冯帅华，文 哲，姚红艳，姚顺骞，张 淼，吴官保

（1.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湘潭市中医院，湖南 湘潭 411100）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）又称退行性膝骨关节炎，是一种最常见的退行性关节病，我国目前KOA的患病率约为18%，并且有逐年增加趋势，女性多于男性[1]。目前KOA的发病机制尚不完全明确，但具有相似的病理学改变，主要为进行性关节软骨的变性、破坏甚至缺损，软骨下骨囊性变，骨赘形成等特点[2]。目前治疗方案大体分为非手术治疗和手术治疗，中医在非手术治疗方面有较多的优势，其中中医外用膏剂外敷治疗有简单、方便并效果显着的特点，已被广泛应用于临床。超微肿痛贴是湖南中医药研究院附属医院自制中药外用膏剂，多种研究证实了其疗效。对此，本研究借助病理学及分子生物学等技术手段，研究超微肿痛贴对膝骨关节炎模型兔的干预作用，旨在探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择3月龄普通级新西兰实验兔50只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄各半，由湖南省中医药研究院动物实验室提供，许可证号：SYXK（相）2015-0008。经检疫后在湖南省中医药研究院动物实验中心饲养，单笼喂养，适应性喂养1周后开始实验。实验方案得到湖南省中医药研究院实验伦理委员会批准。

1.2 药物与试剂 超微肿痛贴（含药量：每100 cm2不少于7.5 g，规格：9 cm×7 cm）为湖南省中医药研究院附属医院院内制剂，由湖南省中医药研究院附属医院药剂制备室生产，该方主要中药材成分是：延胡索、大黄、菟丝子、熟地黄、川芎、当归、没药、乳香、红花、蒲黄、姜黄、莪术、白芷、栀子、香附、冰片。氟比洛芬巴布膏（泽普思，日本三笠制药株式会社，国药准字J20100007，批号：402194，规格：13.6 cm×10 cm）。木瓜蛋白酶（美国Genview公司，批号GX-6024）；苏木素、伊红（Wellbio公司，批号：UDT180015-1）；兔IL-1βELISA试剂盒（批号：20172011）、IL-6 ELISA试剂盒（批号：20171009）（南京森贝伽生物科技有限公司）；MMP-3、CollagenⅡ抗体（美国proteintech公司，批号：SA00001-2）；RIPA裂解液（中国长沙维世尔生物，批号：RA19060）；BCA蛋白定量试剂盒（Wellbio公司，批号：UDT180009-6）。

1.3 主要仪器BA210T显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；YD-315型切片机（浙江金华益迪医疗设备有限公司）；BMJ-A型包埋机（常州中威电子仪器）；TS-92型摇床（中国江苏其林贝尔仪器制造有限公司）；164-5050型电泳仪及电泳槽（美国Bio-rad公司）；TGL-18R型台式冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；DYCZ-40A型转膜仪（中国北京六一生物科技有限公司）；QL-901型漩涡混合器（中国江苏其林贝尔仪器制造有限公司）；a85-1型磁力搅拌器（中国荣华）。

1.4 造模与分组 将50只新西兰兔采用随机数字表法分为空白组（12只）和造模组（38只），造模组新西兰兔采用膝关节注射木瓜蛋白酶的方式复制兔膝骨关节炎模型。方法：刮除后肢右侧膝关节周围兔毛，微屈膝，由髌韧带内侧缘凹陷处进针，将5%木瓜蛋白酶注射到膝关节腔，0.1 mL/kg。于第1天、第3天、第5天各注射一次，并常规饲养4周后，可得到兔膝关节炎模型[3]。4周后，从38只造模组新西兰兔中随机抽取2只，采用空气栓塞法处死，解剖右膝发现软骨面暗淡、粗糙，取软骨标本HE染色后光镜下观察发现，软骨破坏、潮线欠流畅，提示造模成功。（见图1）

图1 造模组兔膝关节软骨病理形态（HE，×40）

造模成功后将已造模的36只新西兰兔随机分为模型组、氟比洛芬巴布膏组、超微肿痛贴组，雌雄各半，每组12只。

1.5 实验给药 参照Meeh-Rubner法公式计算兔体表面积，然后用许文生氏公式计算我国国人体表面积，取人体表面积与兔体表面积比值（100∶7）得出兔膝骨关节超微肿痛贴用量大小为：2.39 cm×1.86 cm。造模4周后，开始予药物干预。超微肿痛贴组兔予超微肿痛贴贴于右侧膝关节（为防止撕咬及脱落，予医用胶布及绷带固定，固定后观察兔的活动，以不影响正常活动为标准，防止影响局部血液循环，并每1 h巡查1次），1次/d，6 h/次，连续给药4周。氟比洛芬巴布膏组兔予氟比洛芬巴布膏贴于右侧膝关节，用量大小为3.60 cm×2.65 cm，以同样的固定方法固定药物，1次/d，6 h/次，连续给药4周。空白组与模型组不进行任何干预，常规喂养4周。

1.6 取材及处理 治疗4周后行空气栓塞法处死4组兔，取材方法如下：（1）处死后首先在右侧膝关节暴露髌上囊，在髌上囊处切开一小口，用注射器灌注灭菌生理盐水1 mL，灌注后充分活动膝关节，挤压并回抽收集关节液，上述操作反复3次，直至收集3 mL关节液。经离心后取上清液置于-20℃保存。（2）再打开关节囊，暴露膝关节腔，切断交叉韧带，清理半月板。然后离断关节，取右侧股骨内侧髁进行清洗，经固定、冲洗、脱钙、浸蜡、包埋、切片、HE染色等处理后，光镜下观察软骨形态结构。（3）用刀片切取股骨外侧髁关节面全层软骨，并保存在液氮中，以进行Western blotting检测。

1.7 观察指标

1.7.1 光镜下观察软骨形态学改变并进行Mankin’s评分 将软骨切片进行HE染色后，在光镜下进行形态学观察，进行Mankin’s评分。评分标准见表1。

表1 Mankin’s评分标准

1.7.2 ELISA法检测关节液中IL-1β、IL-6水平 将备好的关节液常温化冻，用ELISA试剂盒严格按照产品说明书检测关节液中IL-1β、IL-6的含量。

1.7.3 Western blotting法检测软骨中MMP-3、Ⅱ型胶原蛋白表达 取备用的兔膝关节软骨，软骨组织研磨后，并提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，随后进行电泳分离，随后转移到NC膜上；用5%脱脂奶粉封闭1.5 h，将按照一定比例（MMP-3为1:750，Ⅱ型胶原为1:500，β-actin为1:5 000）稀释的一抗溶液与膜一起孵育，保存在4℃冰箱中过夜；TBST洗3次后进行二抗孵育90 min；随后用ECL化学发光液显色并曝光，最后将曝光后底片进行扫描，用quantity one专业灰度分析软件进行分析。

1.8 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件对数据进行分析，计量资料采用（±s）表示，若满足正态性和方差齐性，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，若方差不齐者用Tamhane’s T2法，若不满足正态性采用非参数检验，以P〈0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组兔膝关节软骨形态学改变情况 空白组兔膝关节软骨表面平坦，软骨层无裂纹，细胞数量及分布正常，大小正常，潮线无破坏；模型组兔膝关节软骨层较空白组薄，软骨出现较深裂隙，软骨表面不平坦，软骨细胞数量减少，或增多呈簇状分布，潮线不平滑、中断。氟比洛芬巴布膏组兔膝关节软骨细胞增多，偶有呈簇状分布，软骨表面较模型组平坦，存在较多小裂隙，潮线欠流畅，偶有中断。超微肿痛贴组兔膝关节软骨细胞常规分布，软骨表面相对平坦，存在小裂隙，潮线欠流。（见图2）

图2 各组兔膝关节软骨病理形态图（HE，×100）

Mankin’s评分结果：模型组、氟比洛芬巴布膏组及超微肿痛贴组兔膝关节软骨Mankin’s评分明显高于空白组（P〈0.05）；氟比洛芬巴布膏组及超微肿痛贴组兔膝关节软骨Mankin’s评分明显低于模型组（P〈0.05）；超微肿痛贴组兔膝关节软骨Mankin’s评分低于氟比洛芬巴布膏组，但差异无统计学意义（P〉0.05）。（见表2）

表2 各组兔膝关节软骨Mankin’s评分比较（±s，分）

表2 各组兔膝关节软骨Mankin’s评分比较（±s，分）

注：与空白组比较，aP〈0.05；与模型组比较，bP〈0.05

组别 动物数（只） 评分结果空白组 12 0.75±0.45模型组 12 7.03±1.21a氟比洛芬巴布膏组 12 5.19±0.84a b超微肿痛贴组 12 5.08±0.91a b F 113.538 P 0.000

2.2 各组兔膝关节液中IL-1β、IL-6含量比较 模型组、氟比洛芬巴布膏组及超微肿痛贴组兔膝关节液中IL-1β、IL-6的含量明显高于空白组（P〈0.05）；氟比洛芬巴布膏组及超微肿痛贴组兔膝关节液中IL-1β、IL-6的含量明显低于模型组（P〈0.05）；超微肿痛贴组兔膝关节液中IL-1β、IL-6的含量低于氟比洛芬巴布膏组，但差异无统计学意义（P〉0.05）。（见表3）

表3 各组兔膝关节液中IL-1β、IL-6含量比较（±s，pg/mL）

表3 各组兔膝关节液中IL-1β、IL-6含量比较（±s，pg/mL）

注：与空白组比较，aP〈0.05；与模型组比较，bP〈0.05

组别 动物数（只）IL-1β IL-6空白组 12 15.71±3.34 11.76±2.67模型组 12 78.61±11.29a 66.51±10.66a氟比洛芬巴布膏组 12 62.13±11.60a b 53.33±8.14a b超微肿痛贴组 12 60.93±10.81a b c 51.69±9.17a b F 89.649 99.091 P 0.000 0.000

2.3 各组兔膝关节软骨中MMP-3、Ⅱ型胶原蛋白表达情况 与空白组比较，模型组、氟比洛芬巴布膏组及超微肿痛贴组兔膝关节软骨中MMP-3蛋白表达明显上调（P〈0.05），Ⅱ型胶原蛋白表达明显下调（P〈0.05）；与模型组比较，氟比洛芬巴布膏组及超微肿痛贴组兔膝关节软骨中MMP-3蛋白表达明显下调（P〈0.05），Ⅱ型胶原蛋白表达明显上调（P〈0.05）；与氟比洛芬巴布膏组比较，超微肿痛贴组兔膝关节软骨中MMP-3蛋白表达略下调，Ⅱ型胶原蛋白表达略上调，但差异均无统计学意义（P〉0.05）。（见图3、表4）。

图3 各组兔膝关节软骨中MMP-3、Ⅱ型胶原蛋白表达Western blotting图

表4 各组兔膝关节软骨中MMP-3、Ⅱ型胶原蛋白表达比较（±s）

表4 各组兔膝关节软骨中MMP-3、Ⅱ型胶原蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，aP〈0.05；与模型组比较，bP〈0.05

组别 动物数（只）MMP-3 Ⅱ型胶原空白组 12 0.17±0.04 0.91±0.13模型组 12 0.58±0.10a 0.25±0.06a氟比洛芬巴布膏组 12 0.47±0.08a b 0.44±0.08a b超微肿痛贴组 12 0.44±0.09a b c 0.46±0.09a b F 55.724 107.382 P 0.000 0.000

3 讨 论

现代医学认为炎性因子、细胞合成及代谢因子、激素等与KOA发病关系密切[4]。KOA发病及病情进展涉及多种病理生理学改变，其中包括软骨细胞凋亡[5]、炎性因子促炎反应[6]、软骨细胞外基质的降解[7]等因素。其中关节软骨基质合成与降解失衡是软骨变性的重要因素,软骨基质的过度降解、丢失是OA病情进展中的共同性特征之一。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是降解其细胞外基质的主要酶系[8]，其中MMP-3是基质溶解素，不仅参与间质胶原酶的激活，引起Ⅱ型胶原降解,而且可以激活明胶酶及多种丝氨酸蛋白酶，从而引起瀑布效应,对软骨造成进行性破坏[9-10]。炎性细胞因子与OA也有密切关系，研究发现OA病变程度与IL-6、IL-1β、TNF-α等细胞因子的水平有直接关系[11-12]。IL-1β不仅可以增加巨噬细胞的浸润，促进局部炎症，并促进MMPs的表达，也可介导软骨细胞的凋亡[13]。IL-6具有加重关节炎症反应、上调MMPs及刺激破骨细胞活化等作用[14]。

中医古籍中，无膝骨关节炎病名，现代中医根据发病的部位命名为“膝痹”。本病的发生与多种因素有关，中医认为膝骨关节炎发病与肝肾亏虚，风、寒、湿及瘀血客于局部有关，最终导致局部气滞血瘀，经脉痹阻不通而发病。其主要病机是“虚、瘀、毒”[15]，虚主要是肝肾亏虚，筋骨失养；瘀主要是气滞血瘀，寒凝瘀滞；毒主要是外来之风、寒、湿等邪气，本病主要以肝肾虚为本，外感邪气及气滞血瘀为标。在治疗痹证上，中医根据辨证，合理运用活血化瘀、祛风除湿、补益肝肾等药物[16]。中医在治疗膝骨关节炎有较多的优势，其中中医外用膏剂贴敷治疗因有方便、显效的特点，在临床上广泛运用。

超微肿痛贴是湖南省中医药研究院附属医院的自制中药外用膏剂，是蔡光先教授经验方“肿痛消”的改革剂型。超微肿痛贴方中延胡索能行血中气滞，故专治一身上下诸痛，味辛则气血能润能散，具有活血行气止痛的功效；方中大黄主取活血逐瘀之功，延胡索与大黄配伍活血祛瘀、行气止痛，共为君药；熟地黄及菟丝子配伍主要起补益肝肾之功，当归主起活血止痛之效，兼养血调经；川芎亦然行气、又能活血，可行一身之气，为“血中之气药”，并具有祛风止痛之效，共为臣药。香附理气止痛，红花、姜黄、蒲黄行血祛瘀，乳香与没药两者配伍加强方中活血行瘀、消肿止痛之功，莪术破血行气，白芷散寒止痛，栀子清热利湿，共为佐药，可助君药活血祛瘀、行气止痛之功；冰片辛香，通诸窍经络，引诸药行于经脉，为使药。诸药合用，共奏活血化瘀、行气消肿止痛、补益肝肾之功效，可标本兼治。现代药理研究中发现，方中延胡索及大黄两味君药的主要成分有良好的抑制炎性因子表达[17-18]、镇痛[19]等效果。课题组在前期的临床研究中发现超微肿痛贴在治疗膝骨关节炎中可有效地改善临床症状[20-21]，并且研究中证实了[22-25]降低P物质、OPN、1L-1β、TNF-α为其作用机制之一。传统散剂制作的外用膏剂中药材粒径大，因此溶出速率、溶出度及吸收率相对低，而超微肿痛贴运用的超微饮片将药材粒径降低了几十至近百倍，一般微粉粒径控制在1～75μm，在保持传统中药固有的药理化学成分的基础上，提取、浓缩等处理后增加了载药量、提高了透皮效果，并且增加了药物有效接触面积。

本实验设计中因新西兰兔的生理特性，膝关节液量少，无法达到直接收取的量，因此采用灌洗采取法[26-27]。氟比洛芬作为临床上常用的抗炎止痛药物，以往研究发现[28]，其有明显的降低CRP、IL-6、TNF-α等炎性因子的作用，并且在临床研究多次被证实，有良好的治疗KOA的作用[29-30]。

本次实验研究发现，超微肿痛贴及氟比洛芬巴布膏均可减少兔膝骨关节炎模型的关节液中IL-6、IL-1β水平，下调关节软骨中MMP-3蛋白表达，上调Ⅱ型胶原蛋白表达。通过实验结果可以推断超微肿痛贴可能是通过减少IL-6、IL-1β释放，抑制MMP-3表达，上调Ⅱ型胶原蛋白表达，进而保护关节软骨，这可能为其治疗KOA的作用机制之一，为超微肿痛贴防治KOA提供了部分实验依据。但超微肿痛贴组方药物较多，其有效成分及具体作用机制仍需进一步通过实验探索证实。