双对苯醌的抗氧化活性分析及其固体发酵条件优化

胡彦丽，潘利利，闫淑珍，陈双林*

（南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210023）

天然的抗氧化活性物质主要包括黄酮类、多酚类、维生素类和多糖等，真菌产生的抗氧化活性物质则主要有醌类、酚类、多糖类、三萜类、对联三苯类等。苯醌是结构最简单的醌类化合物，广泛存在于生物体内，主要包括对苯醌和邻苯醌两大类，而天然存在的苯醌化合物多为对苯醌及其衍生物。苯醌由于其特殊的分子结构，可以参与生物系统中电子和质子的转移过程，具有作为抗氧化剂的潜力。覃陆慧等在探讨杨桃根苯醌（benzoquinone ofL.root，BACR）对治疗糖尿病小鼠的效果及相关机制时发现，给予BACR后，糖尿病小鼠肝脏的丙二醛含量明显下降，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量明显升高，表明BACR能有效减轻氧化应激带来的损伤。Okamoto等在研究一种苯醌类化合物6-(10-羟基癸基)-2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌时指出，它能抑制大鼠肝和大脑微粒体中由亚铁离子引发的脂质过氧化。此外，辅酶Q作为一种常见的苯醌类抗氧化剂，可通过直接清除自由基使膜磷脂和膜蛋白免受过氧化。Xu Qiao等最先从瓶生顶孢霉（）CA022菌株固体发酵中提取分离和鉴定出双对苯醌（2,7-dihydroxy-3,6,9-trimethyl-9-xanthene-1,4,5,8-tetraone，DTXT）（图1），这是一种新的苯醌化合物，因而，其生物活性尚未被研究和揭示，并且前期发酵研究获得的DTXT产量也比较低，都将限制其未来可能的应用。本研究借鉴已知苯醌类化合物具有抗氧化活性的线索，首先探索瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵所产生的DTXT的抗氧化活性。在证明DTXT具有良好抗氧化活性的基础上，通过单因素试验和响应面试验优化固体发酵条件提高其产量。

图1 DTXT结构式Fig.1 Structural formula of DTXT

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌株为瓶生顶孢霉CA022（CGMCC No10816），由本实验室分离于采自浙江安吉的竹黄（）子实体。

初始液体种子培养基：葡萄糖20 g、硝酸钠3 g、KHPO1 g、MgSOg7HO 0.5 g，加无菌蒸馏水定容至1 000 mL。

固体发酵培养基：100 g大米，装入17 cmh35 cmh5 cm的食用菌栽培袋中，加水淹没浸泡12 h后沥干水分，扎带封口。121 ℃灭菌20 min，24 h后进行第2次灭菌。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma公司；甲醇（色谱级） 美国天地有限公司；其他试剂均为国产分析纯；所用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

SpectraMax M2多孔酶标仪 美国分子仪器（上海）有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；1220高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Agilent公司；X-30R离心机 美国Beckman公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种培养和固体发酵

在无菌环境下，挑取瓶生顶孢霉CA022菌株的少许菌丝于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养皿中，置于28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d。培养结束后，向培养皿中加入约10 mL无菌水，进行孢子的冲洗并稀释至10，用涂布棒涂布于PDA平板上，将其置于28 ℃恒温培养箱中培养3 d。待PDA平板上长出单菌落后，挑取单个菌落转接至新的PDA平板，培养3 d后，挑取颜色较深的单个菌株作为固体发酵的出发菌株，并用无菌水制成1h10个/mL的孢子悬液。向每个液体种子培养基（50 mL）中接入1 mL孢子悬液，28 ℃、130 r/min培养5 d，然后将种子液接于装有100 g固体发酵培养基的食用菌袋，混匀铺平，置于28 ℃恒温培养箱中发酵。每天观察并混动发酵料，防止发酵料板结影响DTXT产量。

1.3.2 DTXT的提取和纯化

参照陈双林等的方法进行提取和纯化，将获得含目标产物的晶体通过HPLC检测，并将得到的检测图谱与实验室标准品图谱进行比较，以判断是否为DTXT及其纯度。将所得纯度为95%以上的DTXT样品用于体外抗氧化实验。

1.3.3 还原力（总抗氧化活性）的测定

参照王炬等的方法并作改进。抗氧化物质会使反应体系中的Fe还原成Fe，在700 nm波长处吸光度的变化反映出还原能力的高低，吸光度越高说明还原能力越强。称取适量的DTXT样品用无水乙醇制成20、40、60、80、100、150 μg/mL和200 μg/mL溶液。分别取1 mL上述待测溶液，依次加入1 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）和1 mL 1%铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃水浴反应20 min，迅速冷却后，再加入1 mL 10%三氯乙酸溶液混匀，3 000 r/min离心10 min后取上清液2.5 mL，加去离子水2.5 mL和0.1% FeCl溶液0.5 mL，摇匀后常温反应10 min，于700 nm波长处测定吸光度。以VC、VE、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxy toluene，BHT）和芦丁为阳性对照，无水乙醇为空白对照，每个处理重复3 次。

1.3.4 超氧阴离子自由基清除率的测定

参照Dong Weixue等的方法并作改进。分别取1 mL不同质量浓度的DTXT乙醇溶液（同1.3.3节），各加入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液4.5 mL和25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，25 ℃水浴反应5 min，迅速加入1 mL 8 mmol/L HCl溶液终止反应，在波长299 nm处测定样品溶液的吸光度。对照同1.3.3节，每个处理重复3 次。超氧阴离子自由基清除率计算如式（1）所示：

式中：为样品溶液＋Tris-HCl缓冲液＋邻苯三酚溶液＋HCl溶液；为样品溶液＋Tris-HCl缓冲液＋无水乙醇＋HCl溶液；为无水乙醇＋Tris-HCl缓冲液＋邻苯三酚溶液＋HCl溶液。

1.3.5 羟自由基清除率的测定

参照李晓英等的方法并作改进。分别取1 mL不同质量浓度的DTXT乙醇溶液（质量浓度同1.3.3节），依次加入1 mL 10 mmol/L FeSO溶液和1 mL 10 mmol/L水杨酸溶液，混匀后加入1 mL 8.8 mmol/L HO溶液，37 ℃水浴反应30 min后终止反应，于510 nm波长处测定吸光度。对照同1.3.3节，每个处理重复3 次。羟自由基清除率计算如式（2）所示：

式中：为样品溶液＋FeSO溶液＋水杨酸溶液＋HO溶液；为样品溶液＋FeSO溶液＋水杨酸溶液＋无水乙醇；为无水乙醇＋FeSO溶液＋水杨酸溶液＋HO溶液。

1.3.6 DPPH自由基清除率的测定

参照Song Zhu等的方法并作改进。分别取2 mL不同质量浓度DTXT乙醇溶液（同1.3.3节），各加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混匀后避光静置30 min，在517 nm波长处测定吸光度。对照同1.3.3节，每个处理重复3 次。DPPH自由基清除率计算如式（3）所示：

式中：为样品溶液＋DPPH溶液；为样品溶液＋无水乙醇；为无水乙醇＋DPPH溶液。

1.3.7 DTXT产量的测定和产率曲线的建立

标准曲线的绘制：用甲醇配制62.5、125、250、375 μg/mL和500 μg/mL的DTXT溶液。采用HPLC检测法（波长254 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL），以样品的峰面积（mAugs）和质量浓度（μg/mL）进行线性回归，得到DTXT的标准曲线回归方程：=14.855＋612.80（=0.998 3）。

产量测定：发酵完成后，取出发酵料置于55 ℃烘箱烘干，100 目粉碎过筛，每袋取5 g。用乙酸乙酯浸提直至无色，合并浸提液。旋转蒸发有机溶剂至旋干，加入5 mL色谱甲醇，经超声充分振荡后，用有机滤膜过滤，经HPLC分析检测DTXT的吸收峰面积，由标准曲线计算出DTXT产量。

产率曲线的建立：分别于固体发酵的7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17 d和18 d进行取样测定DTXT产量，确定最佳发酵时间。

1.3.8 单因素试验

基于1.3.1节固体发酵的方法与步骤，保持其他条件不变，将初始液态种子培养基中的葡萄糖分别替换为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉，质量浓度设置为10、15、20、25、30 g/L，摇床培养结束后将50 mL种子液加入100 g大米培养基中，使其碳源质量分数分别为0.5%、0.75%、1.0%、1.25%和1.5%（以大米质量计，下同）；供试氮源为硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、尿素和蛋白胨，质量分数分别为0.1%、0.125%、0.15%、0.175%和0.2%；供试微量元素为MgSOg7HO、ZnSOg7HO、FeSOg7HO、MnSOg7HO和HBO，质量分数分别为0.015%、0.020%、0.025%、0.030%和0.035%；供试维生素为VB、VB、VB、VB、VB和VB，含量分别为5、25、50、75 μg/100 g和100 μg/100 g。以上每个处理均重复3 次。其中维生素在配制成1 mg/mL的母液后，用无菌的0.22 μm滤膜过滤除菌，待培养基灭菌冷却后按需加入。

1.3.9 响应面试验

基于单因素试验结果，以筛选出的最佳碳源、氮源、微量元素和维生素为自变量，DTXT产量为响应值，采用Design-Expert 12.0的中心组合设计法，进行响应面分析试验，试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for response surface methodology

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 DTXT的提取和纯化

将获得含目标产物的晶体通过HPLC检测，得到检测图谱（图2）。在相同的检测条件下，待测样品中主要物质的出峰时间为6.538 min（图2A），与本实验室保存的纯化对照品出峰时间6.556 min（图2B）基本一致，并且待测样品的纯度达到98%，纯度较高，可以为后续实验使用。

图2 待测物（A）和对照品（B）的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of unknown (A) and control (B) samples

2.2 DTXT体外抗氧化活性

2.2.1 DTXT还原力

还原力反映了抗氧化物质的总抗氧化能力。DTXT还原力随着质量浓度的提高而增强（表2），当DTXT质量浓度为200 µg/mL时，吸光度为0.608f0.002。在150～200 µg/mL质量浓度范围内，DTXT吸光度较大，与芦丁相当，差异不显着。在20～200 µg/mL范围内，DTXT还原力均显着低于相同质量浓度下的VC，但显着高于相同质量浓度的VE和BHT。结果表明DTXT具有良好的总抗氧化能力。

表2 DTXT的还原力Table 2 Reducing power of DTXT

2.2.2 DTXT对超氧阴离子自由基的清除作用

不同质量浓度的DTXT均能清除超氧阴离子自由基，在20～200 µg/mL范围内，清除能力随着DTXT质量浓度的提高而增强（表3），IC为112.70 μg/mL。在200 µg/mL质量浓度下，DTXT对超氧阴离子自由基清除率达到（67.00f5.05）%。在150 µg/mL和200 µg/mL质量浓度下，DTXT对超氧阴离子自由基清除率显着高于BHT。在20～200 µg/mL范围内，DTXT清除超氧阴离子自由基的能力与VE大体相当，但低于相同质量浓度的VC和芦丁，且差异显着。

表3 DTXT对超氧阴离子自由基的清除率Table 3 Percentage scavenging of O2-· by DTXT %

2.2.3 DTXT对羟自由基的清除作用

DTXT对羟自由基具有良好的清除作用，清除能力随着DTXT质量浓度的提高而增强（表4），IC为78.63 μg/mL。在200 µg/mL时，DTXT对羟自由基清除率为（78.83f3.19）%。在20～200 µg/mL范围内，DTXT对羟自由基清除率均显着高于相同质量浓度的VE和BHT，但低于相同质量浓度的VC。在高质量浓度（150～200 µg/mL）时，与芦丁的清除作用差异不显着。

表4 DTXT对羟自由基的清除率Table 4 Percentage scavenging of ·OH by DTXT %

2.2.4 DTXT对DPPH自由基的清除作用

DTXT对DPPH自由基也具有良好的清除作用（表5），清除能力随着DTXT质量浓度的提高而增强，IC为88.36 μg/mL。在质量浓度为200 µg/mL时，对DPPH自由基清除率达到（76.53f3.08）%。在较高质量浓度（150 µg/mL和200 µg/mL）下，DTXT对DPPH自由基清除率显着高于相同质量浓度的BHT和VE，低于相同浓度的芦丁，但无显着差异。在20～200 µg/mL范围内，DTXT对DPPH自由基清除率均显着低于相同质量浓度的VC。

表5 DTXT对DPPH自由基的清除率Table 5 Percentage scavenging of DPPH free radical by DTXT%

2.3 DTXT的固体发酵

2.3.1 DTXT产量曲线

DTXT产量随着供试菌株瓶生顶孢霉CA022固体发酵培养时间的延长不断增加（图3），在固体发酵14 d达到最大（2 815.89 mg/kg），之后，产量逐步下降，因此将DTXT的固体发酵时间确定为14 d。

图3 DTXT产量与发酵培养时间的关系Fig.3 Relationship between fermentation time and DTXT production

2.3.2 碳源对固体发酵产DTXT产量的影响

向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加6 种供试碳源（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖和可溶性淀粉），图4结果表明，它们均可被CA022菌株利用，并且提高了DTXT产量。随着碳源质量分数的增加，DTXT产量在较低质量分数下都在逐渐增加，在较高质量分数下则逐渐下降。DTXT产量达到最高时的各碳源处理质量分数不同，葡萄糖质量分数为1.0%时，DTXT产量达到2 864.83 mg/kg；蔗糖质量分数为1.25%时，DTXT产量达到1 564.15 mg/kg；麦芽糖质量分数为1.25%时，DTXT产量达到 2 693.61 mg/kg；果糖质量分数为1.25%时，DTXT产量达到2 024.51 mg/kg；乳糖质量分数为1.25%时，DTXT产量达到2 210.11 mg/kg；可溶性淀粉质量分数为1.0%时，DTXT产量达到2 349.49 mg/kg。相比于另外5 种碳源，葡萄糖在较低质量分数时，DTXT产量就达到最高，且高于其他5 种碳源处理的最高产量。

图4 不同碳源对固体发酵DTXT产量的影响Fig.4 Effect of different carbon sources on DTXT production

2.3.3 氮源对固体发酵产DTXT产量的影响

向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加6 种供试氮源（硝酸钠、硝酸钾、氯化铵、硫酸铵、尿素和蛋白胨），图5结果表明，它们均可被CA022菌株利用，并且提高了DTXT产量。随着氮源质量分数的增加，DTXT产量在较低质量分数下都在逐渐增加，在较高质量分数下则逐渐下降。DTXT产量达到最高时的各氮源处理质量分数不同，硝酸钠质量分数为0.175%时，DTXT产量达到2 837.97 mg/kg；硝酸钾质量分数为0.175%时，DTXT产量达到2 444.31 mg/kg；氯化铵质量分数为0.175%时，DTXT产量达到992.47 mg/kg；硫酸铵质量分数为0.15%时，DTXT产量达到864.27 mg/kg；尿素质量分数为0.15%时，DTXT产量达到700.06 mg/kg；蛋白胨质量分数为0.175%时，DTXT产量达到643.24 mg/kg。相比于另外5 种氮源，添加0.175%硝酸钠时，DTXT产量最高，且显着高于其他5 种氮源处理的最高产量（＜0.05）。

图5 不同氮源对固体发酵DTXT产量的影响Fig.5 Effect of different nitrogen sources on DTXT production

2.3.4 微量元素对固体发酵产DTXT产量的影响

向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加5 种微量元素（MgSOg7HO、ZnSOg7HO、FeSOg7HO、MnSOg7HO和HBO），图6结果表明，它们均可被CA022菌株利用，并且提高了DTXT产量。随着微量元素质量分数的升高，DTXT产量在较低质量分数下都在逐渐增加，在较高质量分数下则逐渐下降。DTXT达到最高时的各微量元素处理质量分数不同，MgSO质量分数为0.03%时，DTXT产量达到2 558.55 mg/kg；ZnSO质量分数为0.03%时，DTXT产量达到1 452.88 mg/kg；FeSO质量分数为0.025%时，DTXT产量达到572.50 mg/kg；MnSO质量分数为0.025%时，DTXT产量达到727.36 mg/kg；HBO质量分数为0.03%时，DTXT产量达到2 831.37 mg/kg。相比于另外5 种微量元素，HBO效果最佳，质量分数为0.03%时，DTXT产量最高，且显着高于其他4 种供试微量元素处理的最高产量（＜0.05）。

图6 不同微量元素对固体发酵DTXT产量的影响Fig.6 Effect of different microelements on DTXT production

2.3.5 维生素对固体发酵产DTXT产量的影响

向瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵培养基中分别添加6 种B族维生素üü硫胺素（VB）、核黄素（VB）、烟酸（VB）、吡哆素（VB）、生物素（VB）和钴胺素（VB），结果表明（图7），与不添加任何维生素的处理相比，它们在一定程度上均可提高固体发酵DTXT产量，但差异不显着。其中VB的效果最好，含量为75 μg/100 g时，DTXT产量最高，达到4 254.90 mg/kg。

图7 维生素对DTXT产量的影响Fig.7 Effect of different vitamins on DTXT production

2.3.6 响应面试验结果

根据单因素试验结果，分别选择葡萄糖、硝酸钠、HBO和VB作为瓶生顶孢霉CA022菌株固态发酵产DTXT的组合处理，利用Design-Expert 12.0进行中心组合试验设计，共30 组，所得结果如表6所示。

表6 响应面试验方案及结果Table 6 Experimental design and results for response surface analysis

根据所获DTXT产量数据（）进行多元回归拟合，得到下面的二阶多项式回归方程：

由回归模型方差分析（表7）可以看出，响应模型的＜0.000 1，=75.65，失拟项=0.228 6＞0.05不显着，表明该模型拟合度较高。此外，模型的相关系数为0.986 0，说明该模型可以解释98.60%的响应值变化，只有很小的变量（1.40%）没有得到合理的解释，表明预测结果与实际结果的一致性较好。以上结果表明该模型的拟合度良好，可用于瓶生顶孢霉CA022菌株固态发酵产DTXT产量的预测。回归模型的方差分析可以判断自变量对因变量的影响程度。由表7可见，一次项、、对响应值的影响较大，达到极显着水平（＜0.01），而影响则不显着（＞0.05）。二次项、、达到极显着水平（＜0.01），影响则不显着（＞0.05）。模型中的交互项、、达到显着水平（＜0.05），而、、影响则不显着（＞0.05）。比较4 个因素的值大小可知，影响DTXT产量的因素依次为：葡萄糖＞硝酸钠＞HBO＞VB。

表7 回归模型的方差分析Table 7 Analysis of variance of quadratic polynomial model

根据三维响应面可以看出各变量之间的交互作用对响应值的影响。等高线是响应面在水平方向的投影，等高线呈椭圆形表示两因素交互作用显着，呈圆形表示两因素交互作用不显着。由图8可以看出，各因素交互作用大小依次为：葡萄糖与HBO＞硝酸钠与VB＞葡萄糖与硝酸钠＞硝酸钠与HBO＞葡萄糖与VB＞HBO与VB，与表7回归分析结果相符。

图8 各因素交互作用对DTXT产量的影响Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on DTXT production

通过Design-Expert 12.0软件，预测得到瓶生顶孢霉CA022菌株发酵产DTXT的最优组合为葡萄糖0.773%、硝酸钠0.185%、HBO0.032%、VB100 μg/100 g，预测得到的DTXT最大产量为4 016.24 mg/kg。在模型预测最优组合条件下进行发酵，实际得到的DTXT产量为4 150.80 mg/kg。实验值与理论值在合理的误差范围内，证明该优化方案可行，可用于DTXT的生产。

3 讨 论

为了评价药物或天然化合物能否在体内作为抗氧化剂，通常先在体外进行研究。本研究采用体外抗氧化法考察DTXT的抗氧化活性，结果表明DTXT具有良好的还原能力和清除自由基的能力，其中对于羟自由基和DPPH自由基清除率分别达到78.83%和76.53%。文献中也有关于苯醌化合物体外抗氧化活性的报道，如Joshi在研究天然苯醌Embin的抗氧化活性时发现其对于DPPH自由基清除率达到50%以上，对羟自由基清除率达到79%；Deniz等在研究1,4-苯醌取代物时发现2,5-二氨基-1,4-苯醌对羟自由基清除率达到76.70%；Liu Kun等对提取自蘑菇的3 种苯醌化合物的抗氧化活性进行了比较，发现3 种化合物均对DPPH自由基的清除效果不佳（＜50%），但其中化合物2-苯基-3-甲氧基-[1-2-苯并吡喃][4,3-]对苯醌对羟自由基清除率达到80%以上。这与本实验结果有所不同，可能是因为苯醌自身结构的差异，如取代基的不同，导致其对不同自由基的清除率不同。本研究有助于了解苯醌类化合物的抗氧化活性，但关于DTXT的抗氧化活性机理还有待进一步研究。

本研究通过单因素试验，得到瓶生顶孢霉CA022菌株固体发酵产DTXT的最佳碳源、氮源、微量元素和维生素分别是葡萄糖、硝酸钠、HBO和VB。文献中也有关于天然苯醌生产条件的报道，如幸峰等研究热带假丝酵母（）产苯醌的最佳碳源和氮源分别是葡萄糖和蛋白胨，苟学磊等指出角毛壳菌（）发酵产苯醌类色素的最佳碳源、氮源和微量元素分别是蔗糖、蛋白粉和NaCl，这与本实验结果有所不同，这说明不同真菌产苯醌所需要的营养条件不同。某些微量元素或生长因子也能影响苯醌的产生，如Zheng Ziyi等发现CaCl和VB能促进对麦胚发酵产甲氧基对苯醌和2,6-二甲氧基对苯醌。影响真菌次级代谢的因素有很多，这些因素之间不是孤立的，而是相互联系的，只有选择较佳的营养物质及其配比，微生物才能生长良好。

4 结 论

通过体外抗氧化实验考察了DTXT的抗氧化活性，通过优化瓶生顶孢霉CA022菌株的培养基配方，提高了DTXT产量。体外抗氧化实验结果表明，DTXT还原能力以及对DPPH自由基和羟自由基的清除能力与芦丁大体相当，具有作为抗氧化剂的潜力。响应面试验结果表明，优化后的DTXT产量（4 150.80 mg/kg）是优化前（2 864.83 mg/kg）的1.45 倍，为DTXT固体发酵的研发提供了理论依据。