立 新，郝俊生，巴德玛斯仁，云 峰，奥·乌力吉
（1.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古蒙医药工程技术研究院，内蒙古 通辽 028000）
三臣丸是蒙医临床中常用的传统古方，又称臣方三味，最早记载于《四部医典》[1]，主要用于治疗小儿肺热、肝热等脏腑之热证，以及呼吸道感染引起的感冒咳嗽、发烧等症状。其毒性小、疗效确切，为治疗各种热证、特别是小儿退热的首选药[2-4]。三臣小儿退热贴是由三臣丸的剂型改进而成的，由红花、人工牛黄、天竺黄组成，其原剂型为水丸和散剂[5-6]。此两种剂型均由于小儿服用不便、顺从性差而影响其疗效。本课题拟将其剂型改进为外用贴剂，以便克服传统剂型的缺点，增加疗效，减少毒副作用。新剂型三臣小儿退热贴携带和使用方便，解决了儿童及婴幼儿使用困难的难题。
羟基红花黄色素A为红花中含量较高的成分，也是其主要活性成分，为评价红花的质量标准之一[5]，常用于红花相关制剂质量标准的含量测定指标。目前提取红花黄色素A工艺的报道很多，但不同文献报道的提取方法各不相同。本实验从中选择最佳条件为当因素，采用正交试验设计法，优选三臣小儿退热贴中羟基红花黄色素A最佳提取工艺，为有效利用红花提供依据。
1 材 料
1.1 仪器 高效液相色谱仪（华普科技有限公司）；数控超声波洗清器（昆山超声仪器有限公司）；恒温水浴锅（上海-恒科学仪器有限公司）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；冷凝回流装置；电热鼓风干燥器（上海-新苗医疗器械有限公司）。
1.2 试药 红花由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供（批号：20190714），经过全检，符合《中华人民共和国药典》（2015版）“红花”项下相关规定。羟基红花黄色素A（中国食品药品检验所，批号：110876-202004）。
1.3 试剂 无水乙醇（分析纯，天津大茂化学试剂厂，批号：20190905）；甲醇（色谱纯，德国默克两合公司）；乙腈（色谱纯，德国默克两合公司）；磷酸溶液（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司，批号：20170519）；超纯水（自制）。
2 方法与结果
2.1 羟基红花黄色素A的含量测定
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：A相-乙腈，B相-0.7%磷酸溶液，梯度洗脱（0～15 min，A相12%，B相88%；15～30 min，A相12～32%，B相88%～68%）；流速：1.0 mL/min，检测波长：403 nm；柱温30℃；进样量：10μL。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品1.32 mg，放置10 mL容量瓶中，加25%甲醇定容，摇匀，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 取红花粉末（过50目筛）约4.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入15倍水，回流提取3次，60 min/次。合并提取液，定容至250 mL，0.45μm滤膜滤过，精密吸取25 mL，放置50 mL容量瓶中，加水定容即可。
2.1.4 专属性和系统适用性 将对照品溶液与供试品溶液各进样10μL，色谱图见图1～2。理论塔板数大于3 000，分离度1.82，专属性良好。
图1 对照品色谱图
图2 供试品色谱图
2.1.5 标准曲线的绘制 取“2.1.2”项羟基红花黄色素A对照品溶液2、5、10、15、18μL进样6次，测定峰面积。以峰面积值（Y）对进样质量（X）进行线性回归，得回归方程：Y=2 271.2X-86.936，R2=1.00，结果见图3。羟基红花黄色素A在0.264～2.376 mg范围内线性关系良好。
图3 标准曲线图
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度试验 取“2.1.2”项羟基红花黄色素A对照品溶液，重复进样6次，每次10μL，记录峰面积和保留时间，计算RSD值。结果峰面积RSD=0.85%（n=6），保留时间RSD为0.31%，表明仪器精密度良好。
2.2.2 稳定性试验 将“2.1.3”项供试品溶液于0、2、4、6、8、12 h共进样6次，每次10μL，记录峰面积，计算RSD值。RSD为1.13%。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.2.3 重复性试验 取样品6份，按“2.1.3”法制备后取10μL进样，测定每份样品中羟基红花黄色素A的含量。RSD为1.75%。表明该方法重复性很好。
2.2.4 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品9份，分为低、中、高剂量3组。分别精密加入相当于待测样品含量的50%、100%、150%的对照品溶液，按样品测定项下操作。平均回收率为99.6%；RSD值为1.98%。表明该方法准确性良好。
2.3 红花提取工艺的优选
2.3.1 因素水平表 根据文献研究结果[6-8]，以溶剂、溶剂量、提取时间、提取次数为影响因素，每个因素设计3个水平，建立L9（34）试验表。（见表1）
表1 因素水平表
2.3.2 正交试验结果 精密称取4.0 g红花粉末（过50目筛），按正交试验表进行提取，合并提取液，定容至250 mL。摇匀，精密吸取25 mL，加相应溶剂定容至50 mL，每次进样10μL，测定羟基红花色黄素A的含量。由于羟基红花黄色素A在高温下稳定性差[9]。所以提取温度和时间不宜过高、过长。
精密吸取提取液200 mL，置于恒重的蒸发皿中，在水浴锅上蒸干后移到105℃烘干箱中放置3 h，取出置干燥器中，放冷30 min，测定出膏量。
以羟基红花黄色素A含量和出膏量为指标，采用加权综合评分优选最佳提取工艺，并对加权分析的结果进行方差分析。综合评价分数=提取率×60%+出膏率×40%。结果见表2。
表2 正交试验结果
由正交试验结果可知各因素对羟基红花黄色素A的提取效果的影响大小顺序为：D〉A〉C〉B，即提取次数〉提取溶剂〉提取时间〉溶剂量，三臣小儿退热贴最佳提取工艺为A3B3C2D3。
由于溶剂量的影响最小，且15倍和20倍溶剂量之间无显着差异，为了节省生产成本，最终确定红花最佳提取工艺为15倍的60%乙醇为溶剂，回流提取3次，每次60 min。在此条件下，羟基红花黄色素A提取率达98.9%。
2.3.3 方差分析 由直观分析和方差分析可见，各因素对羟基红花黄色素A的提取无显着性差异，方差分析结果见表3。
表3 方差分析结果
3 讨 论
三臣丸是蒙医和藏医通用的传统古方，最早记载于《四部医典》[10]，在很多蒙医经典着作里均有记载。三臣丸为解热散剂族“臣方”的主要部分或基础方[11-14]。三臣丸主要用于治疗小儿伤风感冒、肺炎、支气管炎及其引起的咳嗽、发烧等症状。三臣丸治疗各种热证疗效确切，为蒙医临床中最常用的小儿退热的药。本课题拟将其剂型改进为外用贴剂，为发热儿童提供安全、有效、使用方便的经皮给药蒙药复方制剂。
三臣小儿退热贴成型工艺为取处方量红花，粉碎过50目筛，加15倍60%乙醇，回流提取3次，每次60 min，合并提取液，过滤，50℃减压浓缩至浸膏，冷冻干燥，备用。人工牛黄和天竺黄，粉碎成细粉，过150目筛，备用。将N46和甘羟铝加入盛有甘油的烧杯中，充分搅匀后加入处方量人工牛黄、天竺黄药粉，用搅拌器混合均匀作为A相；将酒石酸溶解于纯化水中，加入红花提取物冻干粉搅拌使之完全溶解加入N500充分搅匀作为B相，再将B相加入A相中，搅拌充分交联后，涂布于无纺布上，盖上保护膜，即得三臣小儿退热贴。
药理实验采用干酵母致大鼠发热模型，对三臣小儿退热贴红花提取组、原药粉组和原剂型组的药效进行比较，结果显示红花提取组的疗效优于原药粉组，剂型改进后的三臣小儿退热贴高、中剂量组退热效果良好，与原剂型相当，发热后4 h使体温降至正常。
组方中人工牛黄主要成分为胆酸、胆红素，以及无机盐类和微量元素[15]；天竺黄主要成分为硅酸盐及多种无机元素和氨基酸[15]。该两种药物均不宜提取。红花的主要成分是红花黄色素，属于黄酮类成分中的查尔酮类，溶于水和乙醇[16]。红花黄色素也溶于甲醇，但溶媒残留对人体危害，且生产成本高、生产过程中对环境造成污染，综合以上因素，本课题组设计了以水和不同浓度乙醇为溶剂并以羟基红花黄色素A含量及出膏量为考察指标，运用正交试验方法，确定了三臣小儿退热贴最佳提取工艺。
最终确定羟基红花黄色素A适宜的提取工艺条件为：以15倍量60%乙醇为溶剂，回流提取3次，每次60 min。该方法稳定可行，可用于三臣小儿退热贴中羟基红花黄色素A的提取。
