王梦娇,蒋 倩,马学军,夏瑞阳,郭雪萍,孙 磊,钟 旗,马雪连,2*,姚 刚*
(1.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830052;2.新疆农业大学畜牧学博士后流动站,乌鲁木齐 830052;3.新疆昌吉市二六工镇农业(畜牧业)发展服务中心,昌吉 831100;4.新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐 830099)
养牛业是新疆畜牧业重要的支柱产业之一,近年来发展迅速,引进品种、数量日益增加,2021年全疆的牛存栏量达528.13万头,牛肉产量达43.9万吨。犊牛腹泻是养牛业中的常见疾病,严重影响犊牛生长发育,腹泻严重时可使动物发生血便并导致死亡[1],对养牛业造成了严重的经济损失。BCoV和牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)是引起犊牛腹泻的主要病原[2-3]。而其中由BCoV导致的腹泻呈全世界流行趋势,BCoV主要通过粪口传播和呼吸道传播[4],检测时可从粪便和鼻液中分离到病毒粒子[5],病情转归与犊牛的日龄、免疫状态及病毒毒力有关[6]。BCoV感染新生犊牛可引起犊牛腹泻,也可以导致成年牛冬痢,或引起呼吸道疾病[7-9]。自然状态下可感染羊驼[10]、骆驼[11]、驯鹿[12]和羊[13]等反刍动物,该病发病率较高,感染率与牛的年龄相关[14]。
BCoV属于冠状病毒科冠状病毒属,是一种单股正链有囊膜的RNA病毒。其基因组长度约32 kb。结构上,BCoV粒子呈球状,外围呈日冕状,大小为 62～210 nm,是目前已知最大的RNA病毒[15]。包括10个开放阅读框(open reading frames,ORFs),两端是5′和3′非翻译区域。ORF1编码多聚蛋白(polyprotein,PPla),通过核糖体转移为PPlab,然后被蛋白酶水解成多个非结构蛋白(nonstructural protein,NSP)。ORF3、ORF4、ORF8、ORF9和ORF10分别编码该病毒粒子的5种主要结构蛋白:N(核蛋白)、S(纤突蛋白)、M(膜蛋白)、E(小膜蛋白)、HE(血凝素酯蛋白),其余的ORFs编码额外的NSPs[16]。不同国家和地区的BCoV毒株存在区域差异。例如,中国的BCoV毒株与新西兰、阿根廷、荷兰、爱尔兰、丹麦、美国、德国和日本的毒株不同[17]。这些毒株的致病力、传播力以及对疫苗和治疗的敏感性均有所不同,可能是由于宿主种群的差异、环境条件以及其他病毒或细菌混合感染导致的。
随着新疆规模化养牛业的迅速发展,特别是国内外引进品种以及数量的增加,BCoV感染病例的报道越来越多,但对新疆规模化养牛场的BCoV感染现状、流行特点和主要流行毒株的生物学特性尚缺乏较全面的调查研究。本研究对新疆南、北疆养牛业主产区BCoV感染的流行情况进行调查监测,探明其流行规律,分析其演化过程中的分子流行病学特性,为后续针对新疆BCoV毒株的精准防控提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
MolPure®Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒和MolPure®Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒购自翌圣生物科技(上海)有限公司;TRIzol购自Invitrogen;Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)、2×Taq PCR Mix、DL2000 DNA Marker和琼脂糖购自天根生化科技(北京)有限公司;pEASY-T1载体购自Promega公司。
1.2 流行病学调查
本研究于2020年7月至2022年7月份对新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市、塔城地区、伊犁州、喀什地区、博乐市、呼图壁县的12个规模化养牛场犊牛的BCoV感染情况进行持续监测。根据BCoV感染后犊牛的典型症状,采集1～3月龄具有腹泻临床症状的犊牛粪便样品共652份,其中肉用犊牛424份,奶用犊牛228份。对样品进行BCoV检测,分析不同地区、不同季节和不同品种犊牛BCoV的流行规律。
1.3 病料采集与处理
使用棉签采集犊牛直肠粪便样品,放到冻存管里存入液氮,粪便样品以1∶3的稀释比用PBS溶液稀释,涡旋充分混匀后保存于-80 ℃冰箱。使用时,解冻后再放入-20 ℃冰箱反复冻融3次,以破坏组织释放病毒粒子。取处理后的粪便样品,4 ℃ 8 000×g离心后取上清,用TRIzol进行RNA提取,利用Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录,获得的cDNA -20 ℃冻存。
1.4 RT-PCR鉴定
根据GenBank中公开发表的BCoV病毒基因序列,利用Premier 5.0软件设计特异性引物,由生物工程(上海)股份有限公司合成。以实验室前期构建的质粒作为阳性对照,以样品cDNA作为模板,全程置于冰盒上进行操作,将提取出的样品 RNA 模板加入无酶无菌离心管,配置体系为15 μL,同时每管加入3 μL 5×gDNA Digester Mix,RNase-free H2O补至15 μL并轻轻吹打混匀,混合液42 ℃条件下孵育2 min。逆转录反应20 μL体系配制,反应条件为 25 ℃ 5 min,58 ℃ 50 min,85 ℃ 5 min使用特异性引物进行PCR扩增,PCR扩增体系(15 μL):2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL,dd H2O 4.5 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,cDNA 2.0 μL。反应条件为:预变性95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 60 s,72 ℃ 45 s,35个循环;延伸10 min。扩增结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳,于凝胶成像系统观察结果。PCR反应涉及的相关引物见表1。
表1 引物合成Table 1 Primer synthesis
1.5 BCoV结构蛋白引物设计及扩增
以MW711 287.1为参考序列,设计BCoV 结构蛋白N、S、M、E、HE的扩增引物(表2),引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。通过RT-PCR方法对病料提取的cDNA进行扩增,PCR扩增体系(15 μL):2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL,dd H2O 4.5 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,cDNA 2.0 μL。反应条件为:预变性95 ℃ 4 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 60 s,72 ℃ 45 s,35个循环;延伸5 min。扩增后,胶回收目的片段并构建于pEASY-T1载体,送生物工程(上海)股份有限公司测序,获得目的基因序列。
表2 引物序列及反应条件Table 2 Primer sequences and reaction conditions
2 结 果
2.1 BCoV阳性检测结果
RT-PCR检测结果显示(图1),在774 bp处可以看到明显特异的片段(第1、2、3、5和9泳道),电泳结果经测序与预期片段序列符合。对2020—2022年新疆养牛主产区的652份粪便样品采用RT-PCR方法检出阳性156份,BCoV阳性总检出率为23.93%。
M. D2000 DNA Marker;P. 阳性对照;N. 阴性对照;1～10. 样品M. D2000 DNA Marker; P. Positive control; N. Negative control; 1-10. Sample图1 BCoV N基因RT-PCR 扩增结果Fig.1 BCoV N gene RT-PCR amplificationthe results
2.2 BCoV流行情况
2.2.1 BCoV感染地区差异 对六个地区12个规模化养牛场犊牛BCoV感染调查结果如图2所示,喀什地区阳性率和阳性数量均最高,阳性率约35%。而乌鲁木齐、伊犁和博乐地区均未检出阳性。BCoV在南、北疆流行情况见表3,可见BCoV在全疆均有分布,南、北疆地区的感染率呈现较大差异,南疆地区发病率较高。
图2 BCoV感染的地区差异Fig.2 Regional differences of BCoV infection
表3 南、北疆腹泻犊牛BCoV检测结果Table 3 BCoV incidence of diarrhea calves between southern and northern Xinjiang
2.2.2 BCoV感染的四季差异 BCoV在各个季节的流行情况详见表4,可知在新疆地区,BCoV的流行受季节因素影响较大,集中于冬季流行,冬季检出率高达50.85%,远高于总检出率23.93%,这也符合此前其它地区研究对BCoV感染特征的认识[18-20]。
表4 不同季节腹泻犊牛BCoV检测结果Table 4 BCoV incidence of diarrhea calves in 4 seasons of Xinjiang
2.2.3 BCoV感染的品种间差异 BCoV在奶、肉用犊牛中的流行情况详见表5,可见BCoV在奶、肉用犊牛均可传播,但两者的感染率呈现较大差异,与奶用犊牛相比,肉用犊牛的发病率较高。
表5 新疆奶、肉用犊牛BCoV的检测结果Table 5 BCoV incidence of diarrhea calves in dairy and beef calves of Xinjiang
2.3 BCoV基因序列分析
将本文分离到的BCoV病毒,暂定名为:BCoV/China/XJ-CJ/2022,采用RT-PCR方法进行扩增,获得BCoV的N、S、M、E、HE基因序列并送往生物公司测序,将测序获得的BCoV主要结构蛋白S、HE、E、M和N的序列进行同源性、进化树和基因重组分析、N蛋白抗原表位预测。
2.3.1 BCoV同源性分析 为了比对鉴定的BCoV/China/XJ-CJ/2022与现存其它毒株的异同,本研究于GenBank上挑选14条国内外各地区BCoV参考毒株进行比对,根据BCoV的五个结构蛋白S、HE、E、M和N进一步做同源性分析,结果可见(表6):BCoV/China/XJ-CJ/2022与国内参考株MW711 287.1_SWUN/NMG-D10/2020的核苷酸相似性最高,为97.4%,主要在M蛋白区域的核苷酸和氨基酸相似性最高,分别为99.4%和100.0%。与加拿大参考株AF220 295.1_Quebec的核苷酸相似性最低,为95.8%,主要是E蛋白区域的核苷酸相似度最低,为92.9%。
表6 分离株与代表性毒株片段核苷酸和氨基酸的相似性分析Table 6 Homology analysis of gene fragments of isolated and representative strains
2.3.2 BCoV的S、N、M、E和HE基因的进化树和基因重组分析 S、N、M、E和HE基因的进化分析结果表明(图3),除与MW711 287.1_SWUN/NMG-D10/2020的S基因比对部分基因缺失外,同源性平均数值高于95%。本研究的分离株S基因与2018年毒株MN982 199.1进化关系最近,N基因与2018年毒株MK095 169.1BCOV-China/SWUN/LN4/2018进化关系最近,M基因与2017年毒株MK095 148.1 China/SWUN/SC1/2017进化关系最近,HE基因与2017年毒株MK095 136.1 BCOV-China/SWUN/SC2/2017进化关系最近。使用RDP 4和Simplot软件分析Bo/XJ-KS/02/CHN可能存在的重组事件,结果显示未出现基因重组现象。
3 讨 论
犊牛腹泻包括非感染性腹泻和感染性腹泻,其中非感染性腹泻是受到饲养管理不当、环境气候恶劣、应激反应等非感染因素的影响,从而导致犊牛自身免疫力降低,增加了犊牛腹泻的概率,但发病率和危害性低于感染性腹泻,制定并实施合理的生物安全措施可以有效防控非感染性腹泻[3]。感染性腹泻根据病因可分为病毒性腹泻、细菌性腹泻、寄生虫性腹泻,BCoV常与其它病毒混合感染,并引发细菌感染,导致临床诊断的症状表现复杂,临床上难以净化[20-21],其中引起腹泻的病毒包括BCoV、BNoV、牛病毒性腹泻病毒 (bovine viral diarrhea virus, BVDV)、牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)、牛纽布病毒(bovine nebovirus,BNeV),其中BCoV的感染率最高[2],可感染新生犊牛引起犊牛腹泻,也可以导致成年牛冬痢,或引起呼吸道疾病,严重时可导致犊牛死亡。在国外,一项2019—2021年的流行病学调查结果表明,波兰奶牛群的BCoV感染率约为30%[22],2022年巴西的流行病学调查结果显示,患病牛群中BCoV的感染率高达56%[23],土耳其BCoV感染率为29.92%[24]。在国内,BCoV流行病学调查结果显示其实际感染率较高,其中四川、西藏、青海、云南省份BCoV检出率均高于60%。在中国东北地区的一项流行病学调查显示腹泻牛中BCoV阳性率为15.45%[25]。可见BCoV在世界范围内广泛的流行。本研究于2020—2022年期间在新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市、塔城地区、伊犁州、喀什地区、博乐市、呼图壁县的12个规模化养牛场共采集样品652份,检出BCoV阳性156份,检出率为23.93%,其中喀什地区阳性率达到35%。
造成BCoV感染的原因除了与饲养管理不当、环境气候恶劣有关外,也与养殖场犊牛自身免疫力不足等因素有关。本团队前期研究结果显示,南疆牧场在防疫制度、人员物流管控、饲养管理等生物安全控制方面存在隐患,养殖场人员防控意识有限,缺乏有效针对BCoV的疫苗接种,这些因素成为BCoV在新疆南疆地区广泛、反复传播的有利因素[3]。本研究发现,新疆BCoV毒株的传播具有冠状病毒传播的典型特征,即冬春传播,气温对病毒传播影响较大,冬季为该疾病的高发季节,发病率可达到50.85%,冬季应着重防范BCoV。从地区分布上,南疆气温相对于北疆较高,降水量少,日照时间充足,气候较为干旱,换季时期昼夜温差可达到20 ℃,BCoV发病率高达36.09%,应加强区域管理,减少跨区域引种。另外,本研究还发现,新疆BCoV毒株更易感染肉用犊牛,发病率达到30.9%,奶用犊牛发病率仅为10.96%,也有相关的研究报道显示,肉牛初乳乳糖含量及pH较高,可能会增加新生犊牛腹泻率[26-27]。奶、肉用犊牛患病率的差异可能与初乳摄入量有关。初乳中含有免球蛋白、生长因子、细胞因子、非特异性抗菌因子和营养物质等,不当的初乳管理可能会影响初乳中的免疫成分及营养物质等,进而影响新生犊牛的免疫状态和生长发育情况[28]。据报道,肉牛的平均初乳产量为2.7 L(0.6～5.6 L),奶牛的平均初乳产量为6.7 L(3.7～9.5 L),受产量影响,肉用犊牛对初乳奶量相对摄入较少,免疫球蛋白的摄入也相应减少,免疫球蛋白不足会造成犊牛被动免疫转移失败,导致犊牛发病率和死亡率增加以及后期生产力的下降[29-30],所以更应加强肉用犊牛的初乳补饲。
本研究从遗传演化分析的结果分析,进化树的主要分支是以地区、国家为分界各自形成谱系,说明目前BCoV没有通过物流或动物迁徙等因素形成全球传播,病毒的进化和传播主要集中在各自地理分界内,这与各国贸易对生物安全的严格管控有关,且与BCoV的自然宿主多为缺乏全球迁徙能力的偶蹄目动物有关[31]。BCoV的传播存在地域性和季节性的特征,因此对BCoV的防控也应具有地域性和季节性[32-33]。
4 结 论
犊牛腹泻BCoV流行病学调查结果表明,新疆养牛业主产区广泛存在BCoV感染。南疆地区BCoV感染率较高,肉用犊牛BCoV感染率高于奶用犊牛。同时与季节呈现较强相关性,以冬季感染为主。遗传演化分析结果表明,BCoV感染以本土毒株为主,中国毒株形成独立谱系,传染存在地域性特征,未见重组事件。本研究为BCoV的精准防控和后续的疫苗研制奠定了理论基础。
