郑淑彦，向进乐,2，李志西,*
(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003)
枳椇醋发酵阶段产物的抗氧化活性变化
郑淑彦1，向进乐1,2，李志西1,*
(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003)
采用液态深层发酵法酿造枳椇醋，以总酚含量、总黄酮含量、清除DPPH自由基能力、还原能力、总抗氧化能力为指标，研究枳椇醋不同发酵阶段产物抗氧化活性的变化。结果表明：总酚含量和清除DPPH自由基能力在枳椇醋酿造过程中增加；总黄酮含量在酒精发酵阶段减少，在醋酸发酵阶段增加；还原能力发酵前后相当；总抗氧化能力在酒精发酵中增强，在醋酸发酵中略减弱。
枳椇汁；枳椇酒；枳椇醋；抗氧化活性
枳椇(Hovenia dulcis Thunb)为鼠李科拐枣属(Hovenia Thunb)植物，又名拐枣、万寿果等。枳椇果梗肥大扭曲，含有丰富的糖类、氨基酸、维生素等营养物质[1-2]。果醋与粮食醋相比具有更为丰富的营养价值，其富含琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、多种氨基酸、维生素及生物活性物质[3-4]，且口感醇厚，具有软化血管、降血压、消除疲劳、养颜等功效。因此，将个体较小、残渣较多、适口性较差但营养丰富的枳椇果梗通过发酵加工成枳椇醋具有较好的现实意义。
水果、葡萄汁、酒、醋中含有酚类物质，多酚是一类很有实用前景的天然抗氧化剂及自由基清除剂[5]。流行病学研究证实，一些慢性病和冠心病的发病率与摄入富含酚类物质的食物的多少有关系[6]。而黄酮类物质是一类在植物界中分布广泛、具有多种生物活性的多酚类化合物。黄酮类物质在人体内可以清除游离自由基，可起到预防衰老、心血管疾病和癌症等作用[7]。研究表明，枳椇中含有黄酮类物质。据报道，Yoshikawa等[8]从北枳椇的种子和果实中得到(+)-二氢杨梅黄酮、Hovenitins Ⅰ-Ⅲ，韩国学者从韩国产的北枳椇的果实中得到解酒毒活性成分hovenodulinol[9]。1996年，Liang等[10]从枳椇叶及北枳子中分离得到了黄酮类化合物山奈酚、槲皮素、异槲皮素、芦丁、(+)-二氢杨梅素等。
目前，关于枳椇产品抗氧化活性以及发酵前后抗氧化活性变化的研究较少，因此，本工作研究枳椇发酵过程中抗氧化活性的变化，为枳椇这一野生资源的研究开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枳椇：产地西安市临潼区龙河西岸南姚村。
酵母菌(酒用高活性干酵母) 湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌 上海中科伍佰豪生物有限公司；原儿茶酸、芦丁、BHA、DPPH 美国Sigma公司；福林酚试剂 上海荔达生物科技有限公司；总抗氧化能力测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
电子分析天平 北京塞多利斯天平有限公司；规格0-30酒精计 上海医用仪表厂；HH-S4型数显恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；KDC-40低速离心机科大创新股份有限公司中佳分公司；UV-1700型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；TD5A台式离心机 湖南凯达科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 枳椇醋发酵工艺
1.3.1.1 枳椇醋发酵工艺流程图
1.3.1.2 枳椇醋发酵工艺要点
将清理干净的枳椇果梗加水打浆后(果梗与水质量比1:1.5)，加入0.1% 活性酒用干酵母，搅拌均匀，于25℃左右的条件下发酵，当酒体积分数达到7%以上且不再上升时，酒精发酵结束，离心分离得枳椇酒醪。给枳椇酒醪中接入活化的醋酸菌液(酒醪与菌液体积比10:1)，于33℃左右的条件下，采用实验室小型自吸式发酵罐进行通气发酵，当酸度达到5%以上且不再上升时，醋酸发酵结束。然后采用分割留种法取出1/2 枳椇醋液，经过滤、杀菌、澄清得成品枳椇醋。同时给发酵罐补充枳椇酒醪继续进行醋酸发酵，如此反复。
1.3.2 总酸的测定
采用酸碱滴定法[11]，总酸含量以醋酸计。
1.3.3 总酚含量的测定
以原儿茶酸为标准品，参考田文礼等[12]的方法进行测定。准确量取0.1mg/mL 原儿茶酸标准液0、0.25、 0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75mL于25mL容量瓶中，各加15mL水，摇匀。再加入1.25mL福林酚试剂，充分摇匀。1min后，加入20g/100mL Na2CO33.75mL，混匀定容，在75℃反应10min，冷却，于波长765nm处测定吸光度，绘制标准曲线，得回归方程为：y = 110.24x+ 0.0182(R2=0.998)。
准确吸取0.1mL样品，按上述方法进行测定，得样品溶液的吸光度，代入回归方程计算样品中总酚的含量。
1.3.4 总黄酮含量的测定
以芦丁为标准品，参考李利华等[13]的方法进行测定。分别量取0、2、4、6、8、10mL的0.1mg/mL芦丁标准液于25mL容量瓶中，用70%的乙醇溶液补到10mL，加入5g/100mL NaNO20.8mL摇匀，放置6min。然后加入10g/100mL Al(NO3)30.8mL摇匀，放置6min，再加入4g/100mL NaOH 10mL摇匀，放置15min，以蒸馏水定容，在波长510nm处测定吸光度，绘制标准曲线，得回归方程为：y=12.308x－0.0055(R2=0.9993)。
准确吸取1mL样品，按上述方法进行测定，得样品溶液的吸光度，代入回归方程计算样品中总黄酮含量。
1.3.5 DPPH自由基清除能力的测定
参考吴琼英等[14]方法进行测定。将2mL 0.1mmoL/L的DPPH醇溶液加入到2mL含有20、40、 60、80、100μL样品的水溶液中，混匀反应20min后，3500r/min离心10min，取上清液在波长517nm处测定吸光度(Ai)；同时加入2mL DPPH醇溶液和2mL无水乙醇按上述方法测定吸光度(Ac)；以及2mL样品水溶液和2mL无水乙醇按上述方法测定吸光度(Aj)。根据下列公式计算清除率。
清除率/%=[1－(Ai－Aj)/Ac]×100
1.3.6 还原能力的测定
参考Oyaizu等[15]方法进行测定。分别将50、100、150、200、250、300μL样品溶液加入到1mL蒸馏水中，然后加入2.5mL磷酸缓冲液(0.2moL/L pH6.6)混匀，再加入1g/100mL铁氰化钾2.5mL。混合物于50℃恒温20min后，加入1mL 10g/100mL三氯乙酸，3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，加蒸馏水2.5mL以及0.1% FeCl30.5mL，在波长700nm处测定吸光度。吸光度越大，说明这种反应混合物的还原性越强。
1.3.7 总抗氧化能力的测定
按照总抗氧化能力检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行测定。具体步骤按总抗氧化能力检测试剂盒操作。
2 结果与分析
2.1 枳椇不同发酵阶段产物的总酚、总黄酮含量
按照上述工艺流程制得的枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋来源于同一批原料，分别测定枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋的总酚和总黄酮含量，结果见表1。
表1 枳椇汁、枳椇酒及枳椇醋中总多酚、总黄酮含量Table 1 Total acid, total phenol and total flavonoid contents in intermediate products at different stages of fermentation of Hovenia dulcis Thunb fruit wine
从表1可以看出，枳椇在发酵过程中总酚含量增加，总黄酮含量先减少后增加。这可能是因为酵母、醋酸菌等微生物使一些酚类物质从枳椇果梗中溶出或是发酵微生物代谢中产生了这类物质从而使总酚含量增加。而在酒精发酵过程中，黄酮类化合物可能有部分转化为其他酚类物质或是其他物质，因而总黄酮含量下降[16]。
2.2 清除DPPH自由基的能力
图1 枳椇发酵过程中对DPPH自由基清除率的变化Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of intermediate products at different stages of fermentation of Hovenia dulcis Thunb fruit wine at different doses
如图1所示，100μL的枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋和100μL 100μg/mL的丁基羟基茴香醚(BHA)对DPPH 自由基清除能力分别为55.6%、88.0%、93.8%、51.4%，这表明枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋有明显的清除DPPH自由基的能力，且三者随着加入量的增加，清除率基本呈线性增强。三者的大小关系是：枳椇醋＞枳椇酒＞枳椇汁。这表明在酒精发酵和醋酸发酵这两个过程中，清除DPPH自由基能力逐渐增强，这可能是由于在发酵阶段多酚含量增大引起清除DPPH自由基的能力增强。这一变化趋势和闫霞等[16]对山西老陈醋抗氧化物质的研究结果一致。
2.3 还原能力
如图2所示，枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋都具有较强的还原能力，随着用量的增加，还原能力增强。枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋三者的还原能力几乎相当，枳椇醋略强于枳椇酒，枳椇酒略强于枳椇汁。这表明，枳椇在酒精发酵过程和醋酸发酵过程中还原能力略微增强。枳椇汁还原力较强可能是因为其中含有较多的还原糖及抗氧化成分如VC。据报道，每100g枳椇果梗中约含总糖31.3g，还原糖20.3g；枳椇果梗中VC的含量约为202mg，明显比苹果[17]等水果中的VC含量高。这些维生素可能和多酚类物质有协同作用使得枳椇汁的还原能力增强[18]。楚文靖等[19]研究了紫甘薯酒和汁的抗氧化性，其结果和本实验一致。
图2 枳椇发酵过程中还原能力的变化Fig.2 Reducing power of intermediate products at different stages of fermentation of Hovenia dulcis Thunb fruit wine at different doses
2.4 总抗氧化能力
图3 枳椇发酵过程中总抗氧化能力的变化Fig.3 Total antioxidant capacities of intermediate products at different stages of fermentation of Hovenia dulcis Thunb fruit wine at different doses
如图3所示，当加入量为100μL时，枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋、100μg/mL BHA 的总抗氧化能力分别为36.0、53.5、45.9mg/mL和7.7mg/mL。枳椇酒的总抗氧化能力要高于枳椇醋，枳椇醋高于枳椇汁。这表明，在发酵过程中，总抗氧化能力先增强后减弱。这可能是因为醋酸发酵使得酒中含有高抗氧化活性的酚类物质减少或是醋中产生一些新的低抗氧化活性的酚类成分，虽然醋中总酚含量高于酒中总酚含量，但是决定抗氧化活性高低的有效成分在醋中的比例减少，因而总抗氧化能力呈现先增加后减少的现象[20]。
3 结 论
通过研究枳椇发酵阶段产物体外抗氧化活性，得出结论如下：枳椇汁在酒精发酵和醋酸发酵过程中抗氧化能力增强。同时，这一变化和总酚含量变化趋势一致，这表明，枳椇在发酵过程中多酚含量的变化对抗氧化能力的变化起了作用。枳椇汁、枳椇酒、枳椇醋都具有较强的清除DPPH自由基的能力、还原能力以及总抗氧化能力，是较好的天然抗氧化剂。
本研究只取了发酵过程的3个产物来预测枳椇发酵过程的抗氧化能力的变化，其他产物有待于今后进一步更深入的研究。
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Changes in Antioxidant Properties of Hovenia dulcis Thunb Vinegar during Fermentation Process
ZHENG Shu-yan1，XIANG Jin-le1,2，LI Zhi-xi1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；
2. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)
Liquid-state submerged fermentation was employed to brew Hovenia dulcis Thunb fruit wine, and the antioxidant properties of intermediate products at different fermentation stages were comparatively evaluated based on DPPH free radical scavenging ability, reducing power and total antioxidant capacity. The results indicated that all DPPH free radical scavenging ability, reducing power and total antioxidant capacity displayed an upward trend during the fermentation. Total flavonoid content revealed a trend to decline in the alcohol fermentation stage and to ascend in the acetic acid fermentation stage. Almost no difference in reducing power before and after fermentation was observed. Total antioxidant capacity was elevated in the alcohol fermentation and slightly attenuated in the acetic acid fermentation.
Hovenia dulcis Thunb fruit juice；Hovenia dulcis Thunb fruit wine；Hovenia dulcis Thunb fruit vinegar；antioxidant activity
TS255.47
A
1002-6630(2011)07-0113-04
2010-09-10
郑淑彦(1983—)，女，硕士研究生，主要从事发酵食品研究。E-mail：zsy_8323@163.com
*通信作者：李志西(1958—)，男，教授，博士，主要从事谷物功能食品及发酵食品研究。
E-mail：lzx580721@yahoo.com.cn
