黑灵芝多糖对糖尿病大鼠血糖血脂调节及肠道菌群的影响

吴睿婷，付王威，万 敏，吴 伟，姚于飞，李文娟,*

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006）

随着社会的迅速发展，高糖分高脂肪含量的饮食结构已成为快节奏生活中常见的饮食模式，使得肥胖和糖尿病患者人数激增并呈现年轻化趋势。目前，肥胖被公认是诱发2型糖尿病的独立因素之一，在高糖高脂饮食长期诱导下形成高血糖高脂水平，导致胰岛β细胞功能受损。同时，宿主饮食习惯的变化可直接导致宿主肠道微生物菌谱的改变，有研究显示，肠道菌群和2型糖尿病之间存在一定联系，肠道菌群失调可能参与到2型糖尿病发病机制中[1]。人体肠道内寄居有数以百万亿计微生物，正常状态下菌群间相互依存、制约、共生，形成相对稳定的肠道微生态。研究发现，长期的高糖高脂饮食作用下，可能会打破这种微生态平衡，失调的肠道菌群会通过代谢、炎症、免疫等途径促进2型糖尿病等代谢性疾病的发生[2]。Larsen等[3]通过对比糖尿病男性患者和正常男性间肠道微生物组成，发现糖尿病患者肠道内厚壁菌门（Firmicutes）丰度减少，拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度增加，有益的共生菌如乳酸杆菌和双歧杆菌丰度降低。有文献将这种改变与血糖和体质量指数（body mass index，BMI）联系起来，发现厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidetes，F/B）比值的变化在糖尿病患者中存在普遍性，并且与血糖和BMI呈线性关系[4]。随后肠道菌群被报道可以通过产生细菌素，抗生素和其代谢产物改变宿主的生理功能。短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）主要由肠道微生物利用碳水化合物发酵产生，包括乙酸、丙酸和丁酸等，它们具有不同的生理功能，在多个器官和组织中发挥作用。研究证明SCFAs能通过调节葡萄糖稳态、胰岛素敏感性和宿主炎性内环境来改善2型糖尿病[5]。

黑灵芝（Ganoderma atrum）作为药食两用的天然真菌，素有“仙草”之称，是我国自古以来的传统药材和营养补充剂，含有多种活性物质，如多糖、三萜类化合物、氨基酸多肽类等。Chen Yi等[6]通过热水提法从黑灵芝中分离获得了一种水溶性黑灵芝多糖（Ganoderma atrumpolysaccharides，PSG），并开展了大量的研究工作。本课题组前期研究表明，黑灵芝多糖是黑灵芝中最主要的活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、降血糖和调节免疫功能等多方面的活性功能[7]。Li Lu等[8]发现黑灵芝多糖对链脲佐菌素（lipopolysaccharide，LPS）诱导的1型糖尿病小鼠胰腺损伤具有保护作用，可以通过降低血糖，抑制线粒体凋亡通路和激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路来降低胰岛细胞凋亡。Zhu Kexue等[9]报道了黑灵芝多糖对2型糖尿病大鼠具有降血糖和降血脂的功能，同样也减少了胰岛细胞凋亡。基于以上研究，黑灵芝多糖已经初步被证实具有抗糖尿病作用，但国内关于黑灵芝多糖对糖尿病肠道菌群的影响研究鲜有报道。肠道部分微生物能选择性利用饮食中的特定营养物质促进自身的生长与富集，进而在宿主中发挥其有益或有害的作用。结合前期研究基础[6-9]，黑灵芝多糖作为水溶性膳食纤维是否能被微生物选择性利用进而调节肠道菌群结构及其抗糖尿病的关联仍需进一步研究。因此，本实验建立大鼠糖尿病模型，引入高通量测序技术，旨在探究糖尿病发病机制与肠道微生物间的联系，以及黑灵芝多糖作为食品对宿主肠道菌群的调节作用，评估其对肠道菌群组成结构和代谢产物的影响，初步探讨黑灵芝多糖抗糖尿病作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

清洁级Wistar雄性大鼠60 只（150～200 g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（赣）2018-0003。大鼠饲养于干燥、通风、安静的环境中，水和饲料无限供应。适应性喂养一周。高糖高脂饲料：66.5%（质量分数，后同）基础饲料、10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、1%胆酸钠。

黑灵芝（Ganoderma atrum）购自江西寻乌县东江源珍稀食用菌厂，从黑灵芝菌种中分离得到黑灵芝多糖。

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 美国Sigma公司；盐酸二甲双胍片 中美上海施贵宝制药有限公司；10%中性福尔马林固定液、无水乙醇、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液 上海碧云天生物技术有限公司；胰岛素试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 仪器与设备

血糖仪 德国Roche公司；3K15高速冷冻离心机美国Sigma公司；全波长多功能酶标仪 美国Thermo公司；超纯水机 美国Millipore公司；组织脱水机、冷冻包埋机、转式切片机、摊烤片机 金华科迪仪器设备有限公司；分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 黑灵芝多糖的制备

按照Chen Yi等[6]方法制备黑灵芝精制多糖，将黑灵芝子实体进行粉碎，体积分数95%乙醇溶液室温下脱脂48 h，过滤；滤渣中加入蒸馏水，100 ℃下提取2 h，过滤、浓缩；将体积分数95%乙醇溶液加入浓缩液中至乙醇体积分数达到80%，4 ℃下沉淀多糖，醇沉后，4 000×g下离心20 min，加水复溶，Sevag法去除游离蛋白，透析、浓缩、冻干，得黑灵芝精多糖。

1.3.2 建立糖尿病大鼠模型

随机分10 只作为正常对照组（control group，CN）饲喂普通饲料，其余50 只作为造模组，给予高糖高脂饲料，饲养8 周后禁食12 h。禁食结束后每千克体质量大鼠进行尾静脉注射含30 mg STZ的溶液，正常组大鼠尾静脉注射等体积的柠檬酸缓冲液。72 h后用血糖仪检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）浓度，在造模后的第3、7天测得FBG浓度不小于11.1 mmol/L视为造模成功。剔除血糖不符合标准和造模死亡的大鼠，成模率约为67%。

1.3.3 动物分组、剂量设置及给药方法

将造模成功的糖尿病大鼠随机分为以下6 组：模型组（diabetes mellitus group，DM）、阳性对照组（metformin group，MET）、黑灵芝多糖低剂量组（PSG low dose group，PSGL）、黑灵芝多糖中剂量组（PSG middle dose group，PSGM）、黑灵芝多糖高剂量组（PSG high dose group，PSGH）和CN组。黑灵芝多糖组和MET组分别采用黑灵芝多糖水溶液（25、50、100 mg/kgmb）与150 mg/kgmb二甲双胍水溶液进行灌胃，CN组和DM组大鼠通过灌胃的方式给予相同体积的去离子水，灌胃剂量为0.2 mL/10 gmb，持续干预30 d。

1.3.4 FBG及胰岛素水平测定

给药前及给药期间每周测定1 次FBG浓度，监测各组FBG浓度，采血当天各组大鼠禁食（不禁水）12 h，以采血针刺破大鼠尾尖毛细血管采血，使用血糖仪测定大鼠FBG浓度。

采用酶联免疫吸附测定法测定血清胰岛素水平，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。根据血清胰岛素值计算大鼠胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment insulin resistance index，HOMA-IR），如公式（1）所示。

1.3.5 血脂水平测定

收集血清，采用全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL）水平。

1.3.6 肠道收集及形态病理学观察

大鼠解剖后，迅速取出小肠组织，选择约5 cm空肠，尽量避免如镊子、剪刀使用不当等人为损坏行为，生理盐水轻轻清洗后，使用干净滤纸吸去水分，放入体积分数4%中性甲醛溶液固定24 h以上。随后，将组织块从固定液中取出，脱水、石蜡包埋、连续切片、贴片、脱蜡与复水，经HE染色后，在显微镜下观察空肠组织形态的变化。

1.3.7 盲肠内容物的SCFAs浓度测定

参照实验已建立的色谱分析条件和方法[10]，称取适量乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸等标准品于100 mL容量瓶中，定容混匀，配制成梯度混合溶液。气相色谱重复测定3 次，根据对应浓度的色谱图，计算数据并绘制标准曲线。取大鼠结肠内容物按1∶7（m/V）加入超纯水，涡旋后超声处理，然后置于冰浴中20 min，4 800×g离心20 min，取上清液过0.22 μm水相滤膜后进气相色谱分析，利用Hu Jielun等[10]的色谱方法测得对应SCFAs峰面积，根据标准曲线方程按公式（2）计算上清液中各SCFAs浓度。

1.3.8 16S rDNA高通量测序及微生物多样性分析

收集大鼠粪便样本，寄送至上海派森诺生物科技有限公司进行高通量测序文库的构建和Illumina MiSeq测序。通过基因组DNA抽提，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，荧光定量，Illumina PE250测序得到的DNA双端测序读段（pairedendsequencing reads，PE reads），采用DADA（divisive amplicon denosing algorithm）2方法进行降噪，拼接及去嵌合体，以100%相似度阈值进行分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类，进一步采用Alpha多样性分析（Chao1指数、Shannon指数、Faith_pd指数、Good’s coverage），Beta多样性分析（主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）、非度量多维尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析），分类学组成分析、物种差异性分析（韦恩图、线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）、LDA差异贡献分析（LDA effect size，LEfSe）、随机森林分析）等分析方法获得微生物相关信息。

1.4 数据处理与分析

实验数据用平均值±标准偏差表示，采用SPSS 11.5软件进行数据统计处理，采用ANOVA法进行单因素方差分析，P＜0.05表示显着差异，P＜0.01表示极显着差异，采用GraphPad prism 6.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 黑灵芝多糖对大鼠FBG浓度及胰岛素水平的调节

HOMA-IR用于评价个体的胰岛素抵抗水平，随着胰岛素抵抗水平升高而升高。由图1可知，与CN组相比，糖尿病大鼠的FBG浓度显着升高（P＜0.05），同时胰岛素抵抗明显。高糖高脂饮食能够破坏部分胰腺组织，造成模型动物胰岛素分泌相对不足，从而引发高血糖，高血糖能反馈性促进胰岛素分泌，高脂饲养后造成模型大鼠胰岛素抵抗，进一步加重高胰岛素血症。使用糖尿病传统治疗药物二甲双胍干预后，能显着抑制糖尿病大鼠血糖浓度及胰岛素抵抗水平的升高。与未经处理的糖尿病DM组大鼠相比，灌胃黑灵芝多糖后的FBG浓度显着降低（P＜0.05），同时HOMA-IR也显着减小（P＜0.05），表明黑灵芝多糖能缓解糖尿病引发的大鼠血糖升高和胰岛素抵抗，改善其胰岛素敏感性。数据进一步显示，在调节血糖水平和胰岛素抵抗水平方面，PSGM组治疗效果较优于PSGL、PSGH组，并不呈现剂量依赖性，为后续选择PSGM组研究多糖对肠道菌群的影响提供一定的数据支持。

图1 黑灵芝多糖对糖尿病大鼠血糖和胰岛素抵抗的影响Fig. 1 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on FBG and insulin resistance in diabetic rats

2.2 黑灵芝多糖对大鼠脂代谢的影响

如表1所示，与CN组相比，DM组TC、TG和LDL-C水平显着升高（P＜0.05），而作为逆向转运胆固醇到肝脏代谢的载体——HDL-C，其含量却略高于正常组，但无显着性差异，这可能由于血清中胆固醇含量增高使得HDL-C水平出现伴随性增加，但其转运速率远不及胆固醇的摄入速率，从而导致胆固醇的累积。同时，与DM组相比，PSGL、PSGM、PSGH组的TC、TG、LDL-C水平均表现出下降趋势，并呈现出剂量依赖关系，多糖剂量越高，干预效果越好，低、中、高剂量对这3 个指标都表现出显着的改善作用（P＜0.05）；值得关注的是，在服用中剂量的黑灵芝多糖水溶液后，糖尿病大鼠血清中HDL-C水平进一步升高，与其他组相比具有显着性差异（P＜0.05）。

表1 黑灵芝多糖对大鼠脂代谢的影响Table 1 Effect of polysaccharide from Ganoderma atrum on lipid metabolism in rats

2.3 黑灵芝多糖对糖尿病大鼠肠道组织形态学的保护作用

肠道连接内部和外部环境，不仅调控营养物质的吸收，还具有免疫、生理和物理屏障功能。肠上皮作为肠道的重要组成部分，由绒毛和隐窝、上皮和内皮细胞组成，能够阻止外界不良因素的刺激和入侵，发挥物理屏障作用，肠道屏障可与其他屏障一起共同应对突然出现的应激。在本实验中，对空肠组织进行HE染色，如图2所示，CN组大鼠的空肠黏膜上皮细胞排列紧密，肠绒毛无明显断裂肿胀等症状，形态结构完整；DM组部分小肠绒毛上皮断裂脱落，隐窝深度明显降低，形态结构受到严重的破坏，间质充血并有炎细胞浸润；与DM组相比，多糖组和MET组空肠形态结构有所改善，绒毛增长，肿胀程度减轻，炎性细胞浸润减少，表明黑灵芝多糖对糖尿病大鼠的肠道组织损伤有一定保护作用。

图2 HE染色观察肠道组织病理学变化（×40）Fig. 2 Histological change in intestine of rats (× 40)

2.4 黑灵芝多糖对大鼠盲肠内容物中SCFAs的影响

以上有关血糖水平与胰岛素抵抗水平研究中，数据显示PSGM组相关指标略优于PSGH组，黑灵芝多糖在机体内的有效作用与剂量之间没有呈现预期的正相关依赖关系，结合其他实验参数（脂质代谢相关指标中PSGH组大鼠指标均优于PSGM组大鼠），提示了黑灵芝多糖体内作用模式较为复杂。大量研究发现，体内剂量-效应关系的作用方式一般呈现抛物线形式，通常随着剂量的增加，效应或反应率的变化先迅速，之后相对缓慢，形成抛物线形状。药物效应强度是实验剂量选择的重要参数，是指能引起等效反应（一般采用50%效应量）的相对浓度或剂量，反映药物与受体的亲和力，其值越小则强度越大。药物的最大效能与效应强度含意有本质区别，二者并不平行。因此在同等活性功能（或差距接近）的情况下，选取剂量小的作为进一步研究，有利于探寻到更多的实验可能。谢瑛[11]发现多糖的体内作用模式呈现出一种非线性关系，且高剂量组未出现预期的最佳活性功能。因此本实验选择的PSGM组（50 mg/kgmb）进行盲肠内容物中SCFAs和肠道微生物检测分析。

肠道菌群参与机体生命活动的主要方式之一是产生SCFAs，SCFAs是肠道菌群发酵膳食纤维的主要产物，还可以通过外源摄入获取，其分子结构小且不稳定，主要包括了乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸6 种，其中乙酸、丙酸和丁酸约占所有SCFAs的95%以上[12]。本研究检测了大鼠粪便样本中以上6 种SCFAs浓度，组间变化如图3所示，与CN组相比，DM组大鼠粪便中乙酸、异丁酸、戊酸、异戊酸浓度显着下降（P＜0.05，P＜0.01），丁酸浓度有降低趋势；相反，丙酸浓度在DM组中极显着升高（P＜0.01）。经过二甲双胍治疗和黑灵芝多糖灌胃干预后，MET组和PSGM组大鼠粪便中丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸浓度相较于DM组有所增加，丙酸浓度极显着降低（P＜0.01），与CN组无显着性差异；PSGM组的异丁酸、戊酸和异戊酸3 种代谢产物浓度与DM组对比具有显着性差异（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 黑灵芝多糖对短链脂肪酸的影响Fig. 3 Effect of Ganoderma atrum polysaccharide on intestinal SCFAs

不同SCFAs对糖尿病的影响存在差异，Sanna等[13]研究发现肠道菌群产生的丁酸能调节葡萄糖稳态，改善人体的胰岛素抵抗；而粪便中丙酸盐含量增加会提高2型糖尿病的患病风险[12]。然而，Lin等[14]给肥胖小鼠膳食中补充丁酸、丙酸和乙酸盐，发现丁酸和丙酸可以通过减少摄入量预防饮食引起的肥胖和胰岛素抵抗的作用。这些相关性的证据表明SCFAs积极参与到在糖尿病发展中。本实验研究发现糖尿病大鼠粪便中丙酸浓度增加，与FBG浓度和HOMA-IR成正比，说明丙酸异常与糖尿病密切相关，但其在糖尿病中的作用还存在争议，需要进一步研究。黑灵芝多糖抗糖尿病作用可能通过降低丙酸含量，促进丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸分泌，差异性调节SCFAs水平来发挥作用。

2.5 黑灵芝多糖对肠道菌群的物种多样性及组成的影响

2.5.1 OTU数及Alpha多样性分析

基于OTU数分别在门、纲、目、科、属、种分类等级进行分析，不同分组的注释情况如图4所示。Venn图结果显示4 组重叠部分代表组间共有的OTUs，共655 个；DM组、MET组和PSGM组与CN组单独重合OTU个数分别为244、384、637 个，说明黑灵芝多糖组与正常组OTU相似度高于DM组与正常组。

生态学中通常用Alpha多样性来衡量个体内菌群的多样性，通过多个指标反映出生境下的物种丰富度、多样性和均匀度等方面。肠道菌群的物种多样性主要由Chao1指数、Shannon指数、Faith_pd指数和Good’s coverage反映。如图4所示，DM组的Chao1、Faith_pd指数较CN组均有降低，MET组呈回升趋势；Shannon指数组间无明显变化。与DM组的糖尿病大鼠相比，黑灵芝多糖具有抑制肠道菌群丰富度下降的能力，使Chao1指数趋近于CN组；并能增加菌群的物种多样性。总而言之，患有糖尿病的大鼠肠道微生物丰富度遭到破坏，导致肠道菌群失调，而黑灵芝多糖干预可以一定程度上平衡失调的肠道菌群。

图4 大鼠肠道菌群Venn图和Alpha多样性指数Fig. 4 Venn diagram and alpha-diversity indexes of gut microbiota in mice

2.5.2 Beta多样性分析

使用QIIME软件计算Beta多样性，通过分析Beta多样性指数比较各组间微生物组成相似度。基于样本中物种丰度信息进行PCoA，采用非加权UniFrac距离算法，结果如图5A所示，CN组与DM组分开聚集，微生物群落的差异明显，PC1为26.3%，PC2为15.4%。与DM组相比，多糖组微生物群落沿第一主坐标（PCo1）向CN组偏移，组内中心连接点与正常组中心点的距离小于DM组与CN组的距离，在一定程度上能改变肠道菌群的结构分布；MET组沿着PC1和PC2远离DM组，更接近CN组，能显着改变肠道菌群的分布，改善肠道菌群失调。使用NMDS分析进一步验证不同组之间的物种多样性差异，结果如图5B所示，CN组和DM组之间发生明显的分离；多糖组组内个体间虽然不明显聚集，但都表现出偏离DM组向CN组靠近的趋势，与DM组比较，其中心连接点与CN组间的距离缩短。以上结果表明DM组和CN组肠道微生物的物种组成存在显着性差异，黑灵芝多糖可以调节肠道菌群物种结构组成，减小由STZ诱导的糖尿病大鼠与正常大鼠肠道菌群物种组成间的差异。

图5 Beta多样性变化Fig. 5 Variation in Beta-diversity

2.5.3 肠道微生物菌落组成分析

通过与Greengenes数据库进行比对，对OTU进行物种分类，重点分析门水平和属水平上大鼠菌群结构组成。

图6A为门水平上各组的物种组成分类柱状聚类图，大鼠肠道微生物主要由10 个门构成，分别为Firmicutes、Bacteroidetes、变形杆菌（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、糖细菌门（TM7）、螺旋体门（Spirochaetes）、软壁菌门（Tenericutes）、蓝藻细菌门（Cyanobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、迷踪菌门（Elusimicrobia）。其中Firmicutes和Bacteroidetes均为优势菌门，是丰度最高的两个菌门。比较组间丰度变化发现，由于STZ的干预，DM组较CN组的Firmicutes相对丰度显着降低，而Bacteroidetes相对丰度明显上升；相比于DM组，MET组和多糖组的Firmicutes相对丰度呈现不同程度的增加，Bacteroidetes相对丰度减少，说明黑灵芝多糖可以缓解由糖尿病引发的菌群结构失调，但干预效果低于二甲双胍。F/B可以在一定程度上作为反映肠道菌群紊乱的重要指标，并且与BMI和血糖有关。对比各组F/B平均值变化（图6B），发现与CN组比较，DM组F/B平均值极显着减小（P＜0.01），与血糖值呈负相关；MET组可以让糖尿病大鼠菌群F/B恢复正常水平；多糖组相较于DM组，F/B平均值有一定程度的上升，与CN组相比没有显着性差异。

图6C是各组在属水平上分类学结果，乳酸菌（Lactobacillus）和普雷沃菌属（Prevotella）在各组中均为优势菌属；与CN组相比，DM组普雷沃菌属（Prevotella）、布劳特氏菌属（Blautia）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、梭菌属（Clostridium）和链球菌属（Streptococcus）相对丰度增加；Lactobacillus、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、颤螺菌属（Oscillospira）、拟杆菌属（Bacteroides）丰度明显降低；与DM组比较，黑灵芝多糖灌胃后大鼠粪便中Prevotella、Blautia、Phascolarctobacterium、CF231的相对丰度降低，而Clostridium、粪球菌属（Coprococcus）、Turicibacter、Bacteroides相对丰度增加；柯林斯氏菌属（Collinsella）、Bifidobacterium、罗斯伯里氏菌属（Roseburia）、Allobaculum主要出现在PSGM组和MET组中。

图6 各组大鼠肠道微生物菌落组成Fig. 6 Composition of gut microbiota in mice from each group

2.5.4 门水平和属水平组间差异物种分析

基于LEfSe筛选出CN、DM和PSGM组组间丰度差异显着物种，柱长越长代表该分类单元的差异越显着，本次实验分析的LDA阈值为2.0。同时，应用随机森林分类算法进行筛选，图7分别为门分类水平和属分类水平的评分结果。结合两种分析方法，筛选出重要性评分高并且具有明显组间差异物种，并选出DM组与PSGM组间具有显着差异的物种，观察其相对丰度变化情况。

图7 大鼠肠道菌群组间差异显着性分析Fig. 7 Significance analysis of differences in gut microbiota between groups

门水平上显着差异物种相对丰度变化如图8所示，DM组大鼠Firmicutes和Cyanobacteria的相对丰度极显着降低，而Bacteroidetes的相对丰度要高于CN组。Cyanobacteria在肠道中占比较少，属于革兰氏阴性菌。Pandurangan等[15]通过STZ刺激大鼠建立糖尿病模型，使用Cyanobacteria灌胃进行干预，发现其可以降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平，增加血浆胰岛素，具有抗氧化、抗糖尿病作用。本实验结果显示，当灌胃黑灵芝多糖后，大鼠肠道内的Cyanobacteria相对丰度极显着增加（P＜0.01），与CN组无明显差异。个体间肠道菌群组成往往存在着很大差异，然而在门水平上物种组成又呈现出相对稳定的状态，个体间差异主要表现在物种丰度变化。本实验发现3 个差异物种，虽然Firmicutes、Bacteroidetes和Cyanobacteria中还包含了许多不同的菌属，但认为其组间相对丰度变化可以看作一种趋势性变化，具有代表性，可能与疾病以及多糖作用机制密切相关，并且从以往的研究中可以知道这种趋势具有较好的重复性，易于比较和解读。

图8 大鼠肠道菌群组间门水平差异物种Fig. 8 Difference in gut microbiota between groups at phylum level

属水平上显着差异物种相对丰度变化如图9所示，Firmicutes中Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira的相对丰度在糖尿病大鼠肠道中都表现出不同程度的下降，其中DM组的Lactobacillus和Oscillospira与CN组相比具有极显着性差异（P＜0.01）。Bacteroidetes中Prevotella、CF231在DM组中富集，其中CF231未在CN组大鼠粪便内检出，Bifidobacterium相对丰度相比于CN组有所增加。黑灵芝多糖干预可显着上调Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira、Bifidobacterium相对丰度，下调Prevotella、CF231相对丰度，使之趋于正常。并且检测到Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira4 个菌属在多糖组大鼠粪便中非常丰富，高于CN组和MET组。猜测这4 个菌种可能是黑灵芝多糖发挥其肠道调节功能的目标菌属，虽然在肠道中所占比例较少，但个别物种丰度的变化可能是疾病治疗的关键。

Bacteroidetes以产乙酸和丙酸为主，Firmicutes以产丁酸为主，其包含的Prevotella、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira都可将多糖发酵成SCFAs。糖尿病作为一慢性代谢性疾病，因持续的高血糖刺激，机体往往伴随着复杂的慢性炎症表现。前期研究结果显示黑灵芝多糖的抗糖尿病作用与其抗炎作用相关[8,16]。有研究报道肠道内拥有较高水平的Roseburia细菌的小鼠可以减少炎症、动脉粥样硬化患病风险及高血糖并发症的危害，Roseburia是产丁酸的主力；Oscillospira通过降解利用多糖产生丁酸盐参与炎症预防[17-19]；而Prevotella主要分泌琥珀酸和乙酸，在有胰岛素抵抗的妊娠期糖尿病女性肠道内含量丰富，并且被证明与2型糖尿病胰岛素抵抗增加有关，可能是2型糖尿病患者的肠道微生物中的特征菌[20-21]。本实验结果也证明，在DM组中，Prevotella富集的同时大鼠胰岛素抵抗情况加重。经过黑灵芝多糖的治疗，Prevotella丰度降低，血清胰岛素抵抗水平降低。实验结果说明黑灵芝多糖可以通过调节不同菌的丰度，缓解糖尿病症状，并且通过调节产酸菌的丰度来影响糖尿病大鼠粪便中SCFAs含量，对宿主发挥进一步的保护作用。

因此，黑灵芝多糖可能下调Bacteroidetes和Prevotella、CF231，通同时上调Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira、Bifidobacterium，进而调节不同SCFAs分泌来发挥治疗作用。

图9 大鼠肠道菌群组间属水平差异物种Fig. 9 Difference in gut microbiota between groups at genus level

3 讨 论

黑灵芝多糖是黑灵芝中水溶性膳食纤维组分，本实验以黑灵芝菌盖为原材料提取到灵芝多糖，其主要由核糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，按照0.20∶0.28∶1.00∶4.32∶2.21物质的量比组成[22-23]。黑灵芝多糖被认为是黑灵芝的主要活性成分，研究发现其具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、降血糖及肠道保护等多种生理功能调节作用。基于黑灵芝多糖的降血糖功能，本实验发现该多糖具有2型糖尿病保护作用，其作用机制与肠道菌群密切相关。

肠道细菌生态系统的改变可能导致代谢紊乱的发展，如2型糖尿病和肥胖症。当长期摄入高糖高脂饮食，可能会改变肠道细菌特征和菌群结构，导致SCFAs减少，有益菌降低，而脂多糖等内毒素分泌增加并进入人体，从而参与炎症、胰岛素抵抗和与肥胖相关的2型糖尿病的发生[24-25]。本实验预先采用高糖高脂饲料喂养大鼠8 周，造成胰岛素抵抗，然后使用STZ尾静脉注射诱发大鼠产生糖尿病。造模成功后，灌胃黑灵芝多糖水溶液干预大鼠糖尿病发展，检测大鼠肠道菌群的组成结构的变化。根据高通量测序的结果，发现DM组和CN组之间Alpha多样性和Beta多样性有显着性差异。糖尿病大鼠菌群丰富度明显低于正常大鼠，PCoA显示CN组大鼠表现出组内聚集，个体间菌群组成相似；相反，糖尿病大鼠远离CN组，个体间较为分散，菌群组成有差异；黑灵芝多糖能一定程度上调节菌群结构向CN组靠近，说明菌群失调是伴随着糖尿病发生与发展的，并且个体间表现出很大差异性，黑灵芝多糖的干预能改善菌群失调的状态。

接着从两个方面去尝试分析黑灵芝多糖对糖尿病大鼠肠道微生物改变的影响。第一，对菌群的物种结构变化的影响。基于LEfSe分析和随机森林分类算法筛选出两个分类学水平上的差异菌群，门水平上Firmicutes、Bacteroidetes和Cyanobacteria丰度组间有显着性差异，糖尿病大鼠中Firmicutes和Cyanobacteria丰度显着降低。此外，本实验计算了F/B，结果发现DM组的F/B比CN组低，多糖组有一定恢复，但无显着性。根据资料显示许多糖尿病研究中将F/B改变作为肠道菌群在肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的标志性变化，并与血糖水平和BMI有关[26]。此次实验结果与前人研究结果[4]一致，但多糖组似乎没有表现出很明显的上调F/B的作用。

进一步在属水平上筛选出了8 个菌属，发现CF231是糖尿病大鼠中富集，在多糖组中丰度显着降低。CF231是帕拉普氏菌科（Paraprevotellaceae）的一个属，Yun等[27]研究发现CF231在超重患者肠道内丰度增加，与BMI正相关。而Prevotella被报道发现与糖尿病胰岛素抵抗增加有密切关系，并且Prevotella产生的琥珀酸通过一定合成路径可以生成丙酸，这可能是导致DM组中丙酸异常增加原因之一，进而提高2型糖尿病患病风险[20-21,28]。由于丙酸在宿主中的作用是多样的，其在2型糖尿病中的具体机制还需要进一步验证和探究。

本实验观察到多糖组Lactobacillus、Ruminococcus、Coprococcus、Roseburia、Oscillospira的相对丰度显着增加，Bifidobacterium在MET组中增加更为明显。Lactobacillus和Bifidobacterium是人体肠道内重要益生菌，具有降血糖、降血脂、预防肠道疾病等多种作用[29]。Bauer等[30]发现高脂饮食会降低乳酸菌的丰度，二甲双胍可以通过增加乳酸杆菌的丰度，部分调节小肠菌群，影响肠道吸收葡萄糖的重要转运蛋白从而控制血糖水平，这为黑灵芝上调乳酸菌丰度的作用机制提供思路。

第二，黑灵芝多糖对菌群代谢物的影响。膳食纤维经过微生物的发酵降解产生具有一定生物活性的代谢产物，代谢产物由SCFAs、维生素、气体等组成[31]。SCFAs部分由结肠上皮细胞吸收，部分通过血液进入体循环，在各组织中发挥作用。丁酸是肠上皮细胞的重要能量来源，同时在维持肠道内环境稳态、保持肠道结构和功能的完整性等方面具有重要意义。研究发现丁酸对2型糖尿病的预防和治疗有显着贡献，产生丁酸的细菌丰富度可能与2型糖尿病治疗密切相关[32]。Roseburia是产生丁酸的主要贡献菌，同时也是肠道膳食纤维的主要降解剂，膳食纤维木聚糖和甘露聚糖等可以通过Roseburia在肠道中发挥调节作用[33]。Coprococcus参与丁酸产生途径包括磷酸/丁酸激酶途径和丁酰辅酶A/乙酰辅酶A转移路线[19]。同时，Ruminococcus和Bifidobacterium是乙酸的主要产生菌。

总之，本研究表明，黑灵芝多糖对可通过维系大鼠肠道中微生物的结构及SCFAs分泌水平的正常化，对STZ诱导的糖尿病大鼠血糖血脂和胰岛素抵抗具有一定调控作用。黑灵芝多糖进入肠道后可以被肠道菌群利用，通过下调肠道微生物中的特征菌增加部分产酸菌的丰度，进而促进产酸菌SCFAs的分泌。

4 结 论

本实验利用STZ尾静脉注射的方法建立了大鼠2型糖尿病模型，探究了黑灵芝多糖对2型糖尿病大鼠血糖血脂的调节作用，以及对肠道菌群和其代谢产物SCFAs的影响。主要实验结论如下：1）黑灵芝多糖可以显着降低糖尿病大鼠血糖血脂水平，并减轻胰岛素抵抗；2）黑灵芝多糖能够通过改善糖尿病造成的肠道组织形态结构损伤，改变大鼠肠道微生物的数量和结构，发挥肠道保护作用，黑灵芝多糖通过下调门水平Bacteroidetes和属水平Prevotella、CF231相对丰度，同时上调门水平Firmicutes和Cyanobacteria，属水平Lactobacillus、Roseburia、Oscillospira、Ruminococcus、Coprococcus、Bifidobacterium相对丰度，改善2型糖尿病大鼠肠道菌群失调；3）黑灵芝多糖可以差异性调节SCFAs含量，抑制丙酸含量异常升高，同时促进丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸分泌，这可能是通过调节相应产酸菌丰度实现的。以上结果说明黑灵芝多糖对肠道菌群及其代谢产物的调节作用可能是其发挥抗糖尿病作用的机制之一。