欧阳秋丽，余 婷，郑佳佳，陶能国，李 路*

（湘潭大学化工学院，湖南 湘潭 411105）

柑橘是世界上重要的经济作物之一，具有重要的营养价值和药用价值。据统计，2019年我国柑橘种植面积约277万 hm2，柑橘总产量已达4365.57万 t[1]。在柑橘贮运过程中，病原真菌通过橘皮表面伤口及果蒂果皮交界处侵染果实，引起果实腐烂，造成的经济损失不容忽视[2]。其中，由指状青霉（Penicillium digitatum）引起的绿霉病是柑橘果实采后主要病害之一，在亚热带和干旱地区造成的损失可占柑橘采后总损失的90%[3-4]。目前，柑橘采后病害的防控手段以化学杀菌剂为主，但化学杀菌剂引起的环境、安全及病原菌耐药性等问题日益严峻，因此筛选高效的绿色植物源杀菌剂具有重要意义[5]。

近年来，植物次生代谢产物生物碱对植物病原真菌的抑制作用引起了广泛关注[6]。潘佳亮[7]发现苦参碱能有效抑制山核桃干腐病菌（Botryosphaeria dothidea）的孢子萌发，且抑制菌丝体生长的半抑制浓度（50%inhibitory concentration，IC50）为1.512 mg/mL。Zhao Zhongmin等[8]研究表明异喹啉类生物碱对植物病原真菌具有广谱抑菌性，其中血根碱抑制灰葡萄孢（Botrytis cinerea）等8 种植物病原菌生长的抑制中浓度（median effective concentration，EC50）在6.96～59.36 μg/mL之间。Oliva等[9]从芸香叶（Ruta graveolens）提取的喹诺酮生物碱对灰葡萄孢（B.cinerea）也具有高度抑菌活性。

小檗碱（berberine）又名黄连素，属于异喹啉类生物碱，主要以盐酸盐形式广泛存在于小檗科、毛莨科、芸香科植物中。盐酸小檗碱（berberine hydrochloride，BH）具有广谱抑菌性，因其多靶位抑菌机制，使致病菌不易产生耐药性，常作为抗肿瘤、抗炎、抗菌成分应用于临床制剂中[10-13]。据报道，从黄连根中提取的小檗碱氯化物可有效抑制小麦白粉病菌（Blumeria graminis）、灰葡萄孢菌（B.cinerea）、叶锈病菌（Puccinia recondit）的生长，其半数致死浓度（half lethal concentration，LC50）分别为190、80、50 μg/mL[14]。谭婷等[15]从紫叶小檗果中提取的小檗碱在质量浓度为4 mg/mL时对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的抑菌率为89.23%。阮元等[16]在离体条件下测定BH对19 种植物病原菌的抑制作用，结果显示100 μg/mL BH对尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、苹果斑点落叶病菌（A.alternata）的生长抑制率均高于75%。Hou Dongyao等[17]发现BH抑制桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）生长的最低抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）为46.9 μg/mL。

本研究拟通过离体实验探究BH对指状青霉的抑菌活性，利用活体实验研究BH对柑橘果实绿霉病的防控作用；进一步从病原菌菌丝体表面形态、细胞壁完整性、细胞膜通透性、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及能量代谢方面对BH抑制指状青霉的作用机制进行初步探讨，为柑橘采后绿霉病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

指状青霉（Penicillium digitatum）菌株，分离于湘潭大学附近果园中自然发病的柑橘果实。柑橘果实品种为‘宫川’（Citrus unshiuMarc.cv.Miyagawa Wase）。

盐酸小檗碱水合物（纯度98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；钙荧光白试剂（calcofluor white，CFW）、碘化吡啶（pyridine iodide，PI）、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）试剂盒 南京建成生物工程研究所；2’,7’-二氯二氢荧光素-双乙酸酯（2’,7’-dichlorodihyd rofluorescein diacetate，DCFH-DA）试剂盒 上海索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-250B型生化培养箱 上海博迅实业有限公司；SCW-CJ-1F型垂直流洁净工作台 苏州安瑞净化科技有限公司；DDSJ-308A电导仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；RE-2000A型旋转蒸发仪 上海雅荣生化设备仪器有限公司；UV-2450型紫外分光光度计、LC-20AT型高效液相色谱仪 日本SHIMADZU公司；ECLIPSE TS100型荧光显微镜 日本NIKON公司；JSM-6610LV型扫描电子显微镜 日本SANYO电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备

将指状青霉接种于PDA平板上活化，（25±2）℃恒温培养5～6 d，用接种环刮取PDA平板上的孢子于无菌水中，纱布过滤掉菌丝，用血球计数板计数，用无菌水配制成1×107、1×105个/mL的孢子悬浮液备用。

1.3.2 BH抑制指状青霉生长情况的分析

采用液体倍半稀释法[18]测定BH对指状青霉菌丝生长的抑制作用。配制BH终质量浓度分别为0、0.02、0.04、00.8、0.16、0.32、0.64 g/L的PDB，加入孢子悬浮液后，置于恒温振荡培养箱（25±2）℃，160 r/min培养48 h。MIC定义为培养2 d能完全抑制病原菌生长的最低BH质量浓度，将BH质量浓度≥MIC的培养液涂布在PDA平板后继续培养2 d，能完全抑制病原菌生长的最低BH质量浓度即最低杀菌质量浓度（minimum fungicidal concentration，MFC）。将浓度为1×107个/mL的孢子悬浮液加入BH质量浓度为0.5 MIC和MIC的PDB中，对照为孢子悬浮液加入不含BH的PDB中（25±2）℃、160 r/min分别培养6、9、12、15 h，统计孢子萌发率。

1.3.3 BH处理及柑橘果实绿霉病病斑平均直径的测定

将采摘的柑橘果实于室内放置1 d，自来水清洗，用2%（体积分数）NaClO浸泡2 min，蒸馏水漂洗3 次，自然风干。用小刀在柑橘果实赤道附近划大小为3 mm×3 mm的伤口，接种10 μL浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液。静置4 h后将果实分别浸泡在1 MFC、5 MFC、10 MFC的BH溶液中1 min，对照组为无菌水处理的果实。随后，将柑橘果实置于温度为（23±2）℃、相对湿度为80%～90%的条件下贮藏，用十字测量法每天测量果实的病斑直径，实验重复3 次。采用下列公式计算病斑平均直径[19]，以平均直径表征病斑直径。

1.3.4 菌丝体表面形态观察

取0.5 mL浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液加入50 mL PDB中，（25±2）℃振荡培养2 d。用4 层纱布过滤得菌丝体，加入含不同质量浓度BH（0 MIC（对照组，下同）、0.5 MIC、MIC）的PDB中振荡培养120 min，过滤后用蒸馏水清洗3 次。将收集的菌丝体用3%戊二醛溶液4 ℃固定24 h，用无菌水漂洗20 min，依次用30%、50%、70%、95%乙醇溶液分别处理20 min，最后用无水乙醇脱水45 min。将处理后的菌丝体冷冻干燥，喷金后用扫描电子显微镜观察其表面形态[20]。

1.3.5 菌丝体细胞壁完整性分析

收集培养2 d的指状青霉菌丝体，分别加入含不同质量浓度BH（0 MIC、0.5 MIC、MIC）的PDB中，于160 r/min、（25±2）℃分别振荡培养0、30、60、120 min后过滤。分别收集上清液和菌丝体用于胞外AKP活力的测定及细胞壁完整性测定。取300 μL上清液，参考AKP试剂盒的方法测胞外AKP活力。取少量菌丝体加入10 μL CFW荧光染料处理10 s后加入等体积的10% NaOH溶液，在荧光显微镜下进行观察[21]。

1.3.6 菌丝体细胞膜通透性分析

参照Tang Xu等[22]的方法观察BH对细胞膜通透性的影响。称取0.10 g上述菌丝体，加入1 mL PBS和10 μL 1 g/L PI染液，37 ℃水浴5 min后用PBS清洗3 次，用荧光显微镜进行观察。将上述收集的上清液用电导仪测定电导率[23]。将上述上清液4 000 r/min离心10 min后，取0.5 mL上清加入0.5 mL蒸馏水，与5 mL考马斯亮蓝G-250染剂混匀，595 nm处测吸光度，根据蛋白质标准曲线方程计算可溶性蛋白的质量浓度[22]。

1.3.7 菌丝体活性氧水平及丙二醛浓度分析

用DCFH-DA试剂盒检测菌丝体胞内ROS水平，按照说明书处理待测菌丝体，在荧光显微镜下观察并拍照，用Image-J软件分析荧光强度，以相对荧光值（与初始荧光强度的比值）表征ROS水平。根据丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒提供的方法测定菌丝体胞内MDA的浓度。

1.3.8 线粒体膜电位及能量代谢水平的测定

参考MMP检测试剂盒（JC-10染色法）说明书测定MMP的变化情况，在荧光显微镜下进行观察，并用Image-J软件分析荧光强度，以红/绿荧光强度比值表征MMP。

参照Tang Xu等[22]的方法测定BH对指状青霉ATP含量及胞内能荷水平的影响。称取0.50 g上述菌丝体，加入5 mL沸腾的2 mol/L MgSO4溶液混匀后于100 ℃水浴10 min，冰浴冷却并研磨至匀浆状。4 000 r/min离心10 min，取上清液于高效液相色谱测定胞内ATP含量及能荷水平。实验重复3 次，结果取平均值。

液相色谱条件：C18柱（5 μm×250 mm×4.60 mm）；柱温：25℃；流动相为缓冲液：甲醇-缓冲液（含1 mmol/L乙二胺四乙酸-KH2PO4-K2HPO4缓冲液（50 mmol/L、pH 6））体积比为97.5∶2.5；流速：0.80 mL/min；进样体积：20 μL；检测波长：259 nm。

1.4 数据处理与分析

通过Excel软件进行数据处理，结果用平均值±标准差表示，采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析，采用Ducan多重比较进行组间差异性分析，P＜0.05表示差异显着，用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 BH对指状青霉生长情况的影响

不同质量浓度BH对指状青霉生长情况的影响如表1所示，PDB培养2 d后，BH质量浓度为0.16 g/L时可完全抑制指状青霉的生长，表明BH抑制指状青霉菌丝体生长的MIC值为0.16 g/L；将BH质量浓度≥MIC的培养液涂布到PDA平板继续培养2 d后发现，0.32 g/L BH可以完全抑制指状青霉的生长，表明MFC为0.32 g/L。

表1 BH对指状青霉菌丝体生长情况的影响Table 1 Effect of BH on the mycelial growth of P.digitatum

从图1可以看出，不同质量浓度BH处理后，指状青霉的孢子萌发率均有所下降。对照组指状青霉孢子在6 h开始萌发，此时，BH处理组的孢子均不萌发。15 h时，对照组孢子萌发率达（92.48±3.35）%。而0.5 MIC和MIC BH处理组的孢子萌发率分别为（12.55±0.71）%和（4.40±1.05）%，显着低于对照组（P＜0.05）。表明BH可显着抑制指状青霉孢子的萌发。

图1 BH对指状青霉孢子萌发率的影响Fig.1 Effect of BH on the spore germination of P.digitatum

2.2 BH对柑橘果实绿霉病发病进程的影响

BH对柑橘果实绿霉病发病进程的影响如图2所示。接种指状青霉3 d后，对照组柑橘果实开始发病，并表现出明显病症，贮藏5 d后全果腐烂。而经5 MFC、10 MFC BH处理的柑橘果实第4天才开始发病，贮藏5 d后，10 MFC BH处理的果实病斑直径为（1.13±0.02）cm，显着小于对照组（（5.62±0.09）cm，P＜0.05）（表2）。说明BH处理延缓了柑橘果实绿霉病的发病进程，且抑制作用呈浓度依赖性。

表2 BH对柑橘果实绿霉病病斑直径的影响Table 2 Effect of BH on the lesion diameter of green mold in citrus fruit

2.3 BH对指状青霉菌丝体表面形态的影响

BH处理对指状青霉菌丝体表面形态的影响如图3所示。120 min时，对照组菌丝体表面形态饱满完整，无褶皱凹陷（图3A）；而0.5 MIC BH处理组部分菌丝体呈干瘪、褶皱、扭曲状（图3B）；MIC BH处理组菌丝的损伤程度更加明显（图3C）。表明BH可破坏指状青霉菌丝体表面形态，且处理质量浓度越大，菌丝体的损伤程度越大。

图3 BH对指状青霉菌丝体表面形态的影响Fig.3 Effect of BH on the mycelial morphology of P.digitatum

2.4 BH对指状青霉菌丝体细胞壁完整性的影响

细胞壁在真菌的生长和存活中起重要作用，因此经常作为真菌抑制剂的作用靶标[24]。CFW可以与真菌细胞壁成分几丁质和β-葡聚糖结合产生蓝色荧光，因此荧光强度的减弱则表明细胞壁完整性受损[25-26]。指状青霉菌丝体经CFW染色后，MIC BH处理组的荧光强度随处理时间的延长逐渐减弱，而对照组菌丝体的荧光强度基本不变（图4A）。其中，30 min时，MIC BH处理组的荧光值为初始值的0.93 倍，显着低于对照组（P＜0.05，图4B），说明此时细胞壁完整性已受损。AKP存在于细胞壁和细胞膜之间，细胞壁受损将导致AKP泄漏[24,27]，因此进一步测定胞外AKP活力的变化对细胞壁受损情况进行验证。结果显示，30 min时，MIC BH处理组的胞外AKP活力为（4.58±0.31）U/L，显着高于对照组（（3.68±0.09）U/L，P＜0.05）（图4C）。说明MIC BH处理30 min时，细胞壁完整性已受损，导致AKP从细胞周质空间释放到胞外。

图4 BH对指状青霉菌丝体细胞壁完整性的影响Fig.4 Effect of BH on the cell wall integrity of P.digitatum mycelia

2.5 BH对指状青霉菌丝体细胞膜完整性的影响

细胞膜的完整性和流动性对真菌的生存和生长至关重要，细胞膜的损伤可导致胞内物质泄漏，同时膜渗透性的增加可促进抑菌物质对菌体的作用，加速细胞的凋亡[28-31]。PI是一种荧光染料，可穿过受损的细胞膜与核酸结合产生红色荧光[20]。因此，本实验先通过PI染色实验研究BH对细胞膜通透性的影响。结果表明，30 min时MIC BH处理的菌丝体呈现明显的红色荧光，其荧光强度为初始值的（1.24±0.02）倍，显着高于对照组（P＜0.05），且荧光强度随处理时间的延长而增大，而对照组未观察到红色荧光（图5A、B）。进一步测定胞外电导率及可溶性蛋白质量浓度对细胞膜通透性的影响进行验证。30 min时，0.5 MIC BH和MIC BH处理组的胞外电导率相对初始增量和可溶性蛋白质量浓度均显着高于对照组（P＜0.05），且随处理时间延长，胞外电导率相对初始增量和可溶性蛋白质量浓度持续增加（图5C、D）。说明0.5 MIC BH处理30 min时，指状青霉菌丝体的细胞膜已受损，导致内容物泄漏。

图5 BH对指状青霉菌丝体细胞膜通透性的影响Fig.5 Effect of BH on membrane permeability of P.digitatum mycelia

2.6 BH对指状青霉菌丝体胞内ROS和MDA水平的影响

许多真菌抑制剂的作用机制与脂质过氧化密切相关，脂质过氧化使细胞质膜功能发生改变，导致细胞死亡。MDA作为膜脂过氧化的主要产物，其含量是衡量膜脂过氧化水平的重要指标[20]。为研究BH对指状青霉菌丝体氧化应激反应的影响，测定了胞内ROS和MDA的水平，结果如图6所示。30 min时，BH处理组的胞内ROS和MDA水平与对照组无显着性差异；而60 min时，MIC BH处理组ROS水平为1.040±0.027，胞内MDA浓度增加至（0.171±0.007）μmol/L，均显着高于对照组（P＜0.05）。说明60 min时，MIC BH处理组的指状青霉菌丝体胞内ROS积累并发生膜脂过氧化反应。

图6 BH对指状青霉ROS（A）及MDA（B）水平的影响Fig.6 Effect of BH on the ROS (A) and malondialdehyde (B) contents of P.digitatum mycelia

2.7 BH对指状青霉线粒体膜电位及能量代谢的影响

线粒体是细胞能量代谢的主要场所。ROS介导的氧化应激可直接引起线粒体损伤，而MMP在维持线粒体功能中起重要作用，因此MMP在多种细胞凋亡刺激下呈下降趋势[32-33]。由图7A可知，30 min时，BH对指状青霉菌丝体MMP没有造成显着影响，但处理60 min时，0.5 MIC和MIC处理组的菌丝体MMP分别为0.388±0.017、0.262±0.010，均显着低于对照组（0.435±0.013，P＜0.05）。说明此时线粒体功能已受损。此外，BH处理对指状青霉菌丝体的能量代谢造成显着影响。处理30 min时，菌丝体ATP含量迅速减少，0.5 MIC和MIC BH处理组的ATP含量分别为（72.91±2.85）μg/g和（76.16±0.87）μg/g，均显着低于对照组（（116.52±5.18）μg/g，P＜0.05）；处理60 min时，ATP含量进一步下降（图7B）。胞内能荷水平也呈现类似变化趋势（图7C）。结果暗示BH处理30 min时，指状青霉菌丝体能量代谢已受到影响；60 min时，线粒体功能受损，能量代谢进一步失衡。

图7 盐酸小檗碱对指状青霉MMP及能量代谢的影响Fig.7 Effect of BH on the mitochondrial membrane potential and energy metabolism of P.digitatum

3 讨 论

生物碱是植物次生代谢物中含量最高的一类，因其具有高效、低毒、选择性高、对有益生物安全及病原物不易产生抗药性等优点，生物碱农药的开发对农业可持续发展具有重要意义[34]。BH作为一种具有广谱抑菌性的生物碱，对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、苹果斑点落叶病菌（A.alternata）、桃褐腐病菌（M.fructicola）等多种植物病原真菌的抑菌活性已有初步报道[16-17,35]，但BH对植物病害的防控效果鲜有研究。在本实验中，BH抑制指状青霉生长的MIC和MFC分别为0.16、0.32 g/L（表1），处理15 h后，0.5 MIC处理组和MIC BH处理组的孢子萌发率分别仅为（12.55±0.71）%和（4.40±1.05）%（图1），说明离体条件下，BH对指状青霉具有较强的抑制作用。进一步研究了活体条件下BH对柑橘果实绿霉病的防控效果，结果显示BH处理能降低发病果实的病斑直径，有效延缓发病进程，且防控效果呈现剂量依赖型（表2）。BH的离体实验效果优于活体实验，此现象与安托芬在离体和活体条件下对指状青霉的抑制效果[20]相似，可能与人工接种孢子浓度较高以及果实伤口挥发物诱导病原菌孢子萌发有关[36]。此外，果实的酸度、硬度、成熟度等因素均对柑橘果实的发病进程有一定影响[37]。

扫描电子显微镜结果显示，经BH处理的菌丝体干瘪褶皱（图3），说明BH可改变指状青霉菌丝体的表面形态。而真菌细胞壁作为小分子物质进出细胞的第一道屏障，对维持细胞形态、抵抗外界压力及真菌的生长和定植等生命活动有重要意义[38-39]。真菌细胞膜具有维持细胞秩序和完整性的作用，细胞膜的破裂可使细胞内容物外泄并引起真菌细胞组织的破裂[32]。本实验中，BH处理后指状青霉菌丝体的细胞壁完整性和细胞膜通透性均受损，引起胞内物质的外泄。结果与高磊[40]报道的小檗碱显着破坏烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的细胞壁和细胞膜结构这一结论相似。值得注意的是，30 min时，0.5 MIC BH处理组的细胞膜通透性已受损，而该质量浓度下细胞壁完整性受损发生在30 min之后（图4、5），说明细胞膜是BH最初的作用位点。

研究表明，真菌细胞膜上存在多种离子通道，对细胞内外的物质和能量交换具有重要意义，而抑菌物质诱导真菌细胞膜通透性的改变可导致ATP的泄漏[41-42]。本实验中，BH处理30 min时，指状青霉菌丝体胞内ATP含量及能荷水平均急剧下降（图7B、C）。因此推断30 min时指状青霉能量代谢失衡与细胞膜通透性的改变有关，与胞外糖脂对酵母的抑菌机制相似[41]。膜脂质过氧化和ROS反应在真菌体内的动态平衡维持着细胞正常的新陈代谢，这种平衡的打破即造成细胞损伤。这种氧化性损伤不仅仅发生在质膜，还是引起线粒体损伤的主要途径之一[7,43]。本实验中，60 min时，BH处理组的菌丝体中ROS积累并发生膜脂过氧化反应（图6），MMP也显着降低（图7A），表明ROS的积累造成了线粒体功能的损伤，该结果与前期报道的生物碱安托芬对指状青霉的抑菌机理[43]相似。而线粒体功能受损加剧了能量代谢的失衡，表现为胞内ATP含量和能荷水平的进一步降低。

综上，BH能有效抑制指状青霉的孢子萌发和菌丝生长，并延缓柑橘果实绿霉病的发病进程。BH损伤病原菌的细胞通透性，导致胞内物质泄漏和能量失衡。随后，胞内ROS积累造成膜脂过氧化和线粒体损伤，进一步影响能量代谢，导致细胞凋亡。