彭 博，郑佳雯，邱 榕，曹 辉
（1.江苏大学附属医院，江苏 镇江 212000；2.镇江第二人民医院，江苏 镇江 212000；3.长沙市第一医院，湖南 长沙 410005）
创伤愈合是一种复杂的生物学过程，涉及多种细胞类型、信号分子和基质成分的相互作用[1]。创伤愈合的过程可分为炎症期、增殖期和重塑期3个阶段，其中炎症期是创伤愈合的启动阶段，对后续的愈合过程有重要影响[2]。炎症期主要由炎性因子、血小板和中性粒细胞介导，其作用是清除创伤部位的坏死组织和异物，同时为增殖期提供必要的信号和基质[3]。然而，过度或持续的炎症反应会导致创伤部位的组织损伤和纤维化，延缓或阻碍创伤愈合[4]。其中白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和前列腺素E2（PGE2）作为促炎性炎症因子，IL-10作为抗炎性炎症因子，NO则是参与创伤愈合的小分子信号物质，检测这些因子在血液中的浓度水平可以评估创伤区域的组织损伤、水肿情况及愈合情况。肛肠手术是一种常见的外科手术，主要用于治疗肛门直肠疾病，如痔疮、肛裂、肛周脓肿等[5]。其术后创伤愈合受到多种因素的影响，如手术方式、创伤程度、感染、营养、血液供应等。肛肠手术后创伤愈合不良会导致术后并发症的发生，如出血、感染、瘘管、狭窄等，影响患者的生活质量和预后[6]。因此，寻找有效的促进肛肠手术后创伤愈合的药物或方法是一项重要的临床课题。
柴胡皂苷A（saikosaponin A, SSA）是一种从中药柴胡中提取的三萜皂苷类化合物，具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等[7]。近年来，有研究[8]发现SSA能够促进皮肤创伤愈合，其机制可能与抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路激活和减少MMP-9表达有关。然而，SSA对肛肠手术后创伤愈合的影响及其作用机制尚未明确。本实验旨在探讨SSA对SD大鼠肛旁创面模型创伤愈合及IL-6、IL-10、TNF-α和血清PGE2、NO的浓度水平的影响及其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 取80只无特定病原体（SPF）级别的健康雄性Sprague Dawley大鼠，8周龄，体质量（200±20）g，由南京医科大学实验动物基地提供，动物生产许可证号：SCXK（苏）2013-0005。大鼠在实验前适应环境1周，饲养条件为温度（22±2）℃，相对湿度为（55±5）%，12 h/12 h昼夜交替周期，自由进食饲料和水。本实验遵循《中国实验动物管理条例》[9]及《中国实验动物使用规范》[10]的要求，实验方案经江苏大学附属医院动物伦理委员会审批（批准号：202301025）。
1.2 药物与试剂 柴胡皂苷A（批号:CAS#20736-09-8）由中国药科大学提供，纯度＞98%，分子式为C42H68O13，分子量为780.98。将柴胡皂苷A溶解于生理盐水中，制成50 mg/mL的储备液，于用前稀释为所需浓度。重组人表皮生长因子（rhEGF）（深圳市华生元公司，国药准字S20010037，规格：200 IU/喷）。HE染色试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，批号：CAS#G1120）。
1.3 主要仪器 ELX800型酶标仪（美国赛默飞公司）；EG1150型组织石蜡包埋机（美国赛默飞公司）；LV100N正置显微镜（日本尼康公司）；Gene Genome型多功能成像仪（美国BIORAD公司）；FA2004N电子天平（上海精其公司）。
1.4 造模与分组 随机选取20只大鼠作为正常组，其余大鼠造模。将创面模型成功的大鼠随机分为对照组、阳性组和实验组，每组20只。造模方案：将大鼠麻醉后，剃除肛门周围毛发，用75%酒精消毒。在肛门前方1 cm处，沿着肛门直肠轴线切开皮肤，深达肌层，制作长约1.5 cm、宽约0.5 cm的创面。用生理盐水冲洗创面，用干净的纱布覆盖。该模型能够模拟肛肠手术后的创伤情况，具有操作简单、创伤稳定、易于观察等优点[11]。该模型也能够反映出肛门直肠部位的解剖特点和生理功能，如粪便、细菌等外界因素的刺激和污染，以及血液供应和免疫调节等内在因素的影响。
1.5 实验给药 对照组灌胃给予等量的生理盐水，实验组灌胃给予柴胡皂苷A（50 mg/kg）。给药时间为术后第1天开始，1次/d，连续14 d。阳性组则给予rhEGF，1喷/d，给药时间为术后第1天开始，1次/d，连续14 d。正常组不进行任何处理，作为对照。该分组和给药方式能够排除其他干扰因素的影响，保证实验结果的可靠性。该分组和给药方式也能够反映出柴胡皂苷A对创伤愈合的时间效应和剂量效应，为探讨其作用机制提供依据。
1.6 观察指标
1.6.1 血清IL-6、IL-10、TNF-α、PGE2和NO水平 分别于术后第3、7、14天，取各组大鼠空腹尾静脉血2 mL，离心后取血清，用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清中IL-6、IL-10、TNF-α、PGE2和NO水平。IL-6、IL-10、TNF-α是炎症因子，反映创伤部位的炎症反应程度；PGE2、NO是血管活性物质，反映创伤部位的血管通透性和血流量。
1.6.2 创面愈合率 分别于术后第3、7、14天，观察各组大鼠创面的创面愈合率，用卷尺测量创面的长度和宽度，计算创面愈合率（%）=（原始创面面积-当前创面面积）/原始创面面积×100%。创面愈合率反映创伤部位的修复和重建情况。
1.6.3 HE染色观察创面 分别于术后第3、7、14天，取对照组、阳性组、实验组大鼠创面组织，并用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切成5 μm厚的连续横断切片。HE染色后，用光镜观察创面上皮爬行、肉芽组织增生、胶原纤维、成纤维细胞、炎症细胞浸润、组织水肿等愈合及炎症情况，并拍照记录。上皮爬行反映创伤部位的表皮重建情况；肉芽组织增生反映创伤部位的血管生成情况；胶原纤维反映创伤部位的基质重塑情况；成纤维细胞反映创伤部位的胶原纤维合成情况；炎症细胞浸润反映创伤部位的免疫调节情况；组织水肿反映创伤部位的水电解平衡情况。
1.6.4 电镜观察创面新生肉芽组织 分别于术后第3、7、14天，取各组大鼠新生肉芽组织，并用2.5%戊二醛固定，常规超微切片制备法制成超薄切片。用透射电镜观察各组大鼠新生肉芽组织中血管内皮细胞紧密连接及胶原纤维合成、分布情况，并拍照记录。血管内皮细胞紧密连接反映创伤部位的血管完整性和稳定性；胶原纤维合成、分布反映创伤部位的基质强度和弹性。
1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据处理和分析。计量资料以“均数±标准差”表示，比较各组间差异采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α、PGE2和NO水平比较对照组、阳性组和实验组大鼠血清IL-6、TNF-α、PGE2、NO的浓度术后第3、7、14天逐渐降低，IL-10水平则逐渐上升（P＜0.05）。与正常组比较，对照组大鼠血清IL-6、TNF-α、PGE2、NO水平在术后第3、7、14天均明显升高（P＜0.05），IL-10水平在术后第3、7、14天明显降低（P＜0.05）。与对照组比较，阳性组和实验组大鼠血清中IL-6、TNF-α、PGE2、NO水平在术后第3、7、14天均明显降低（P＜0.05），IL-10水平在术后第3、7、14天均明显升高（P＜0.05）。而阳性组和实验组大鼠血清IL-6、TNF-α、PGE2、NO水平在术后第3、7、14天比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表1～5）
表1 各组大鼠血清IL-6 水平比较 （，pg/mL）
表1 各组大鼠血清IL-6 水平比较 （，pg/mL）
注：与正常组比较，aP＜0.05；与同一时间点对照组比较，bP＜0.05；与术后3 d比较，cP＜0.05；与术后7 d比较，dP＜0.05。
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表2 各组大鼠血清IL-10 水平比较 （，pg/mL）
表2 各组大鼠血清IL-10 水平比较 （，pg/mL）
注：与正常组比较，aP＜0.05；与同一时间点对照组比较，bP＜0.05；与术后3 d比较，cP＜0.05；与术后7 d比较，dP＜0.05。
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表3 各组大鼠血清TNF-α 水平比较 （，pg/mL）
表3 各组大鼠血清TNF-α 水平比较 （，pg/mL）
注：与正常组比较，aP＜0.05；与同一时间点对照组比较，bP＜0.05；与术后3 d比较，cP＜0.05；与术后7 d比较，dP＜0.05。
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表4 各组大鼠血清PGE2 水平比较 （，ng/mL）
表4 各组大鼠血清PGE2 水平比较 （，ng/mL）
注：与正常组比较，aP＜0.05；与同一时间点对照组比较bP＜0.05；与术后3 d比较，cP＜0.05；与术后7 d比较，dP＜0.05。
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表5 各组大鼠血清NO 水平比较 （，μmol/L）
表5 各组大鼠血清NO 水平比较 （，μmol/L）
注：与正常组比较，aP＜0.05；与同一时间点对照组比较，bP＜0.05；与术后3 d比较，cP＜0.05；与术后7 d比较，dP＜0.05。
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2.2 各组大鼠创面愈合率比较 对照组、阳性组和实验组大鼠创面愈合率术后第3、7、14天逐渐上升（P＜0.05）；与对照组比较，阳性组和实验组大鼠创面愈合率高（P＜0.05）。而阳性组和实验组大鼠创面愈合率在术后第3、7、14天比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表6）
表6 各组大鼠创面愈合率比较 （，%）
表6 各组大鼠创面愈合率比较 （，%）
注：与同一时间点对照组比较，aP＜0.05；与术后3 d比较，bP＜0.05；与术后7 d比较，cP＜0.05。
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2.3 各组大鼠创面光镜下观察比较 与正常组比较，对照组大鼠创面上皮爬行慢，肉芽组织增生差，胶原纤维稀少，成纤维细胞少，炎症细胞浸润多，组织水肿重；与对照组比较，实验组大鼠创面上皮爬行快，肉芽组织增生良好，胶原纤维丰富，成纤维细胞增多，炎症细胞浸润少，组织水肿轻。（见图1）
图1 各组大鼠创面光镜下观察 （HE，×200）
2.4 各组大鼠新生肉芽组织电镜下观察比较 与正常组，比较对照组大鼠新生肉芽组织中血管内皮细胞紧密连接不完整，胶原纤维合成少，分布不均匀；与对照组相比，实验组大鼠新生肉芽组织中血管内皮细胞紧密连接完整，胶原纤维合成多，分布均匀。（见图2）
图2 各组大鼠新生肉芽组织电镜下观察 （×3 000）
3 讨论
创伤愈合是一种复杂的生物学过程，涉及炎症反应、血管生成、细胞增殖、迁移和分化、基质重塑等多个环节[12]。创伤愈合的质量和速度不仅影响患者的生活质量和康复效果，还关系到感染、出血、瘢痕等并发症的发生。因此，寻找能够有效促进创伤愈合的药物和方法，是创伤治疗领域的重要课题。肛肠手术是一种常见的外科手术，主要用于治疗肛门直肠疾病，如痔疮、肛裂、肛周脓肿等。肛肠手术后创伤愈合的速度和质量，直接影响患者的术后恢复和预后。然而，由于肛门直肠部位的解剖特点和生理功能，肛肠手术后创伤面易受到粪便、细菌等外界因素的刺激和污染，导致创面愈合缓慢、感染率高、并发症多。因此，如何加快肛肠手术后创伤愈合，减少并发症，提高患者的生活质量，是临床上亟待解决的问题。
SSA是一种从中药柴胡中分离出的三萜皂苷类化合物，具有多种生物活性，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等。近年来，有研究表明柴胡皂苷A对创伤愈合也有一定的促进效果。高亮等[13]报告了对脑外伤大鼠海马神经元自噬及AMPKmTORC1通路的影响；马大亮等[14]报告了SSA减轻脑缺血再灌注大鼠海马神经元损伤。然而，目前尚无关于SSA对肛肠手术后创伤愈合的影响及其作用机制的研究报告。
本研究旨在探讨柴胡皂苷A对SD大鼠肛旁创面模型肛肠手术后创伤愈合的影响及其可能的作用机制，为SSA在促进创伤愈合方面的临床应用提供实验依据。本实验结果表明，SSA能够促进SD大鼠肛旁创面模型肛肠手术后创伤愈合，其作用机制可能与抑制炎症反应、增强免疫调节、促进血管生成和胶原纤维合成有关。
抑制炎症反应是创伤愈合的第1个阶段，是一种保护性的生理反应，旨在清除创伤部位的异物、坏死组织和病原体，为后续的愈合过程提供条件[15]。然而，过度或持续的炎症反应会延缓创伤愈合，导致组织损伤和功能障碍。炎症因子是炎症反应的重要调节分子，参与创伤部位的血管通透性、白细胞浸润、免疫细胞活化等多个环节。IL-6、TNF-α和PGE2是促炎性炎症因子，能够加剧创伤部位的组织损伤和水肿；IL-10是抗炎性炎症因子，能够抑制促炎性炎症因子的释放，减轻创伤部位的组织损伤和水肿。NO是一种具有多种生物学功能的小分子信号物质，参与创伤愈合的多个环节，如血管舒缩、血小板聚集、白细胞黏附、免疫调节等。NO在适量时对创伤愈合有益，但过量时则有害，会导致创面感染、出血、坏死等并发症。本实验结果表明，柴胡皂苷A能够降低SD大鼠肛旁创面模型肛肠手术后血清中IL-6、TNF-α、PGE2和NO水平，升高IL-10水平，说明SSA能够抑制过度或持续的炎症反应，减轻创伤部位的组织损伤和水肿。
免疫调节是创伤愈合的第2个阶段，是一种平衡性的生理反应，旨在调控创伤部位的免疫细胞活性和功能，为后续的愈合过程提供条件[16]。免疫调节主要涉及两类免疫细胞：M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞主要参与创伤部位的清理和杀菌作用，释放大量的促炎性因子；M2型巨噬细胞主要参与创伤部位的修复和重建作用，释放大量的抗炎性因子。M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞之间存在动态平衡，在不同阶段发挥不同作用[17]。在创伤早期，M1型巨噬细胞占优势，有利于清除异物和坏死组织；在创伤后期，M2型巨噬细胞占优势，有利于促进新生组织形成。本实验结果表明，柴胡皂苷A能够升高SD大鼠肛旁创面模型肛肠手术后血清中IL-10水平，说明SSA能够增强M2型巨噬细胞的活性和功能，促进创伤部位的修复和重建。
血管生成是创伤愈合的第3个阶段，是一种重要的生理过程，旨在为创伤部位提供充分的氧气和营养，为后续的愈合过程提供条件[18]。血管生成主要涉及血管内皮细胞的增殖、迁移、分化、管腔形成等多个环节。血管内皮细胞之间通过紧密连接形成血管壁，维持血管的完整性和稳定性。本实验结果表明，SSA能够促进SD大鼠肛旁创面模型肛肠手术后新生肉芽组织中血管内皮细胞紧密连接的完整性，说明柴胡皂苷A能够促进创伤部位的血管生成，增加创伤部位的血液供应。
胶原纤维合成是创伤愈合的第4个阶段，是一种基本的结构蛋白，构成了创伤部位的基质，为后续的愈合过程提供条件[19]。胶原纤维主要由成纤维细胞合成和分泌，参与创伤部位的强度和弹性的恢复。本实验结果表明，SSA能够促进SD大鼠肛旁创面模型肛肠手术后新生肉芽组织中胶原纤维的合成和分布，说明柴胡皂苷A能够促进创伤部位的基质重塑，提高创伤部位的强度和弹性。
综上所述，本研究结果表明，SSA能够促进SD大鼠肛旁创面模型肛肠手术后创伤愈合，这为SSA在促进创伤愈合方面的临床应用提供了实验依据。当然，本实验还存在一些局限性，如：动物模型与人类情况不完全相同，SSA的剂量和给药方式与临床应用不完全一致。因此，还需要进一步开展更多的研究，以验证SSA对肛肠手术后创伤愈合的影响及其作用机制。
