DNA提取前处理方法对萨拉米香肠中细菌种群结构的影响

姬庆龙，赵贵明，王 娉，赵勇胜，赵晓美，杨海荣，陈 颖

（中国检验检疫科学研究院，北京 100176）

萨拉米香肠是以猪、牛肉等为原料，按照一定肥瘦比例，加入盐、大蒜、胡椒、辣椒等香料调味，经菌种发酵后在特定条件下干燥制成的干发酵香肠。香肠切开后，横断面呈现漂亮的大理石纹理，有股独特的香气与酸味[1]，是意大利传统美食，也是欧洲人必不可少的大宗食品，虽然目前在我国生产消费量相对较少，但其国内市场正在逐步扩大，已形成自己的消费群体[2-3]。

发酵香肠的风味不仅取决于原材料和调味料，更与其中的微生物密切相关，因此了解其中微生物群落结构是风味研究及安全质控的关键[4-5]。但是传统方法依靠培养、分离、纯化等一系列手段，对微生物具有一定选择性，无法全面反映发酵过程中微生物的种群结构。高通量测序技术与传统微生物群落研究相比，可对样品中微生物进行大规模平行测序，能够客观反映样品中群落构成和多样性，在肠道微生物、土壤微生物、海洋微生物、食品微生物等不同类型的环境样品中微生态研究中得到了应用。目前，该技术已用于奶制品[6-8]、茶叶[9-10]、肉制品[11-15]、酱[16]、腌菜[17-18]等发酵食品的菌群结构分析。尽管高通量测序技术在分析食品菌群结构中表现出一定的优势，但DNA提取方法、样品浓度、建库方法、引物选择、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）循环数、目标菌鸟嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C）含量、测序平台等[19]都会影响最终测序结果。为保证结果的可靠性以及不同研究之间结果的可比性，需要建立统一标准化的高通量菌群分析实验流程。其中，DNA提取方法的比较是近年来研究关注点之一[20-21]，而样品前处理是DNA提取的第一步。

与粪便、土壤、海水等样品不同，食品样品的组成较为复杂且菌群分布并不均一。因此从食品样品中提取细菌DNA时，通常需对样品进行前处理，如剪碎混匀、富集浓缩等。但不同前处理方法对样品中细菌种群结构产生的影响，国内外少有报道。目前，通常采用DNA的产量与纯度评价前处理方法有效性[22-24]。但DNA产量与微生物多样性之间没有明显关联，DNA产量大并不表明前处理方法满足要求，只有尽可能获得整个样品中所有的微生物基因组，才能真实地反映样品中实际的菌群结构[25]。

为此，本研究采用3种不同前处理方法提取萨拉米香肠细菌DNA，采用MiSeq高通量测序技术对其细菌种群结构进行分析。通过比较3种方法提取的样品中细菌种群差异，筛选出较适合的前处理方法，以期为建立统一标准化的发酵香肠高通量菌群分析实验流程提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取不同发酵剂的3种萨拉米香肠样品，分别命名为S1、S2、S3，样品信息见表1。在保质期内对样品进行测序分析。

表1 萨拉米香肠样品基本信息Table 1 Information about salami samples tested in this study

QIAamp®Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒、3 mm碳化钨研磨珠 德国QIAGEN公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS） 北京索莱宝科技有限公司；BagFilter侧过滤均质袋 法国Interscience公司。

1.2 仪器与设备

BagMixer拍打式均质机 法国Interscience公司；TissueLyser II高通量组织研磨仪 德国QIAGEN公司；NanoDrop One超微量分光光度计、小型台式离心机 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理与DNA提取

前处理方法分为3种，分别为直接提取法（M0）、拍击均质法（M1）和振荡珠磨法（M2），每个样品设2个平行。按照GB/T 4789.17—2003《食品卫生微生物学检验 肉与肉制品检验》的处理方法，直接切取25 g样品，放入灭菌研钵内用灭菌剪子切碎后，加灭菌玻璃砂研磨，搅拌混匀。M0方法，直接称取混匀后的200 mg样品于2 mL离心管中用于DNA提取。M1方法参考米瑞芳等[4]对酸肉中细菌群落的高通量测序分析，称取25 g样品，加入225 mL无菌PBS，均质机拍打2 min后，至4 ℃摇床振荡30 min，静置10 min后取上清液离心收集沉淀，用于DNA提取。M2方法为将样品切碎混匀后，称取200 mg样品，加入1.5 mL无菌PBS和4个3 mm碳化钨研磨珠，在高通量组织研磨仪上以30 次/s的频率，振荡3×1 min，每次间隔30 s以上。250×g离心5 min后取上清液，沉淀加入2 mL无菌PBS，涡旋混匀后，再次250×g离心5min后取上清液，合并上清液，15 000×g以上离心3 min收集沉淀，无菌PBS清洗3 次后，备用。

DNA提取使用QIAamp®Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒，根据试剂盒说明书的步骤提取DNA，其中水浴温度选择95 ℃，使用50 μL洗脱液溶解DNA。提取的样品DNA编号与前处理法名称一致。DNA纯度和浓度采用NanoDrop One超微量分光光度计测定。

1.3.2 细菌群落的高通量测序分析

高通量测序由北京奥维森基因科技有限公司完成。引物为343F（5′-CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′）[26]，为细菌16S rDNA的V3-V4可变区，第2轮扩增引入Illumina桥式扩增引物，并利用胶回收纯化扩增产物，经 Qubit 2.0精确定量后完成文库构建，MiSeq平台PE300测序分析。

1.4 数据处理

MiSeq测序可得到双端序列数据，对测得的Fastq数据进行相关质控处理，最终得到优质的Fasta数据，在去除标签和引物后，进一步去除嵌合体和短序列后得到最终序列。在97%的相似水平下，对序列使用vsearch软件生成可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。与数据库silva 128比对进行原核微生物的信息注释。基于分类学信息，在各分类水平上进行群落结构的统计。利用qiime软件进行α多样性分析，包括物种丰富度统计（Chao1指数）、物种多样性统计（Shannon指数、Simpson指数）。使用Venn图软件统计方法中共有和独有OTU数目，分析方法间OTU数目组成相似性及重叠情况。使用SPSS 25软件进行单因素方差分析及绘制箱形图，其他图在Excel中绘制完成。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

采用上述3种前处理方法处理萨拉米香肠样品后，M0提取的DNA平均质量浓度为（361.5±9.36）ng/μL，M1为（15.56±6.79）ng/μL，M2为（23.77±2.21）ng/μL。 3种方法得到的DNA的A260nm/A280nm比值均在1.9左右，表明纯度良好。使用引物343F/806R扩增后，3种方法均可扩增出450 bp的目的条带。虽然M1和M2的DNA质量浓度低于M0（混有样品组织DNA），但3种方法均满足样品菌群结构分析的建库需要。

2.2 OTU分布及α多样性分析

为突出3种前处理方法间测序结果的差异性，将2个平行对照的数据合并成1个样品数据进行分析。M0、M1和M2平均每个样品测得原始序列为33 722、47 135、44 033 条，去除嵌合体、短序列后得到最终优质序列数目分别是29 685、42 343、39 768 条，按照97%相似性，聚类共产生417个OTU，经过抽平处理剩余405个OTU。如图1所示，M0、M1和M2的OTU数分别为319、206和253，其中M0独有OTU数为90个，M1独有OTU数为33个，M2独有OTU数为38个。方法间共有的OTU数为129个，占样品总数的31.85%；任意两种前处理方法共有OTU数均在140个以上，M0和M2的共有OTU数最多（200个），占样品总数的49.38%。非共有OTU虽然数量很多，但丰度却极低，代表并不是主要菌群。

图1 3种前处理方法共有和独有OTU的Venn分析Fig. 1 Venn diagram representation of shared and unique OTUs among three pretreatments

每个样品的文库覆盖率均为100%，表明目前数据量的分析符合要求，已测数据可以反映萨拉米香肠样品中绝大多数的细菌物种信息，增加测序数据已无法找到更多的OTU，详细见表2。Chao1指数反映样品微生物种群的丰富度，Shannon指数和Simpson指数反映样品微生物种群的多样性，表现微生物种群的均匀度。结果表明，M0、M1和M2的Chao1指数分别为177.93±31.02、120.76±28.60、166.96±15.63；Shannon指数分别为2.79±0.22、2.95±0.31、3.25±0.30；Simpson指数分别为0.70±0.06、0.78±0.05、0.81±0.05。Chao1指数最高的是M0，同样品3个方法间最多相差145.98，证明M0可获得更高的物种丰富度；种群分布最均匀、种群多样性最高的是M2，同样品方法间Shannon指数最多相差0.83，而Simpson指数相差最多0.15。证明不同前处理方法可对样品的细菌种群结构产生影响。

表2 3种前处理方法的α多样性指数Table 2 α-Diversity index of samples with three pre-treatments

2.3 细菌组成分析

在门分类水平上，3种前处理方法共有13个门（含无法鉴定），厚壁菌门和变形菌门为主要优势细菌，此外还存在少量的放线菌门和拟杆菌门等，与国内外同类研究一致[27-29]。3种前处理方法在门水平上种群结构相似，但丰度上存在差异，其中厚壁菌门占绝对优势，相对丰度分布为M0（85.03%）＞M2（79.21%）＞ M1（68.70%）；变形菌门的相对丰度分布分别为 M1（22.03%）＞M2（18.09%）＞M0（10.09%）；放线菌门的相对丰度分布分别为M1（8.37%）＞M0（2.83%）＞M2（1.02%）。

在科分类水平上，M0、M1和M2分别有84、74、81个科，共有科为59个，占比99.5%以上。非共有科所占比例极低，对科分类水平上种群结构影响不大，但优势科的相对丰度存在差异（表3）。M0的优势科细菌（相对丰度＞1%）为乳杆菌科、链球菌科、葡萄球菌科、明串珠菌科、肠杆菌科和短杆菌科，所占比例总和为94.19%。M1的优势科与M0相同，但相对丰度存在差异，所占总比例为97.13%。与M0相比，M1的乳杆菌科和链球菌科相对丰度偏低，但肠杆菌科和短杆菌科的相对丰度显着升高。M2的优势科与M0和M1略有不同，黄杆菌科的相对丰度（1.32%）大于短杆菌科（0.59%），优势菌占比94.92%。

表3 3种前处理方法提取的萨拉米香肠样品中优势细菌及相对丰度Table 3 Relative abundances of dominant bacteria in salami with three pretreatments

如图2所示，在属分类水平上，M0、M1和M2分别有112、104、115个属，共有属为70个，占比99%以上。M0有8个优势菌属，分别为乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、葡萄球菌属、魏斯氏菌属、乌拉尔菌属、柠檬酸杆菌属和短杆菌属，所占比例总和为90.87%。M1则有11个优势菌属，除上述8个菌属外，还包括巨大球菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属，所占比例总和为93.31%。而M2有9个优势菌属，与M0相比，多了肠杆菌属和克罗诺菌属为优势菌属，而其短杆菌属相对丰度小于1%，其优势菌属占比91.53%左右。3种前处理方法在属水平对萨拉米香肠样品的种群结构及相对丰度差异显着（P＜0.05）。

图2 3种前处理方法提取的萨拉米香肠样品中优势细菌及相对丰度Fig. 2 Abundances of dominant bacteria in salami with three pretreatments

3 讨论与结论

高通量测序技术可对样品中微生物进行大规模平行测序，能够客观反映样品中群落构成和多样性，已经在肠道微生物、土壤微生物、海洋微生物、食品微生物等不同类型的环境样品中的微生态研究展开了广泛应用，但是影响最终测序结果的因素有很多，为保证结果的可靠性以及不同研究之间结果的可比性，需要建立统一标准化的高通量菌群分析实验流程。与粪便、土壤、海水等样品不同，食品样品的组成较为复杂且菌群分布并不均一，从食品样品中提取细菌DNA时，必须对样品进行前处理，如剪碎混匀、富集浓缩等步骤。因此，食品样品前处理是高通量测序分析第1步。目前各项研究采取的前处理方法没有统一的操作流程：有些研究仅将样品切碎后，带着食品组织直接提取DNA，有些研究则参考传统微生物检测的操作流程均质混匀稀释后再进行DNA提取。不同的前处理方法是否对样品中细菌种群结构产生影响，国内外较少报道。

本研究分析3种常用前处理方法对不同规格萨拉米香肠中细菌种群结构的影响：在DNA提取结果上，3种前处理方法采用同一个DNA提取步骤，但由于M0包含大量的样本组织，导致M0提取的平均DNA质量浓度为（361.5±9.36）ng/μL，远高于M1（15.56±6.79）ng/μL和M2（23.77±2.21）ng/μL，但在后续的建库测序中，M0、M1和M2平均每个样品得到最终优质序列数目分别为29 685、42 343、39 768 条，说明DNA的产量与测序的建库质量没有明显关联，因此仅靠DNA的产量与纯度不能评价前处理方法的有效性[24,30-31]，只有尽可能获得整个样品中所有的微生物基因组，才能真实地反映样品中实际的菌群结构[25]。王朝江[32]研究表明，不同的DNA提取前处理方法获得的样品细菌种群结构相似，但丰度上存在差异；但本研究分析的3种前处理方法，在门和科水平符合上述观点，但在属水平上，每种方法的优势菌属发生了变化，与M0相比，M1增加了巨大球菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属为优势菌属；M2则多了肠杆菌属和克罗诺菌属为优势菌属，少了短杆菌属。这种差异取决于样品的均一程度与前处理方法的相关特点：M0仅将样品切碎混匀后，直接按照试剂盒的要求提取样品DNA。由于样品没有经过缓冲液清洗，导致样本中除了现存细菌之外，还含有死去细菌的游离DNA，这导致提取的DNA中，扩大了优势菌群的比例及细菌多样性。这种方法的优点在于操作相对简单、快捷，且可了解样品在发酵过程中早期存在但后期消亡的细菌；缺点是使用该方法得到的不仅有细菌DNA，还包括样本组织DNA，从而造成线粒体和叶绿体的干扰。由于线粒体和叶绿体也含有16S rDNA，使用细菌通用引物可以将线粒体和叶绿体的序列扩增出来而被错误认定为变形菌门和蓝 藻门[33]。此外，由于没有经过前处理，样本中混有大量PCR抑制因子，如多糖、多肽、盐类、脂类及亚铁血红素等杂质，对DNA的纯度影响很大。因此M0特别依赖后续的DNA提取方法。

M1参考传统微生物检测的操作流程，称取25 g样品后，加入225 mL无菌PBS，均质机拍打混匀静置后，吸取上清液，离心沉淀提取DNA。这种方法的优点在于通过缓冲液洗涤及均质器的拍打，排除了优势菌群的游离DNA及多糖、多肽、样本组织等杂质的干扰。此外此方法由于取样量相对较多，更有代表性，可以相对客观地体现出样本的菌群结构。缺点是操作相对繁琐复杂，处理样品的过程中容易造成污染。

M2是将样品切碎混匀后，称取200 mg样品于离心管中，加入无菌PBS中，利用3 mm碳化钨研磨珠，在高通量组织研磨仪高速振荡撞击。其原理是当研磨珠直径大于1 mm时，beads-beating只能裂解动植物细胞或真菌细胞，而对细菌无影响[21]。因此选择3 mm碳化钨研磨珠，可通过振荡撞击，分散样品组织，使细菌更好地分散在缓冲液中。再通过差速离心法除去样本组织的干扰。其优点是操作相对简单，且除去了优势菌群的游离DNA及多糖、多肽、样本组织等杂质的干扰。缺点是由于取样量太少，不能完全的代表样品的菌群结构。

虽然M1与M2的取样量及后续操作差异很大，但两种方法均去除了游离DNA，反映了样品取样时的实际细菌种群结构。理论上如果样品的菌群结构完全均匀，两种方法的分析结果应无显着差异。但鉴于微生物的特殊性，其在食品中分布并不均匀。因此在食品微生物检测中，制定具有代表性的采样方案尤为重要。本研究依据GB/T 4789.17—2003中的采样处理方法，将样品研磨混匀后，再使用3种前方法对萨拉米香肠样品进行多样性分析。每种方法和每个样品均做了平行对照。如图2A所示，每种方法的2个平行样本中，优势菌群种类与丰度无显着差异，说明方法的重复性良好，种群结构的差异源自3种前处理方法。现有的采样方案虽然将样品通过研磨的方式混合，但其中的细菌分布仍达不到完全均匀，取样量依旧影响着种群结构的分析结果。当采样方案一致时，样品的规格越小，采取的样品越具有代表性，其中的菌群分布相对越均匀。实验结果表明，随着萨拉米香肠样品（S1、S2、S3）的规格减小时（350、100、50 g），3种方法之间的种群结构分析结果发生了变化：M1和M2的分析结果随着样品规格减小逐渐趋于一致。如果在后续研究中，优化采样操作流程，使样品在采样时已具有一定的代表性，则 M2为更适宜的萨拉米香肠中细菌种群结构分析的前处理方法。

综上所述，在门和科水平分析，不同前处理方法获得的样品细菌种群结构相似，但丰度上存在差异；但在属水平上，不同的前处理方法可影响后续种群结构分析的结果。M0可增大优势菌的丰度及多样性，可应用于检测样品在成熟过程中存在过的细菌。而M1和M2除去了游离DNA，只留下具有完整细胞结构的细菌菌体，更能反映出样品在取样时的细菌种群结构。当样品结构相对均一时，M1与M2的菌群结构和丰度趋于一致。应该尽早建立统一的高通量测序标准流程，以确保数据的可靠性以及不同研究之间结果的可比性。