孙蔚 阚延婷 黄燕 冯婷婷 甘建和*
・论着・
HEV相关肝衰竭患者CD4+/CD8+比值变化与预后的关系
孙蔚阚延婷黄燕冯婷婷甘建和*
目的 探讨戊型肝炎病毒（HEV）相关肝功能衰竭患者中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+比值的变化及与预后的关系 方法 应用流式细胞计数分别对戊型肝炎病毒相关肝功能衰竭（HEV-LF）患者15例，普通急性戊型肝炎（AHE）患者21例和健康对照者20例外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞水平进行检测，同时检测TBiL、PTA等指标。15例HEV-LF患者根据预后不同分为好转组与死亡组，预后相关危险因素用Logistic回归分析结果。结果 HEV-LF组与AHE组CD4+T细胞频数分别为（30.72±11.14）%，（32.61±8.96）%，比健康对照组（37.95±2.03）%明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。HEV-LF组与AHE组CD8+T细胞频数分别为（31.15±8.69）%，（24.23±7.50）%，比健康对照组（19.14±5.33）%明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组间比较也有统计学意义（P＜0.05）。HEV-LF组与AHE组CD4+/CD8+比值分别为（1.06±0.47）、（1.54±0.90），比健康对照组（2.13±0.88）明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），两组间比较也有统计学意义（P＜0.05）。CD4+/CD8+比值水平降低是 HEV-LF组患者预后的危险因素。结论 HEV-LF、AHE患者存在不同程度的细胞免疫功能紊乱，其中CD4+/CD8+比值水平降低是HEV-LF组患者预后的危险因素。
戊型肝炎 CD4+T淋巴细胞 CD8+T淋巴细胞 流式细胞术
肝功能衰竭是肝细胞受到广泛、严重损害，导致肝脏的合成、解毒、排泄等功能严重紊乱而出现的临床症候群。肝衰竭的病因及诱因复杂，在我国肝炎病毒感染是其发生的最主要原因。虽然戊型肝炎病毒（HEV）感染引起的病毒性肝炎，一般呈急性病程，预后较好，但近年来有关HEV感染相关肝衰竭的报道逐渐增多［1，2］。目前国内外对戊型肝炎病毒相关肝功能衰竭（HEV-LF）免疫状态的研究较少。作者回顾性分析15例HEV-LF患者的临床资料，探讨CD4+/CD8+比值与其预后的关系。
1 临床资料
1.1一般资料 选择2010年1月至2015年6月本院HEV-LF患者15例（HEV-LF组）、急性戊型肝炎（AHE）患者21例（AHE组）。AHE患者诊断符合《病毒性肝炎防治方案》［3］。HEV-LF患者在AHE基础上出现肝衰竭，诊断符合《肝衰竭诊治指南（2012年版）［4］。在入组前＜6个月均未接受免疫调节治疗，同时排除肿瘤及妊娠。对照组为本院健康职工献血标本20例。本项目经本院伦理委员会讨论通过，并签署知情同意书。
1.2主要仪器及试剂 CD4+T细胞和CD8+T细胞检测采用Beckman.Coulter公司生产的XLAT09010流式细胞仪，试剂采用Beckman.Coulter四联标记抗体CD45-FITC/CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-ECD以及 IntraPrep Permeabilization Reagent，包括鞘液、清洗液。
1.3流式细胞术检测 5☒l四联标记抗体CD45-FITC/ CD3-PC5/CD4-RD1/CD8-ECD加入50☒l全血中，振荡混匀避光标记15min。加入自制红细胞裂解液A液600☒l，振荡混匀至澄清后加入B液265☒l，振荡混匀后1500r/min离心5min弃上清液，加入2ml PBS振荡混匀后1500r/min离心5min弃上清液（重复2遍），用500☒l PBS重悬混匀后上机；计数3000～5000个细胞。
1.4统计学方法 采用SPSS20.0软件。计量资料以（x±s）表示，两组均数间比较用t检验，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1各组基本临床资料比较 3组间性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），HEV-LF组与AHE组T-BIL、ALT、AST、PA、PTA比较差异均有统计学意义（P＜0.05）见表1。HEV-LF组6例未愈，均为男性，出现肺部感染并发症4例，出现肝性脑病并发症1例，同时出现肺部感染、尿路感染、肝性脑病并发症1例；6例未愈患者中合并HBV感染1例、HCV感染1例，乙型肝炎后肝硬化脾脏切除术后1例，有酒精性肝硬化病史1例。AHE组住院治疗后均好转，无并发症。其中血吸虫肝病史1例，HBV合并感染1例。
表1 各组基本临床资料比较（x±s）
2.2CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+比值在3组中的比较 见表2。
表2 各组CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+比值（x±s）
2.3CD4+/CD8+比值与HEV-LF预后的Logistic回归分析结果 采用Logistic回归以是否死亡为应变量，而性别、年龄、住院天数、TBil、PTA、CD4+/CD8+比值为自变量建立回归模型，结果显示血清CD4+/CD8+比值水平降低可作为重症肝炎危险因素，OR值为1.753（P＜0.05）。
3 讨论
我国是病毒性肝炎的高发区，戊型肝炎的人群流行率约20%，多表现为急性感染，一般不转为慢性，但在一部分患者如老年男性、免疫力低下、孕妇中易发展为肝功能衰竭［5］。HE的发病机制目前尚不清楚，推测可能与甲型肝炎类似，即HEV可能不直接引起肝细胞损伤，而免疫病理损伤特别是细胞免疫可能是引起肝细胞损伤的主要原因［6］。机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞的主要功能是调节蛋白质抗原引起的免疫应答，并产生清除细胞表面抗原或细胞内微生物的效应。细胞免疫功能主要由不同类型T淋巴细胞亚群决定，其中最重要的是辅助细胞（CD4+）和杀伤抑制细胞（CD8+），两者比例失调影响机体免疫系统［7］。本资料显示，无论是HEV-LF组还是AHE组和健康对照组比较均表现为CD4+T细胞频率降低，CD8+T细胞频率升高，CD4+/CD8+比值下降。提示细胞免疫在HEV感染的发病过程中起着重要的作用。计云霞［8］等研究发现HE肝脏病变有肝细胞气球样变、性变、嗜酸性小体、灶性坏死及炎性细胞浸润，主要是淋巴细胞和单核巨噬细胞。经免疫组化检查，坏死灶周围浸润的大多为CD8+T细胞，因此认为HE可能并非直接使肝细胞致病，肝细胞损害是由于细胞免疫反应介导。活化的CD4+T细胞可产生多种细胞因子，可辅助B细胞形成抗体，也能辅助CD8+T细胞产生细胞毒作用，可诱导和增强细胞和体液免疫应答，功能上主要属辅助性T细胞。国内外研究证实CD8+T是清除乙型肝炎病毒（HBV）的主要效应细胞，可产生穿孔素、粒酶等细胞毒物质，参与抗病毒、抗肿瘤免疫和移植排斥反应，其杀伤靶细胞主要有两种途径：即细胞裂解性杀伤和诱导细胞凋亡，功能上可归为抑制性T细胞［9～11］。两种T淋巴细胞借其相互拮抗作用调节免疫应答过程，以保持免疫功能的平衡。
进一步比较HEV-LF组与AHE组CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+比值，结果显示HEV-LF组CD8+T细胞频数高于AHE组。模式生物学研究认为适度水平的CTL应答是控制、清除病毒感染及引起肝细胞损伤的中心环节［12］，过度升高的CD8+T细胞在清除病毒的同时引起的大量肝细胞坏死。本资料结果显示CD4+/CD8+比值HEV-LF组低于AHE组。提示HEV感染机体导致肝功能衰竭的患者存在严重的免疫功能紊乱。CD4+/CD8+比值与HEV-LF预后的Logistic回归分析结果显示血清CD4+/CD8+比值水平降低可作为重症肝炎预后不良的危险因素。当CD4+T细胞或CD8+T细胞的数量或功能出现异常时，T 淋巴细胞调节就失去平衡而导致机体发病。CD4+/CD8+的水平高低可反映机体免疫系统内环境稳定情况［13］，表明免疫应答对机体具有双重的作用，一方面可以帮助清除病原微生物起到保护性作用，但是过度激活则可导致机体发生炎症病理损伤。
综上所述，HEV感染外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD4+/CD8+比值的变化提示细胞免疫功能紊乱可能是HEV感染发病及重症化的重要机制。但机体的免疫系统是复杂并动态变化的网络系统，需进一步完善细胞因子及共刺激分子的同步检测，才能更全面的评估HEV感染机体的免疫发病机制及与预后的关系。
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Objective To investigate the changes of CD4+T cell，CD8+ T cell and ratio of CD4+/CD8+in patients with hepatitis E virus （HEV）related liver failure and their relationship with prognosis. Methods Using flow cytometry respectively ， peripheral blood CD4+T cell，CD8+T cell were detectedin 15 cases of hepatitis E virus related liver failure patients （HEV-LF），21 cases of common acute hepatitis E patients （AHE） and 20 cases of healthy controls， as well as TBIL、PTA and others. 15 patients with HEV-LF were divided into improvement group and death group according to different prognosis，and prognostic risk factors using logistic regression analysis. Results HEV-LF and AHE group of CD4+T cell frequency were（30.72±11.14）%，（32.61±8.96）%，which were significantly decreased compared with the healthy control group （37.95±2.03）%（P＜0.05），while there was no significant difference between the two groups of patients（P＞0.05）. CD8+T cell frequency in HEV-LF group and AHE group were（31.15±8.69）% and（24.23±7.50）%，respectively， which both increased significantly compared with healthy control group（ 19.14% ±5.33%），（P＜0.05）； while there was statistical significance between two groups of patients （P＜0.05）. The ratio of CD4+/CD8+were（1.06±0.47），（1.54±0.90） in HEV-LF group and AHE group， respectively， while in the healthy control group， it was 2.13±0.88， showing significant decrease（P＜0.05），also statistical significance were between the two groups of patients（P＜0.05）. Conclusion Reduction of CD4+/CD8+ratio is a risk factor for the prognosis of patients with HEV-LF. HEV-LF and AHE have different levels of cellular immune function disorder，and the reduction of ratio of CD4+/CD8+is a risk factor for the prognosis of patients with HEV-LF.
HEV CD4+T cell CD8+ T cell Flow cytometry
国家科技部十二五重大专项（2012X10002004-008）；2013年省级自然科学基金（BK20130271）
215006 苏州大学附属第一医院感染科
