李国术，何平平，王 波，周寿红，欧阳新平△

（1.衡阳市中心医院急诊科，湖南衡阳 421001；2.南华大学心血管疾病研究所／生理学教研室，湖南衡阳 421001；3.南华大学附属第一医院麻醉科，湖南衡阳 421001）

泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化（artherosclerosis，AS）重要的病理学基础，单核巨噬细胞吞噬修饰的低密度脂蛋白，特别是氧化修饰低密度脂蛋白（oxidized low－density lipoprotein，ox－LDL）而形成泡沫细胞［1］。肝外组织细胞中的胆固醇通过血液运输到肝脏，合成胆汁排出体外，称为逆向胆固醇转运（reverse cholesterol transport，RCT）。RCT能力的减弱是泡沫细胞形成的重要原因。三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP－binding cassette transporter A1，ABCA1）被称作RCT的“看门人”，发挥抗 AS作用［2］。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）被称为第3种气体信号分子，广泛分布于各系统中［3－4］。H2S能延缓AS的进程，缩小AS斑块，具有抗AS作用［5］。本研究旨在观察H2S对泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响，探讨H2S抗AS的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组 RAW264.7细胞购自中科院上海细胞库。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中。细胞融合60%～70%时，ox－LDL（50μg／mL）孵育48h，转变成泡沫细胞。实验分为泡沫细胞组、硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）（10－5、10－4和10－3mol／L）处理0、12、24和48h组。

1.2 方法

1.2.1 试剂及仪器 NaHS购自Sigma公司。［3H］标记的胆固醇（原子能院同位素所）。ABCA1兔抗鼠一抗以及辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司。MMLV第一链cDNA合成试剂盒、总RNA提取试剂盒和Hot Star Taq Master Mix试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2.2 胆固醇流出检测 对数生长的细胞，浓度为3.0×106个／mL，接种6孔板，含10%胎牛血清、0.2μCi／L［3H］标记的胆固醇和ox－LDL（50μg／mL）的培养液共敷育48h。H2S组用 NaHS（10－5、10－4和10－3mol／L）继续敷育12、24和48h。更换培养液，细胞在无血清含50μg／mL载脂蛋白AI的新鲜培养液中敷育12h，液闪仪检测培养液和细胞中的［3H］胆固醇浓度。胆固醇流出率用培养液中［3H］／总值［3H］（培养液＋细胞）×100%表示。

表1 H2S对泡沫细胞内FC及CE浓度的影响（n＝5）

表2 H2S对泡沫细胞内胆固醇流出的影响（，n＝5）

表2 H2S对泡沫细胞内胆固醇流出的影响（，n＝5）

a：P＜0.05，与泡沫细胞组比较；b：P＜0.05，与 NaHS（10－5 mol／L）组比较。c：P＜0.05，与 NaHS（10－4 mol／L）组比较；d：P＜0.05，与 NaHS处理0h比较。e：P＜0.05，与NaHS处理12h比较；f：P＜0.05，与 NaHS处理24h比较。

胆固醇流出率（%）组别0h 12h 24h 48h泡沫细胞组 13.46±1.76 14.39±2.06 15.15±1.94 17.82±2.25 NaHS（10－5 mol／L）组 13.79±1.54 14.26±1.84 17.69±2.17 20.43±3.14 NaHS（10－4 mol／L）组 14.21±1.13 15.51±1.64 28.91±3.65abde 36.80±1.13abdef NaHS（10－3 mol／L）组 14.68±1.79 16.37±2.12 42.77±4.21abcde 54.17±5.71abcdef

1.2.3 高效液相色谱检测 超声破碎细胞，BCA法蛋白定量。细胞裂解产物分成两份，一份测定游离胆固醇（free cholesterol，FC），加入等体积8.9mmol／L的KOH醇。另一份测定总胆固醇（total cholesterol，TC），加入等体积的15%KOH醇。两份样本加入6%三氯乙酸及等体积正己烷和异丙醇的混合溶液，1500r／min离心5min，收集上层有机相。加入100μL异丙醇、正庚烷和乙晴的混合溶液溶解样品。1500r／min离心5min，收集上清液进行高效液相色谱分析。采用C18柱，以异丙醇∶正庚烷∶乙晴为流动相进行非梯度洗脱，流速为1mL／min，216nm波长下检测，以峰面积定量胆固醇。胆固醇酯（cholesterol ester，CE）经胆固醇酯酶水解为胆固醇，测定TC量，TC量减去FC量为CE量，以mg／mg细胞蛋白为胆固醇和CE单位。

1.2.4 实时定量PCR检测 收集细胞，Trizol提取细胞的总RNA。提取的总RNA为模板进行逆转录反应，合成cDNA第一链。取cDNA样品梯度稀释，进行实时定量PCR反应，反应总体系为30μL，包含cDNA 4μL，上下游引物各1μL，dNTP Mix（2×）8μL。ABCA1引物：上游：5′－AGG AAA CCC AAT CCC AGA TAC CC－3′，下游：5′－GCT CGG AGG AAG TGC TTG AGA AT－3′。β－actin引物：上游：5′－CCA TCA TCT TGC AGG AGC G－3′，下游：5′－CTG GCA GTG AGC TAT ACT CG－3′。采用2－△△CT法处理数据。

1.2.5 Western blotting检测 提取细胞总蛋白，BAC法蛋白定量。100μL样本加入到2×SDS凝胶加样缓冲液中煮沸。凝胶电泳1h分离蛋白质，分离的蛋白转膜至聚偏氟乙稀膜上。10%脱脂牛奶封闭2h，加入兔抗鼠ABCA1和β－actin一抗，4℃下过夜。加入羊抗兔二抗，孵育6h。显影后进行半定量分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，计量资料用表示，单因素方差分析后，组间差异比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 H2S对泡沫细胞内FC及CE浓度的影响 与泡沫细胞组相比，NaHS（10－4、10－3mol／L）处理24h或 NaHS（10－4mol／L）处理48h均显着降低了泡沫细胞中TC、FC和CE及CE／TC水平（P＜0.05）。NaHS（10－5mol／L）处理24h和NaHS（10－4mol／L）处理12h细胞中TC、FC和CE及CE／TC水平与泡沫细胞组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

图1 H2S对泡沫细胞ABCA1蛋白表达的影响

表3 H2S对泡沫细胞ABCA1表达的影响（，n＝5）

表3 H2S对泡沫细胞ABCA1表达的影响（，n＝5）

a：P＜0.05，与泡沫细胞组比较；b：P＜0.05，与 NaHS（10－5 mol／L）24h组比较。c：P＜0.05，与NaHS（10－5 mol／L）24h组比较；d：P＜0.05，与 NaHS（10－4 mol／L）12h组比较；e：P＜0.05，与 NaHS（10－4 mol／L）24h组比较。

组别 ABCA1mRNA相对表达水平（%）ABCA1蛋白100.00±0.00 0.15±0.02 NaHS（10－5 mol／L）24h组 103.27±3.65 0.17±0.03 NaHS（－4 mol／L）24h组 125.76±5.14abd 0.48±0.05abd NaHS（－3 mol／L）24h组 148.63±8.36abc 0.98±0.12abc NaHS（－4 mol／L）12h组 105.38±2.47 0.16±0.02 NaHS（－4 mol／L）48h组 156.79±5.96ade 0.96±0.13相对表达水平泡沫细胞组ade

2.2 H2S对泡沫细胞内胆固醇流出的影响 与泡沫细胞组相比，NaHS（10－4、10－3mol／L）处理24和48h时间和浓度依赖的方式增加泡沫细胞胆固醇流出（P＜0.05）。NaHS（10－5mol／L）处理12、24和48h及 NaHS（10－5、10－4、10－3mol／L）处理12h没有影响泡沫细胞胆固醇流出（P＞0.05），见表2。

2.3 H2S对泡沫细胞ABCA1mRNA和蛋白表达的影响 与泡沫细胞组相比，NaHS（10－4和10－3mol／L）处理 24h或NaHS（10－4mol／L）处理48h均显着上调细胞中 ABCA1mRNA和蛋白表达（P＜0.05），呈时间和浓度依赖性。NaHS（10－5mol／L）处理24h及 NaHS（10－4mol／L）处理12h细胞中ABCA1的表达与泡沫细胞组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1和表3。

3 讨 论

AS发病机制十分复杂，至今尚未阐明。H2S具有改善血管内皮功能、调节平滑肌细胞凋亡和增殖、抑制血管重构、舒张血管和抗氧化等心血管保护作用［6］。研究表明H2S具有抗AS的作用，但机制没有完全阐明［7］。研究发现H2S可以延缓对ApoE基因敲除小鼠AS的进程，减小AS斑块［8］。本研究结果表明H2S降低了泡沫细胞内胆固醇和胆固醇酯的浓度，增加胆固醇的流出率。

在致病因素的作用下，单核巨噬细胞在血管内膜下吞噬过多的胆固醇和磷脂，特别是ox－LDL，以脂滴的形式聚集在细胞内形成泡沫细胞［9－10］。巨噬细胞摄取过多脂质并沉积于血管内膜下，本身是一种自我保护机制，关键是这些细胞摄取脂质后能否将其代谢并转运出去。细胞脂质摄取与流出的失衡是泡沫细胞形成的关键。ABCA1在巨噬细胞胆固醇流出和RCT的过程中发挥十分重要的作用［11］。研究发现H2S能下调巨噬细胞CD36mRNA和蛋白表达，减少ox－LDL摄取，抑制泡沫细胞形成［12］。那么H2S能否影响细胞RCT，而发挥抗AS的作用？本研究结果表明H2S以剂量和浓度依赖方式上调了巨噬细胞性泡沫细胞中ABCA1mRNA和蛋白的表达，并增加泡沫细胞中胆固醇流出。因此H2S抗AS的作用可能与通过上调泡沫细胞中ABCA1表达并促进胆固醇流出有关。

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