响应面法优化鲊辣椒的纯种发酵工艺

王 微，阚建全,2,3,

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715；3.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（重庆），重庆 400715）

鲊辣椒是川、鄂、湘、黔等地区的一种传统特色食品，是以新鲜的红辣椒和玉米粉为主要原料，加一定的辅料拌合后自然发酵而成，成品微酸微辣、香气特殊、回味醇厚，保存期相对较长。鲊辣椒又称鲊金椒，鲊海椒、鲊广椒，是鲊菜之母，既可单独成菜，也可用其作为原料加工成许多鲊菜。因其独特风味和口感，并具有较高营养价值等而广受大众喜爱。但目前鲊辣椒的传统制作方法是自然发酵[1]，具有发酵条件稳定性差，生产发酵周期长，产品品质不稳定、安全性低，且没有工业化大规模生产。因此，鲊辣椒纯种发酵技术则可以改善传统发酵的很多弊端，使产品更安全[2]、更美味、更营养及生产更规模化，品质和产量均更符合人们的需求。在鲊辣椒纯种发酵的过程中，菌种的选择、菌种的接种量、发酵时间与发酵温度、原料的配比等都是纯菌接种快速发酵技术成功的关键[3-5]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类能够通过同型发酵或者异型发酵而产生乳酸的细菌[6]，是蔬菜发酵中较为重要的一种细菌，最近有研究显示乳酸菌还能够加强特异性及非特异性免疫[7-8]，目前乳酸菌已广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵以及医疗保健领域[9]。因此，本实验在前期研究的基础上，利用乳酸菌作为发酵菌，并采用响应面法对其纯种发酵工艺参数进行优化，旨在探讨影响鲊辣椒纯种发酵的各因素，为鲊辣椒纯种发酵技术工业化提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜红辣椒（红线椒）、干玉米粉（过40目筛）、食盐 重庆永辉超市；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum6001） 中国科学院菌种保藏中心。

氢氧化钠（分析纯） 天津市瑞金特化学品有限公司；甲醛、3,5-二硝基水杨酸、亚硝酸钠等（均为分析纯） 成都市科龙化工试剂厂；硝酸银（分析纯）天津光复科技发展有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂等（均为生物试剂） 北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；722-P可见分光光度计 上海现科仪器有限公司；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；PB-10 Sartorius酸度计 赛多利斯科学仪器有限公司；分析天平 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵菌悬液的制备

发酵菌液的制备[10-11]：取乳酸菌保藏菌种2环于斜面（MRS培养基）活化48 h，再取2环于MRS液体培养基中再活化48 h后接入500 mL液体MRS培养基中扩大培养乳酸菌发酵液（冷藏保存备用）。

1.3.2 纯种发酵鲊辣椒的单因素试验

1.3.2.1 发酵温度对鲊辣椒品质的影响研究

固定m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、食盐添加量5%、菌悬液接种量5%，混合拌料后置于密闭的容器中分别在23、25、30、35、40、42℃条件下恒温发酵5 d。然后测定成品的pH值、总酸含量、氨基酸态氮含量和感官评分。

1.3.2.2 接种量对鲊辣椒品质的影响研究

将m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、发酵温度30℃、食盐添加量5%，混合拌料后置于密闭的容器中分别在1%、3%、5%、7%、9%、10%乳酸菌菌悬液接种量下恒温发酵5 d。然后测定成品的pH值、总酸含量、氨基酸态氮含量和感官评分。

1.3.2.3 发酵时间对鲊辣椒品质的影响研究

将m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、发酵温度30℃、食盐添加量和菌悬液接种量5%，混合拌料后置于密闭的容器中分别在发酵2、3、4、5、6、7 d。然后测定成品的pH值、总酸含量、氨基酸态氮含量和感官评分。

1.3.2.4 原料配比对鲊辣椒品质的影响研究

将m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）分别为3∶1、2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶2、1∶3，食盐添加量5%，菌悬液接种量5%，发酵温度30℃，混合拌料后置于密闭的容器中恒温发酵5 d。然后测定成品的pH值、总酸含量、氨基酸态氮含量和感官评分。

1.3.2.5 盐添加量对鲊辣椒品质的影响研究

将m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、菌悬液接种量5%、发酵温度30℃，混合拌料后置于密闭的容器中分别在1%、3%、5%、6%、8%、10%食盐添加量下恒温发酵5 d。然后测定成品的pH值、总酸含量、氨基酸态氮含量和感官评分。

1.3.3 鲊辣椒纯种发酵工艺条件的响应面优化试验研究

响应面优化试验采用Design Expert 7.0.0软件Box-Behnken中心组合原理进行设计。根据单因素试验结果，选取发酵温度、接种量、发酵时间、m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）以及食盐添加量作为5个主要影响因素，以总酸含量、氨基酸态氮含量、感官评分为相应评价值设计响应面优化试验[12-14]，对鲊辣椒纯种发酵工艺条件参数进行优化试验研究。

1.3.4 理化指标的测定

pH值测定[15]：采用pH计测定；总酸含量测定[16]：中和滴定法；氨基酸态氮含量测定[17]：甲醛滴定法。

1.3.5 感官评价

采用100分制[18]，请10位有经验的食品专家和10位消费者（非专业人员）按感官评分标准对成熟鲊辣椒样品进行评分，取平均分作为最终评分。

表1 鲊辣椒的感官评定标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of preserved pepper

1.4 数据处理

实验重复3次，并采用OriginLab Origin Pro v7.5软件进行数据统计分析和制图。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺条件的单因素试验结果

2.1.1 发酵温度对鲊辣椒发酵的影响

由表2可见，从23 ℃开始，随着发酵温度增加产酸量和氨基酸态氮含量都是先增加，35 ℃以后则开始减少，感官评分也表现为先增加后降低的趋势。总酸含量（以乳酸计）在35 ℃时含量最高为1.07%，和30 ℃时的1.02%较接近，其他温度下的总酸含量都＜0.81%。可见，温度过低或过高均不利于鲊辣椒的乳酸形成。氨基酸态氮的含量在30 ℃时最高为0.28%，同时，此时的感官评分也最高为91.42分。

表2 发酵温度对鲊辣椒发酵的影响Table 2 Effect of fermentation temperature on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

2.1.2 接种量对鲊辣椒发酵的影响

表3 接种量对鲊辣椒发酵的影响Table 3 Effect of inoculum quantity on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表3可见，当接种量从1%到10%递增，pH值是逐渐降低的，较明显变化的是1%、3%和5%。接种量＞5%后随着接种量增加，pH值略降低，但是不显着。鲊辣椒的总酸含量、氨基酸态氮的含量也随着接种量的增加而增加，当接种量达到5%后，其增长量很小，甚至总酸的含量有略微下降的趋势；这说明并不是接种量越多鲊辣椒发酵越好。

2.1.3 发酵时间对鲊辣椒发酵的影响

表4 发酵时间对鲊辣椒发酵的影响Table 4 Effect of fermentation time on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表4可知，随着发酵时间的增加，鲊辣椒的氨基酸态氮含量、总酸含量逐渐升高、pH值逐渐下降；当发酵时间达到第4天时，鲊辣椒总酸含量为1.09%，pH值为4.25，之后的鲊辣椒的总酸量增长就十分缓慢并趋于平缓。发酵到第7天时，鲊辣椒的总酸含量和pH值与第4天的变化仍不明显。

2.1.4 原料配比对鲊辣椒品质的影响

表5 原料配比对鲊辣椒发酵的影响Table 5 Effect of mass ratio of chili pepper to corn flour on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表5可知，鲊辣椒所占的比例越多，发酵产酸量越多；当鲊辣椒与玉米质量比达到3∶1时，总酸含量为1.67%，此时氨基酸态氮含量为0.20%，感官评分为80.79。虽然产酸较多，但是氨基酸态氮含量仍然较低；并且由于鲊辣椒比例大，水分过多，鲊辣椒的外观和组织评分较低，以及过高的酸度，使之总体的感官评分较低。当鲊辣椒与玉米质量比1∶3时，总酸含量0.49%、氨基酸态氮含量0.15%和感官评分80.46，此时的鲊辣椒各个指标都处于较低的值，不易被消费者接受。

2.1.5 食盐添加量对鲊辣椒品质的影响

表6 食盐添加量对鲊辣椒发酵的影响Table 6 Effect of salt content on chemical and sensory qualities of fermented chili pepper

由表6可知，随着食盐添加量的增加，pH值呈逐渐上升趋势、同时总酸含量呈逐渐降低的趋势。由于食盐添加量越多，对发酵菌的抑制作用越强，故其发酵产酸则越少。当食盐添加量为1%时总酸含量为1.42%，但是感官评分为85.67则较低；此时的盐添加量过少，鲊辣椒的咸度较低，口感上能接受，但不是较适合的口感。当食盐添加量为3%和5%时，感官评分均较高为89.42和89.03，此时的鲊辣椒咸度正适合于人们咸度喜好程度；而之后的食盐添加量为7%、8%和10%时的感官评分则更低。

2.2 鲊辣椒纯种发酵工艺条件的响应面优化试验

根据单因素试验结果，利用Design Expert软件采用Box-Behnken中心组合原理设计建立数学模型[19]。其试验设计及方案选取见表7。

2.2.1 纯种发酵条件对鲊辣椒总酸含量的影响

以鲊辣椒的总酸（Y1）为响应值，建立鲊辣椒发酵工艺参数回归模型。回归方程为：

表8 总酸含量的回归模型方差分析Table 8 Analysis of variance for the regression model for total acid content

对模型（1）进行方差分析。由表8可知，F模型=21.01，P＜0.000 1，表明模型（1）极显着，因变量与所考察自变量之间的线性关系显着（R2=0.943 9），模型调整复相关系数=0.898 9，说明该模型能解释90%以上响应值的变化，失拟项P=0.052 4＞0.05为不显着。离散系数表示实验的精确度，其值越小，实验结果的可靠性越高，本实验的离散系数为1.32%，在可接受范围内。由回归方程系数显着性检验可知，模型（1）的一次项（P＜0.01）影响极显着，二次项（P＜0.01）影响均极显着。这都说明模型拟合程度良好，试验误差小，该模型能够反映响应值的变化，即实验结果可靠，可以用此模型鲊辣椒发酵的总酸含量进行分析和预测。

2.2.2 纯种发酵条件对鲊辣椒氨基酸态氮含量的影响

以鲊辣椒发酵氨基酸态氮总量（Y2）为因变量，建立回归模型。回归方程为：

表9 辣椒氨基酸态氮含量二次响应模型方差分析Table 9 Analysis of variance for the quadratic response model for amino nitrogen content

以模型（2）回归模型进行方差分析。由表9可知，模型极显着（P＜0.000 1），因变量与所考察自变量之间的线性关系显着（R2=0.938 4），说明该模型能解释93.84%响应值的变化，失拟项不显着（P＞0.05）。离散系数为6.82%，在可接受范围内。复相关系数越大，表明要变量之间的线性相关程度越密切，该模型的调整复相关系数（=0.889 2）接近1，说明变量间的线性相关程度密切。综上所述，该试验结果可靠，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。

由回归方程系数显着性检验可知，模型（2）的一次项X1、X2、X3、X4影响均极显着（P＜0.01）；X5不显着（P=0.710 9＞0.05）。对一次项回归系数的绝对值大小进行比较，从F值可以看出对鲊辣椒氨基酸态氮含量的影响作用的大小顺序为：X1＞X2＞X4＞X3＞X5，即原料配比＞接种量＞发酵时间＞发酵温度＞食盐添加量。

2.2.3 纯种发酵条件对鲊辣椒感官评价的影响

以鲊辣椒发酵感官评分（Y3）为因变量，建立回归模型。回归方程为：

以模型（3）进行方差分析。由表10可知，模型（3）极显着（P＜0.000 1），因变量与所考察自变量之间的线性关系显着（R2=0.962 0），说明该模型能解释96.20%响应值的变化，失拟项不显着（P＞0.05）。离散系数（1.45%）在可接受范围内。该模型的调整复相关系数（=0.931 6）接近1，则变量间的线性相关程度密切。这都说明试验结果可靠，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。

由回归方程系数显着性检验可知，模型（3）的一次项和二次项（P＜0.01）影响均极显着；交互项（P＞0.05）影响均不显着。对一次项回归系数的绝对值大小进行比较可知，对鲊辣椒氨基酸态氮含量的影响作用的大小顺序为：X3＞X4＞X2＞X1＞X5，发酵温度＞接种量＞发酵时间＞原料配比＞食盐添加量。

2.3 验证实验

利用Design Expert 7.0软件处理后，优化得到各个因素的最优值分别为：m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1.02∶1、接种量5.37%、发酵温度31.84 ℃、发酵时间4.26 d、食盐添加量2.93%。为检验实验结果与真实情况的一致性，对上述优化条件进行验证实验。同时考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为：m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、接种量5.5%、发酵温度32 ℃、发酵时间4 d、食盐添加量3.0%。在此条件下进行3次平行实验，得到的实际值为：总酸含量（1.22±0.13）%、氨基酸态氮含量（0.281±0.041）%、感官评价（89.47±0.21）分。因此，该模型预测值与试验值之间的误差在3%以内，经响应面法优化所得的发酵最佳工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。

3 结 论

通过单因素试验和中心组合设计试验，采用响应面分析法优化鲊辣椒的纯种发酵工艺条件，得出优化工艺条件参数为：m（鲊辣椒）∶m（玉米粉）＝1∶1、接种量5.5%、发酵温度32 ℃、发酵时间4 d、食盐添加量3.0%。在此条件下鲊辣椒感官评分、总酸含量和氨基酸态氮含量分别为89.47、1.22%和0.28%。在本实验范围内建立的二次线性回归模型准确有效，试验的拟合性较好。在此条件下，发酵所得鲊辣椒成品色泽鲜艳，微酸微辣，风味浓郁。

[1]邵伟, 张亚, 雄熊泽, 等.传统鲊辣椒制作工艺改进[J].中国调味品,2001, 26(3): 22-25.

[2]吴祖芳, 刘璞, 翁佩芳.榨菜加工中乳酸菌技术的应用及研究进展[J].食品与发酵工业, 2005, 31(8): 73-76.

[3]COVENTRY M J, MUIRHEAD K, HICKEY M W.Partial characterisation of pediocin PO2and comparison with nisin for biopreservation of meat products[J].International Journal of Food Microbiology, 1995, 26(2): 133-145.

[4]NOMURA M, NAKAJIMA I, FUJITA Y, et al.Lactococcus lactiscontains only one glutamate decarboxylase gene[J].Microbiology,1999, 145(Pt1): 1375-1380.

[5]沈国华.纯菌接种发酵技术在腌渍蔬菜加工上的应用研究(一)[J].中国调味品, 2002, 27(3): 22-25.

[6]POLLMAN B.Transporters and their roles in LAB cell physiology[J].Antonie Van Leeuwenhoek, 2002, 82: 147-164.

[7]ALTERMANN E, RUSSELL W M, AZCARATE-PERIL M A, et al.Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacteriumLactobacillus acidophilusNCFM[J].PNAS, 2004, 102: 3906-3912.

[8]OUWEHAND A C, SALMINEN S, ISOLAURI E.Probiotics: an overiew of beneficial effects[J].Antonie Van Leeuwenhoek, 2002,82(l4): 279-289.

[9]SCHIFF E J, BLUM S.Food processing: probiotic microorganisms for beneficial foods[J].Current Opinion in Biotechnology, 2001, 12(5):499-502.

[10]丁筑红.发酵辣椒酱工艺及保藏研究[D].贵阳: 贵州大学, 2008.

[11]卢士玲, 吴桂春, 李开雄.发酵肉制品中乳酸菌的分离、筛选和鉴定[J].食品与生物技术学报, 2006, 25(3): 116-121.

[12]王立梅, 杜似娟, 郑丽雪, 等.响应面法优化高产虾青素菌株的发酵条件[J].食品科学, 2009, 30(21): 312-315.

[13]龚吉军, 唐静, 李忠海, 等.响应曲面法优化鲊鱼发酵条件[J].中国食品学报, 2010, 10(4): 219-226.

[14]葛焕生, 于新, 胡林子, 等.响应面法优化辣椒调味油微波制备工艺的研究[J].中国调味品, 2011, 36(1): 22-24.

[15]吴谋成.食品分析与感官评定[M].北京: 中国农业出版社, 2006:57-59.

[16]GB/T 12456—2008 食品中总酸的测定[S].

[17]GB/T 5009.40—2003 酱卫生标准的分析方法[S].

[18]邵伟, 张亚, 雄熊泽, 等.多菌种混合发酵生产鲊辣椒工艺初探[J].中国酿造, 2000, 19(1): 18-20.

[19]AHMADI M, VAHABZADEH F, BONAKDARPOUR B, et al.Application of the central composite design and response surface methodology to the advanced treatment of olive oil processing wastewater using fenton’s peroxidation[J].Journal of Hazardous Materials, 2005, 123(1/3): 187-195.