黄欣莉，韩延超，陈杭君，房祥军，吴伟杰，刘瑞玲，郜海燕
（浙江省农业科学院食品科学研究所，农业农村部果品产后处理重点实验室，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江 杭州 310021）
香菇（）又称冬菇、香覃，具有独特的香气和口味，富含膳食纤维、维生素、氨基酸、矿物质，有益于人体健康，食用和药用价值很高。市场上销售的香菇以新鲜香菇为主。香菇贮藏过程中的温度、湿度、气体等外界环境的改变均会影响香菇的贮藏品质。新鲜香菇在采后易发生褐变，香菇的褐变不仅影响其商业价值，也会造成其感官品质的下降和营养成分的损失。褐变问题是香菇保鲜加工中亟待解决的问题。目前控制香菇褐变有化学保鲜剂处理、热处理、微波、紫外照射、臭氧处理、涂膜等方法。
香菇褐变常伴随着酶促反应，当果蔬衰老或受外界条件的影响时，细胞膜结构发生破坏，在有氧气存在的条件下，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）与底物接触，从而使组织褐变，可以降低果蔬组织的PPO活力，抑制呼吸作用，延长保质期。1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）处理抑制香菇PPO的活力，保持香菇色泽，减缓香菇褐变。氩气能够有效控制香菇呼吸强度、褐变度及PPO活力的升高，降低香菇褐变的速度，有利于香菇的保鲜。
近年来研究表明，果蔬褐变的发生可能是由于能量供应有限或产生速率慢，能量缺乏和氧自由基共同作用可能导致细胞膜损伤，从而引起褐变的发生。Chen Mengyin等研究发现腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）处理能延缓龙眼果皮细胞膜通透性的增加，较好地维持细胞膜中酚类物质与PPO在细胞中的区室化分布，有效降低龙眼果实果皮褐变指数。王甜的研究发现褪黑素处理的荔枝果实呈现出较高ATP含量和能荷水平，这有利于维持果实细胞膜完整性，延缓荔枝果实褐变和衰老。在食用菌方面也有类似的报道，利用麦角硫因处理双孢蘑菇可以提高双孢蘑菇能量代谢相关酶活力，保证线粒体的ATP合成能力，并保持细胞膜的完整性，从而延缓采后双孢蘑菇褐变和衰老；此外，利用负离子水处理40 min可使香菇保持相对稳定的能荷水平，有助于细胞自我修复，维持代谢稳态，同时可以延缓香菇的褐变与衰老。
本实验首先通过研究不同质量浓度1-MCP处理对采后香菇在贮藏期间呼吸与褐变相关酶活力的影响，确定最佳1-MCP处理剂量，进一步探讨1-MCP处理对香菇子实体能量代谢的影响，以期揭示能量代谢在香菇褐变过程中的调控作用，为香菇采后褐变控制和保鲜提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
‘L901’香菇 浙江武义创新食用菌有限公司。
1-MCP泡腾片剂（有效成分质量分数0.18%）上海利统生化制品有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钾、乙醇 上海凌锋化学试剂有限公司；邻苯二酚 上海麦克林生化科技有限公司；细胞色素c上海源叶生物技术有限公司；二甲基对苯二胺 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；氢-钾ATP酶、钠-钾ATP酶试剂盒 南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
Bifugo stratos高速冷冻离心机 美国Thermo公司；UV-9000紫外-可见分光光度计、e2695分析型高效液相色谱仪 美国Waters公司；Spark 10M多功能酶标仪瑞士TECAN公司；CR-400 手持色差仪 日本柯尼卡美能达公司。
1.3 方法
1.3.1 香菇的1-MCP气体熏蒸处理
‘L901’香菇于2021年7月2日采收，挑选出大小、成熟度一致、表面无机械损伤和病虫害的子实体于采收当日运至实验室，4 ℃预冷12 h后进行1-MCP气体熏蒸处理。
每个处理组香菇子实体鲜质量为（250±10）g，每个处理3个重复。将子实体放入5 L密闭熏蒸箱内，将0.69、1.39、2.08 g的1-MCP泡腾片剂分别放入盛有25、50、75 mL去离子水的烧杯中，将烧杯置于熏蒸箱底部中央，使密闭熏蒸箱内1-MCP气体质量浓度分别为0.00（即对照组）、0.25、0.50、0.75 mg/L，熏蒸12 h，将熏蒸后的子实体装入4 mm厚的聚乙烯保鲜袋（340 mm×240 mm）中，于4 ℃下贮藏，在贮藏的0、3、6、9、12 d随机取样测定相关指标。
1.3.2 色泽的测定
用CIELab法测定香菇菌盖处色泽，每个处理测定10个香菇子实体，每个子实体测定3 次，取平均值，得到香菇菌盖的*、*、*值。采用Photoshop软件拟合*、*、*值得到模拟颜色。Δ代表贮藏结束时香菇与第0天香菇的色差，采用CIE 1976公式（式（1））进行计算，Δ可以反映香菇样品色泽变化程度。
1.3.3 褐变度的测定
参照文献[17]的方法进行测定，称取2 g香菇子实体样品，加入5 mL 95%（体积分数）乙醇溶液研磨成匀浆，10 000 r/min离心20 min后取上清液，测定420 nm波长处吸光度以表征褐变度。
1.3.4 呼吸强度的测定
参照文献[18]的方法并稍作修改。将100 g香菇子实体放置于固定体积的真空干燥器内，采用静置法测定呼吸强度，重复3 次，单位为mg/（kg·h）。
1.3.5 多酚氧化酶活力的测定
PPO活力测定参照文献[7]所述方法，称取1 g香菇子实体样品加入5 mL预冷的磷酸钠缓冲液（0.1 mol/L、pH 7.0，后同），4 ℃下匀浆后在12 000 r/min离心20 min，收集上清液得到粗酶液。采用1.0 mL 0.05 mol/L邻苯二酚、4.0 mL 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）和200 μL粗酶液进行测试。将反应混合物在25 ℃水浴加热0.5 min，以等体积磷酸钠缓冲液代替酶液作为空白对照，采用分光光度计测定420 nm波长处测吸光度，每30 s记录1 次。以每克样品（均以鲜质量计，后同）每分钟吸光度变化0.01为1个酶活力单位U，单位为U/g，重复3 次。
1.3.6 ATP、AMP、ADP含量和能荷水平的测定
参照文献[19]的方法，将2.50 g香菇子实体样品在液氮中快速冷冻后均质成粉末，加入10.0 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液冰浴1 min，以提取磷酸腺苷。于4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取6 mL上清液，用1 mol/L KOH溶液调节至pH值为6.6±0.1。将中和后的上清液冰浴静置30 min，然后在4 ℃条件下，4 000 r/min离心20 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤后定容至10 mL，备用。
高效液相色谱条件：流动相为磷酸缓冲液（pH 7.0），流速为1.0 mL/min，进样量20 μL，检测波长为254 nm。采用外标法测定ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）的含量，重复6 次，单位为mg/g。能荷水平按公式（2）计算。
1.3.7 能量代谢相关酶活力测定
细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）活力：参照文献[20]的方法略有改动。1 g香菇子实体样品加入9 mL 50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl缓冲液，含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L乙二胺四乙酸和0.5 g/L聚乙烯吡啶烷酮，4 ℃、4 000 r/min离心10 min。收集上清液，在4 ℃下12 000 r/min离心20 min。用洗涤缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl缓冲液，含0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇和1 mmol/L乙二胺四乙酸）洗涤2 次。最后的沉淀物用洗涤缓冲液溶解，得到线粒体粗酶液。取0.4 mL的线粒体粗酶液，加入1.5 mL 0.4 mg/L细胞色素c，再加入1.5 mL 4 mg/L二甲基对苯二胺溶液，在37 ℃下保温2 min，以未加酶液的反应体系为空白对照，测定在550 nm波长处的吸光度。以每克样品每分钟OD值变化0.01为1个酶活力单位U，最终结果以U/g表示，重复3 次。
SDH活力：使用SDH酶试剂盒测定，以每克组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为1个活力单位U，最终结果以U/g表示，重复3 次。
ATP酶活力：使用氢-钾ATP酶试剂盒、钠-钾ATP酶试剂盒测定，以每小时每克组织的ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷为1个活力单位U，最终结果以U/g表示，重复3 次。
1.4 数据处理与分析
数据采用Excel 2019软件进行计算，设置3个平行，结果以平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism 8软件作图，采用SPSS 24软件进行单因素方差分析，采用Duncan检验进行显着性检验分析，＜0.05表示差异显着。
2 结果与分析
2.1 1-MCP处理对香菇色差和褐变度的影响
由图1可知，与0 d相比，随着贮藏期的增加，香菇发生褐变，贮藏期越长，香菇褐变越严重，与0 d香菇的颜色差异越明显。与对照组相比，在贮藏期间1-MCP处理组的香菇色泽变化较小，且0.50 mg/L处理组的香菇色差在贮藏期内一直处于最低水平。在贮藏末期，各处理组的香菇均已处于生命末期，失去商品价值，色泽变化较小。图1B显示，香菇随着贮藏时间的延长，褐变度不断上升，但经1-MCP处理的香菇褐变度均低于对照组。贮藏过程中，前3 d对照组香菇褐变比较明显，之后至贮藏末期褐变度略有增加；1-MCP处理的香菇褐变度增加缓慢，但当1-MCP处理质量浓度过高时，也会促使褐变度增加。其中0.25 mg/L和0.50 mg/L 1-MCP处理的香菇褐变度在整个贮藏期内均显着低于对照组（＜0.05）。由此可见，1-MCP处理可以延缓香菇色泽的不良变化，0.25 mg/L和0.50 mg/L 1-MCP处理抑制效果较好。
图1 不同质量浓度1-MCP处理对香菇色差和褐变度的影响Fig. 1 Effects of treatment with different 1-MCP concentrations on the color difference and browning degree of Lentinus edodes
2.2 1-MCP处理对香菇呼吸强度的影响
由图2可知，1-MCP处理能降低香菇的呼吸强度，且0.50 mg/L的1-MCP处理能明显抑制香菇呼吸强度。在0～12 d内，各处理香菇的呼吸强度总体呈现先上升后下降的变化规律，自第6天后，香菇的呼吸强度均开始下降。对照组香菇的呼吸强度在贮藏期间一直维持较高水平。对照组、0.25、0.50、0.75 mg/L处理组香菇呼吸强度峰值分别为86.39、87.85、66.00、70.25 mg/（kg·h），对照组、0.25、0.75 mg/L 1-MCP处理组的呼吸高峰出现在第3天，0.50 mg/L处理组的呼吸强度在第6天达到峰值。香菇为典型的呼吸跃变型食用菌，且在一定质量浓度范围内，1-MCP处理能够明显降低香菇的呼吸强度，减弱香菇在采后的呼吸作用。
图2 不同质量浓度1-MCP处理对香菇呼吸强度的影响Fig. 2 Effect of treatment with different 1-MCP concentrations on the respiration intensity of Lentinus edodes
2.3 1-MCP处理对香菇多酚氧化酶活力的影响
PPO能催化多种酚底物的氧化，随着贮藏时间的延长，果蔬膜结构逐渐破损，从而打破了PPO和酚类物质的区域化分布，使其相互接触生成褐变物，而引起果蔬褐变。图3为香菇贮藏期间PPO活力的变化情况。整个贮藏期间，PPO活力不断升高，造成香菇褐变程度加剧。经1-MCP处理后的香菇PPO活力始终低于对照组，贮藏6 d后出现显着性差异（＜0.05），表明1-MCP处理可以抑制PPO活力增加，推迟PPO活力的高峰出现时间，且1-MCP处理组的PPO活力峰值显着低于无处理组（＜0.05）。实验结果表明，1-MCP处理能显着抑制PPO活力，阻碍黑色素物质的产生与积累。
图3 不同质量浓度1-MCP处理对香菇PPO活力的影响Fig. 3 Effect of treatment with different 1-MCP concentrations on PPO activity of Lentinus edodes
2.4 1-MCP处理对香菇ATP、AMP、ADP含量和能荷的影响
ATP含量减少及能荷水平的下降意味着维持细胞生命活动所需要的能量不足，使果蔬采后生理代谢瓦解，细胞膜结构破坏，从而加速品质劣化。图4A显示香菇在贮藏过程中ATP含量先上升后下降，1-MCP处理的香菇ATP含量显着高于对照组（＜0.05）。图4B显示在对照组和0.25 mg/L 1-MCP处理下，香菇的ADP含量呈先上升后下降的趋势，0.50 mg/L和0.75 mg/L质量浓度下，ADP的含量总体呈下降的趋势。如图4C所示，香菇的AMP含量均随贮藏时间的延长而呈现上升的趋势，对照组香菇由于贮藏0 d时ATP含量低于其他处理组，其AMP含量也处于较低水平，在贮藏后期迅速上升，而经1-MCP处理的香菇子实体内AMP含量增长速度基本不变。如图4D所示，对照组能荷总体处于较低水平，在第6天出现高峰后迅速降低，而1-MCP处理组香菇的能荷没有出现较大波动。由此可知，1-MCP处理能够使香菇维持较高的ATP含量并稳定其能量水平，从而保证香菇在采后生理活动的能量供应。
图4 不同质量浓度1-MCP处理对香菇ATP（A）、ADP（B）、AMP（C）含量和能荷（D）的影响Fig. 4 Effects of treatment with different 1-MCP concentrations on the contents of ATP (A), adenosine diphosphate (B) and adenosine monophosphate (C) and energy charge (D) of Lentinus edodes
2.5 1-MCP处理对香菇CCO、SDH活力的影响
CCO、SDH是线粒体的标志酶，其活力变化能够反映线粒体的功能特性。如图5A所示，香菇的CCO活力在贮藏期内先上升后下降，对照组的CCO活力下降迅速，而经过1-MCP处理的香菇CCO活力高峰均高于对照组，且出现时间较晚于对照组，1-MCP处理能推迟CCO活力高峰的出现。贮藏6 d后，对照组子实体的CCO活力下降，处理组CCO维持较高活力，显着高于对照组（＜0.05）。由图5B可知，对照组香菇SDH活力呈下降趋势，而1-MCP处理组呈先上升后下降趋势。0.25、0.50 mg/mL和0.75 mg/mL 1-MCP处理组SDH活力的峰值分别为168.25、147.49、123.37 U/g，分别高出对照组73.96%、52.49%、27.53%。处理质量浓度越高，香菇SDH活力越高。1-MCP处理能够保持香菇CCO活力和SDH活力，从而支撑其三羧酸循环和呼吸链，保障了线粒体功能，减缓了能量的下降。
图5 不同质量浓度1-MCP处理对香菇CCO（A）和SDH（B）活力的影响Fig. 5 Effect of treatment with different 1-MCP concentrations on CCO (A) and SDH (B) activity of Lentinus edodes
2.6 1-MCP处理对香菇ATP酶活力的影响
跨膜ATP酶分布于各种细胞器膜上，直接参与质子梯度能的产生和利用，参与能量的合成，也能使ATP水解，即水解ATP和泵出质子。由图6A可知，与对照组相比，1-MCP处理能明显提高氢-钾ATP酶活力（＜0.05），对照组和0.75 mg/L处理组的氢-钾ATP酶活力差异不明显。其他两个处理组在贮藏期间，香菇的氢-钾ATP酶保持着较高的活力。由图6B可知，香菇的钠-钾ATP酶活力随着贮藏期的增加呈先下降后上升趋势，采收6 d后，钠-钾ATP酶活力开始升高，且对照组香菇的钠-钾ATP酶活力显着低于其他处理组（＜0.05）。能量相关酶活力下降会降低线粒体产能效率，使细胞能量亏损，引起子实体褐变，由此推断，1-MCP处理能够使ATP酶处于较高活力，保持线粒体的产能效率，维持香菇子实体的能量水平。
图6 不同质量浓度1-MCP处理对香菇氢-钾ATP酶（A）和钠-钾ATP酶（B）活力的影响Fig. 6 Effect of treatment with different 1-MCP concentrations on H/K-ATPase (A) and Na/K-ATPase (B) activity of Lentinus edodes
3 讨 论
1-MCP处理能降低某些园艺作物表皮、果心、果肉和子实体的褐变，也可以影响青椒、柿子的色度变化。本研究也得到了类似的结果，1-MCP处理在一定程度上维持了香菇的色泽，降低了香菇的褐变度，起到了延缓香菇褐变的作用。大量研究证明了1-MCP处理能抑制果蔬的呼吸强度，通过抑制乙烯的合成从而阻碍乙烯作用于果蔬的进程，达到延缓果蔬的成熟衰老的作用，提高贮藏品质，并且1-MCP可以抑制PPO活力。肖子寒等研究发现，经1-MCP处理后的金红苹果果实果皮明亮鲜艳，1-MCP很好地保持了果实色泽，抑制了PPO活力，延缓了果实的成熟和果肉的褐变。本研究数据证明，1-MCP处理可以降低香菇呼吸强度和推迟呼吸高峰的出现时间，同时，1-MCP处理降低了PPO活力，阻碍黑色素物质的生成。1-MCP能抑制香菇褐变，可能与1-MCP抑制的乙烯作用和PPO活力有关，延缓了香菇的衰老和酶促褐变。
能量供应在控制果实成熟、衰老和收获后的生理失调起重要作用，而ATP酶、SDH和CCO是能量代谢和调节ATP合成的关键酶。能量相关酶活力下降会降低线粒体产能效率，使细胞能量亏损，引起果实褐变，可以通过提高SDH和CCO的活力而提高果蔬ATP含量和能荷水平。Vichaiya等发现ClO通过提高龙眼能量代谢相关酶活力（SDH、CCO和ATP酶），促进和维持能量产生，从而降低了龙眼果实在贮藏过程中的果皮褐变。本实验结果表明，适宜浓度的1-MCP处理提高了香菇在贮藏期间的SDH、CCO和ATP酶活力，这些酶的活力影响着线粒体供能，在香菇能量产生过程中起着积极的作用，有利于香菇能量的产生与传导。果蔬贮藏后期所需的ATP供应不足会引起膜系统的破坏，导致细胞代谢紊乱，引起衰老、褐变、冷害等现象的发生。高ATP含量和高能荷水平有助于维持膜的完整性，从而延缓膜通透性增加导致的褐变。Li Ling等研究表明，0.1 mol/L褪黑素处理延缓了双孢菇ATP含量和能荷的降低，减弱其电子泄漏，延缓衰老褐变。本研究结果表明，1-MCP处理减缓了香菇ATP、ADP、AMP含量的下降，总体上处理组香菇ATP、ADP、AMP含量在贮藏3～9 d内明显高于对照组，保证了香菇子实体的能荷水平，从而维持了香菇机体正常功能。1-MCP处理减弱了香菇的呼吸强度，但提高了ATP水平，这可能是1-MCP处理香菇在贮藏期间的呼吸强度较弱、ATP消耗较慢，造成ATP的积累所致。
综上所述，1-MCP处理能够抑制香菇采后呼吸强度、PPO活力，调节能量代谢相关酶活力，维持香菇的能量状态，从而延缓香菇褐变的发生。在本实验条件中，0.50 mg/L的1-MCP处理能较好地降低香菇呼吸强度，显着降低PPO活力，维持SDH、CCO和ATP酶活力，进而维持香菇的能量水平，最大程度上延缓香菇的褐变。
