侯进慧，刘全德，高兆建，孔文刚，蔡 侃
(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)
牛蒡根际耐Cd2+菌株的分析
侯进慧，刘全德，高兆建，孔文刚，蔡 侃
(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)
采用纯培养法，从牛蒡根际土壤中分离耐Cd2+菌株，对耐Cd2+菌株的耐性和种群多样性进行分析。结果显示：分离到10株耐Cd2+菌株，经16S rDNA分子鉴定，耐Cd2+菌株分别属于Bacillus subtilis、Enterobacter aerogenes、Enterobacter ludwigi、Klebsiella sp.、Pectobacterium carotovorum、Pseudomonas sp.。其中，Pectobacterium carotovorum NP22、Enterobacter ludwigii NP23、Pseudomonas sp. NP39等3株菌株的对Cd2+耐性最高，在Cd2+质量浓度为400mg/L固体LB培养基中可正常生长。
牛蒡；根际；耐Cd2+细菌
有东洋参之称的草本植物牛蒡(Arctium lappa L.)，肉质根肥大，具有抗菌、抑制肿瘤的功效，是一种可食用且营养价值较高的农产品。江苏徐州的丰县是我国牛蒡的主产区，其牛蒡种植面积占到全国的40%以上，多出口到日本、韩国等地区，经济效益较高[1]。随着经济的发展，人们对于食品原料的质量日益重视。其中，消除重金属对食品的污染是当前需要关注的一个问题。重金属污染是指重金属及其化合物对大气、土壤和水质等环境的污染。常见的重金属元素有镉(Cd)、汞(Hg)、铅(Pb)等，它们可能通过食物链系统进入人体，危害人类的健康。在元素周期表中，镉属于第二副族，其单质是银白色有光泽的金属，因其具有致突变、致畸及致癌“三致”作用，必须从环境中富集去除，才能达到环境修复的目的，因此该元素一直是环境修复研究的重点[2]。通过微生物进行重金属富集研究显示，很多种类的微生物都有较好的富集作用。在对植物的研究中，根际作为植物与土壤生态系统物质交换的活跃界面，是相关研究的热点。根际微环境联系着植物与土壤，控制着重金属等污染物从土壤向植物的迁移。根际微生物通过多种方式影响土壤重金属的毒性和生物可利用性。筛选耐受重金属的微生物是开发微生物富集和修复的基础。对于微生物耐Cd2+的基础和应用研究都需要不断深入。
本实验从牛蒡根际土壤中分离筛选耐Cd2+细菌，分析不同菌株对Cd2+的耐受特征，并利用16S rDNA序列分析牛蒡根际耐Cd2+菌株的种群特征，为进一步探索根际微生物控制重金属污染物从土壤向植物的迁移提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
从牛蒡产地多个不同生长点随机取样，采集多株牛蒡，并与根际土壤一同带到实验室，当天完成菌株分离工作。采样工作在两年里进行了12次。
1.1.2 试剂
PCR反应试剂、DNA marker 天根生化科技(北京)有限公司；其他试剂(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
LB(luria-bertani)液体培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。固体培养基：在LB液体培养基基础上每升还需加琼脂粉12g。高压灭菌。在配制不同质量浓度含Cd2+培养基时，加入灭菌后的CdSO4溶液, 使Cd2+质量浓度分别为50、100 、200、400mg/L。
1.2 菌株分离
从牛蒡根际土壤中分离菌株，在培养基中逐渐改变Cd2+的质量浓度(50、100、200、400mg/L)，筛选耐Cd2+菌株，进一步分离纯化获得相应抗性的菌落。
1.3 菌株基因组DNA提取
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采用苯酚-氯仿抽提，乙醇沉淀的方法提取菌株基因组DNA，琼脂糖凝胶检测DNA，选择质量较好的菌株基因组DNA作为 PCR反应模板[3]。
1.4 菌株分子鉴定
1.4.1 引物设计与合成
根据细菌16S rDNA 序列保守性设计合成引物[4]：F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。在上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。
1.4.2 PCR扩增16S rDNA序列
PCR反应体系是50μL，其中有10 × PCR反应缓冲液5μL、dNTP 4μL、上下游引物各1μL、基因组DNA模板1μL、Long Taq DNA 聚合酶0.5μL，加无菌超纯水补足体积。扩增条件是95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火60s，72℃延伸90s，进行25个循环；72℃延伸6min[4-6]。
1.4.316 S rDNA序列分析
菌株16S rDNA序列送上海生工生物工程技术公司测序。用Blast程序在GenBank基因库中将获得的16S rDNA序列进行序列比对，分析各菌株的分类地位。使用Dnaman程序构建菌株的系统发育树[5]。
2 结果与分析
2.1 牛蒡根际耐Cd2+菌株的分离
图1 不同质量浓度Cd2+培养基上菌落生长情况Fig.1 Colony growth on culture media with various Cd2+concentrations
首先筛选出耐50mg/L Cd2+的菌株，再提高培养基中Cd2+质量浓度，依次获得耐受质量浓度为100、200、400mg/L Cd2+的菌株。由图1可知，在低质量浓度时菌落较大，随着质量浓度升高，菌落生长明显变缓慢，菌落直径也变小。
2.2 菌株分类和最小抑菌质量浓度
提取菌株基因组DNA，使用细菌16S rDNA 序列保守性引物扩增各菌株的16S rDNA。将16S rDNA 的PCR产物进行1g/100mL琼脂糖凝胶电泳分析，获得特异条带(图2)。将序列送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，获得相关序列。分析各菌株的序列特征，确定分类地位。这些物种属于2个门，即厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)，分属于5个属的菌种，分别是肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、果胶杆菌属(Pectobacterium)和厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌属(Bacillus)。筛选出的10株耐Cd2+菌株分类和最小抑菌质量浓度(MIC)见表1。
表1 牛蒡根际耐Cd2+菌株类群和最小抑菌Cd2+质量浓度Table 1 Cd2+-resistant strains from Arctium lappa rhizosphere and their MICs
图2 16S rDNA电泳结果Fig.2 Electrophoresis of 16S rDNA
2.3 菌株系统演化关系分析
将筛选出的抗性菌株16S rDNA序列进行分析，并从GenBank数据库中找寻相关的序列，进行相似性比对。本实验选取亲缘关系较近的菌株，使用MEGA4.0软件对16S rDNA序列进行Neighbor-joining法构建系统发育树(图3)。分离获得的牛蒡根际耐Cd2+菌株分别属于Bacillus subtilis、Enterobacter aerogenes、Enterobacter ludwigi、Klebsiella sp.、Pectobacterium carotovorum、 Pseudomonas sp.。其中，Pectobacterium carotovorum NP22、Enterobacter ludwigii NP23、Pseudomonas sp. NP39菌株的耐Cd2+性最高，在Cd2+质量浓度为400mg/L固体LB培养基中可生长。分析牛蒡根际耐Cd2+菌株的类群可见，克雷伯菌属(Klebsiella)菌株较多，假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、果胶杆菌属(Pectobacterium)次之。而芽胞杆菌属(Bacillus)仅分离到一株，且MIC只有50mg/L。
图3 牛蒡根际耐Cd2+菌株及其在GenBank数据库中相关种属细菌的16S rDNA为基础的系统发育树Fig.3 Neighbor-joining tree based on partial and aligned 16S rDNA sequences of Cd2+-resistant strains isolated from Arctium lappa rhizosphere and their nearest strains
3 讨 论
在德国学者Lorenz Hiltner提出根际概念的一百多年中，根际研究不断发展，而分子生物学技术的应用又极大地推动了根际微生物的研究。植物根际分泌物和根的脱落物都位于根际，其中富含有机物质，这就导致植物根际微生物的种类和数量与非根际土壤都有所不同。微生物重金属污染生物修复技术日益受到研究者的重视，这一研究的前提是从环境中分离高耐受和富集能力的微生物菌株。国外有研究者从废弃矿山中筛选获得对Cd2+有很强的抗性和富集能力的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)[7]。国内有学者分离到一株在Cd2+200mg/L的培养基上正常生长的菌株[2]。文献资料显示[7-12]，Cd2+耐性菌株主要是阴沟肠杆菌、克雷伯氏菌、芽孢杆菌、假单胞菌等类群。本研究获得的Cd2+耐性菌株分别是肠杆菌、假单胞菌、克雷伯氏菌、果胶杆菌和芽孢杆菌，与国外研究基本吻合。但牛蒡根际仅分离到一株耐Cd2+芽孢杆菌，且对Cd2+耐性仅是50mg/L，同时新发现一株耐Cd2+400mg/L的果胶杆菌NP22，具有深入研究价值。对于不同类群Cd2+耐性菌株的分析，有利于分析微生物对重金属的耐性机理。目前研究认为，导致微生物重金属耐性的原因主要有胞外沉淀、细胞表面吸附、主动运输、细胞内隔离、酶解毒等[13-15]。课题组将会对分离到的耐性菌株的耐受机理和应用研究做进一步的分析。
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Preliminary Analysis of Cd2+-Resistant Bacteria from Arctium lappa Rhizosphere
HOU Jin-hui，LIU Quan-de，GAO Zhao-jian，KONG Wen-gang，CAI Kan
(College of Food Engineering (Bioengineering), Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)
Cultivable Cd2+-resistant bacterial strains were isolated from burdock rhizosphere by pure culture, and Cd2+-resistant MIC and bacterial strain diversity were analyzed. The results showed that 10 Cd2+-resistant strains were isolated and identified as Bacillus subtilis, Enterobacter aerogenes, Enterobacter ludwigi, Klebsiella sp., Pectobacterium carotovorum and Pseudomonas sp. by 16S rDNA sequence. Among these strains, Pectobacterium carotovorum NP22, Enterobacter ludwigii NP23 and Pseudomonas sp. NP39 had the highest MIC, which was up to 400 mg/L Cd2+on solid LB plate.
Arctium lappa；rhizosphere；Cd2+-resistant bacteria
TS201.21
A
1002-6630(2012)11-0177-04
2011-06-09
江苏省高校自然科学基金项目；徐州市科技计划项目(XZZD0924)；徐州工程学院校科研项目(XKY2011110)；徐州工程学院2011年大学生创新创业基金项目
侯进慧(1980—)，男，讲师，博士，研究方向为生物工程。E-mail：houjinhui0@126.com
