方 菲，陈惠敏，汪少芸*
鱼类为人类提供了丰富的优质蛋白[1]，但是在加工过程中会产生内脏、鱼皮、鱼鳞等废弃物，丢弃不仅浪费资源还会对环境造成污染。酶法水解作为蛋白回收的方法，被用于蓝鳍鲔头[2]、沙丁鱼内脏[3]，金枪鱼鱼骨[4]等鱼类加工废弃物中蛋白及多肽的制备。
美拉德反应是发生在蛋白质或多肽中游离氨基与还原糖羰基之间的反应，可有效提高蛋白、多肽的生物活性，Zeng Yan等[5]将金枪鱼鱼骨酶法水解物与不同己酮糖进行美拉德反应后，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活力大幅度提升，You Juan等[6]研究表明鲢鱼蛋白酶解物经美拉德反应后抗氧化活性显着提高，Yang等[7]研究表明将比目鱼副产物蛋白酶解物与核糖进行美拉德反应后可提高比目鱼蛋白酶解物对细胞的抗氧化活性，且呈剂量依赖性，Zha Fengchao等[8]研究报道，虾副产物蛋白水解物与葡萄糖美拉德反应产物对HepG2细胞的氧化应激损伤具有较强的抑制作用，且美拉德反应产物对损伤细胞表现出的抗氧化活性与自由基清除活性紧密相关。Sun Qian等[9]使用木糖（xylose，Xyl）修饰猪血红蛋白酶解液，表明其美拉德反应产物具有很好的自由基清除能力。此外，Yuan Debao[10]、周娅[11]等研究表明美拉德反应产物对香蕉中多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的酶促氧化褐变具有抑制作用。Brun等[12]研究报道谷胱甘肽与葡萄糖、果糖美拉德反应产物具有更强的PPO抑制活性，Tan等[13]研究发现组氨酸-葡萄糖模式美拉德反应产物能够抑制苹果PPO的活性，而目前关于鲷鱼鳞多肽美拉德反应研究鲜见报道，这为鲷鱼鳞蛋白肽美拉德反应及其美拉德反应产物抗氧化等活性的研究提供了新思路。
本研究以鲷鱼鳞为原料，通过酶解制备多肽，使用Xyl与鲷鱼鳞多肽（fish scales peptides，FSP）进行美拉德反应，并采用荧光光谱等技术对美拉德反应产物的结构进行分析，同时，研究了美拉德反应前后多肽抗氧化活性的变化及对美拉德反应产物PPO活性抑制机制作初步探究，旨在充分利用鱼鳞资源、变废为宝及生产多功能美拉德反应产物，进而提高鱼鳞多肽的附加值。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
鲷鱼鳞 福建省莆田汇丰食品有限公司；苹果永辉超市；Xyl 上海麦克林生化科技有限公司；PPO、邻苯二酚紫 上海叶源生物科技有限公司；DPPH、2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt radical，ABTS） 美国Sigma公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitro-benzenesulfonicacid，TNBS） 阿拉丁试剂有限公司；吡啶（分析纯） 西陇科学股份有限公司；其他试剂（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
QYSW-10A超纯水机 宝尔水处理有限公司；XZ21K高速冷冻离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TH2-82水浴恒温振荡摇床 金坛市鸿科仪器厂；FD-1C-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；UV-2600紫外-可见分光光度计、F-4600荧光光谱仪日本Hitachi公司；360 Intelligent傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Nicolet公司；DYCZ-24DN双垂直电泳仪 北京六一仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 FSP的制备
鲷鱼鳞经预处理后，使用碱性蛋白酶（1.1×105U/g）在酶添加量7.0%、50 ℃、pH 7.30条件下反应6 h后，灭酶，离心取上清液，冻干，即为FSP。
1.3.2 单因素试验
以DPPH自由基清除率、294 nm波长处的吸光度和420 nm波长处的吸光度为指标，分别探究反应时间、反应温度、初始pH值、Xyl与FSP质量比、Xyl与FSP总质量浓度对美拉德反应及DPPH自由基清除率的影响。
1.3.3 响应面试验
根据单因素试验结果，以DPPH自由基清除率为考察指标，根据Box-Behnken试验设计原理，选取反应时间、Xyl与FSP质量比、Xyl与FSP总质量浓度、初始pH值进行响应面优化，各因素与水平设计如表1所示，最终优化所得产物即鲷鱼鳞多肽美拉德反应产物（fish scales peptides-Maillard reaction products，FSP-MRPs）。
表1 响应面优化试验因素与水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface design
1.3.4 FSP-MRPs结构测定
1.3.4.1 荧光光谱分析
将FSP、FSP-MRPs、Xyl配成溶液，进行荧光光谱分析，参数设置为：激发波长347 nm，发射波长扫描范围300～700 nm，发射光与激发光缝宽10 nm，灵敏度2。
1.3.4.2 红外光谱分析
将FSP、FSP-MRPs、Xyl经溴化钾压片后进行红外光谱仪分析。仪器参数：扫描范围400～4 000 cm－1，仪器分辨率4 cm－1，扫描次数64。
1.3.4.3 游离氨基及接枝度测定
FSP、FSP-MRPs游离氨基含量及FSP-MRPs接枝度（grafting degree，DG）的测定，参照文献[14-15]方法，稍加改进。取0.25 mL浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的L-Leu溶液分别与2 mL PBS缓冲溶液（0.2 mol/L，pH 8.20）混匀，之后加入2 mL 0.1% TNBS溶液，于50 ℃避光反应1 h，之后加4 mL 0.1 mol/L HCl溶液终止反应，冷却后于340 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。使用FSP、FSP-MRPs替代L-Leu溶液，将所得吸光度代入标准曲线，即可得游离氨基的含量（以L-Leu计）。DG按公式（1）计算：
式中：A0为反应前样品的吸光度；A1为反应后样品的吸光度。
1.3.4.4 电泳分析测定
采用N-三（羟甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（N-3(hydroxymethyl) methylglycinedodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）方法，并采用12.5% Tris-HCl凝胶对鱼鳞明胶、FSP、FSP-MRPs进行电泳，电泳结束后使用过碘酸Schiff碱进行染色分析[16-17]。
1.3.5 FSP-MRPs抗氧化活性测定
1.3.5.1 DPPH自由基清除活性
FSP、FSP与Xyl混合物（FSP-Xyl）及FSP-MRPs DPPH自由基清除活性的测定参照Wu Hanchun等[18]的方法。不同浓度样品与0.1 mmol/L DPPH溶液（95%乙醇溶解）等体积混匀，避光反应0.5 h后，于517 nm波长处测定吸光度；将95%乙醇溶液代替DPPH溶液作为参比组；空白组为DPPH与95%乙醇溶液等体积混合。样品DPPH自由基清除率计算如公式（2）：
式中：Ai为样品组吸光度；Aj为参比组吸光度；A0为空白组吸光度。
1.3.5.2 ABTS＋·清除活性
FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs ABTS＋·清除活力的测定参照Wang Bin等[19]的方法。临用前将7 mmol/L ABTS贮存母液与2.45 mmol/L K2S2O8溶液等体积混合，暗处放置16 h，之后用5 mmol/L、pH 7.4的PBS缓冲液稀释至734 nm波长处吸光度为0.70±0.02，即ABTS溶液。ABTS溶液与不同浓度的样品等体积混合，室温下反应10 min，测定734 nm波长处的吸光度，用蒸馏水代替样品为空白组，用PBS缓冲液（5 mmol/L、pH 7.4）调零。样品ABTS＋·清除率计算如公式（3）：
式中：A0为空白组吸光度；A1为样品组吸光度。
1.3.5.3 羟自由基清除活性
FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs羟自由基清除活性的测定参照Zhang Yufeng等[20]的方法。1 mL样品与0.3 mL 8 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 3 mmol/L水杨酸以0.25 mL 20 mmol/L H2O2溶液混匀，于37 ℃保温0.5 h后，流水冷却，加入0.45 mL蒸馏水，3 000×g离心10 min，测定510 nm波长处的吸光度，将蒸馏水代替样品作为空白对照。羟自由基清除率按照公式（4）进行计算：
式中：A0为空白组吸光度；A1为样品组吸光度。
1.3.5.4 还原力
FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs还原力的测定参照Gülcin等[21]的方法。1 mL样品与2.5 mL PBS缓冲液（0.2 mol/L、pH 6.6）、2.5 mL 1% K3(Fe(CN)6)溶液混合，于50 ℃保温20 min，之后加入2.5 mL 10% TCA溶液，混匀，3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL加入2.5 mL蒸馏水及0.5 mL 1% FeCl3溶液，室温静置10 min后，测定700 nm波长处的吸光度。空白组用1 mL蒸馏水代替样品。
1.3.6 FSP-MRPs PPO抑制活性与机制分析
1.3.6.1 PPO抑制活性测定
FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs对PPO活性的抑制参照Benjamin等[22]的方法并稍加改进，取1.5 mL PBS缓冲液（0.2 mol/L、pH 6.8）于30 ℃保温10 min，加入0.5 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，0.5 mL PPO，混匀后测定420 nm波长处的吸光度。以PPO加入后开始计时，每10 s记录一次吸光度，以最初直线部分斜率计算酶活力。一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟吸光度变化0.001所需的酶量。以PBS缓冲液条件下测得的酶活力为100%，其他缓冲溶液条件下的为相对残余活力。酶活力按照公式（5）计算：
式中：Vr为加缓冲液后总体积/mL；Vs为PPO取用体积/mL；t为反应时间/min；ΔA为吸光度变化值。
1.3.6.2 苹果切片褐变测试
将苹果切片后，于质量浓度为1.0、3.0、5.0、10.0 mg/mL的FSP-MRPs样品溶液中浸没1 min，分别于0.5、1、1.5、2、3、5 h时视觉观察色泽变化并拍摄记录。
1.3.6.3 Cu2＋螯合能力测定
FSP-MRPs Cu2＋螯合能力测定，参照文献[23]的方法，并稍加改进。将1 mL CuSO4溶液（2 mmol/L）与1 mL吡啶振荡混匀后，加入0.1 mL 0.1%的邻苯二酚紫溶液，随后取1 mL FSP-MRPs样品溶液，加入上述混合溶液中，充分混匀，室温静置10 min，测定632 nm波长处的吸光度，记为AS。以去离子水代替FSP-MRPs样品作为对照，在相同操作条件下测定其632 nm波长处的吸光度，记为AC，则FSP-MRPs对Cu2＋螯合能力如公式（6）：
式中：AC为对照组吸光度；AS为样品组吸光度。
1.3.6.4 FSP-MRPs Cu2＋荧光分析
在3 mL FSP-MRPs溶液中分别加入0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μmol Cu2＋进行荧光光谱分析。
1.3.6.5 不同浓度Cu2＋对FSP-MRPs抗氧化活性影响
将FSP-MRPs溶于不同浓度的Cu2＋溶液中，测定FSPMRP抗氧化活性的变化。
1.4 数据分析
使用Office 2007、Design-Expert 8.0.6、SPSS、Origin 8.5.1等软件处理数据，各组实验结果为3 次平行实验的平均值，数值用 ±s表示，以P值小于0.05为统计学意义上的显着差异。
2 结果与分析
2.1 FSP-MRPs优化试验结果
2.1.1 单因素试验结果
美拉德反应过程中糖的裂解会形成酮类、醛类等无色非荧光的小分子中间产物，这些物质在294 nm波长处有紫外吸收，其高低代表美拉德反应中间产物量的多少，而420 nm波长处吸光度可用来表示美拉德反应的褐变程度及终产物的形成，各因素对美拉德反应及DPPH自由基清除活性的影响，如图1所示。
图1 反应时间（a）、Xyl与FSP质量比（b）、Xyl与FSP总质量浓度（c）、初始pH值（d）与反应温度（e）对美拉德反应及DPPH自由基清除率的影响Fig. 1 Effects of reaction time (a), mass ratio of Xyl to FSP (b), total concentration of Xyl and FSP (c), initial pH (d) and temperature (e) on DPPH radical scavenging capacity and absorbance (A294nm and A420nm)
由图1a可知，随着反应时间的延长，吸光度与DPPH自由基清除活性逐渐上升，在4.0 h后趋近于平缓；而Xyl与FSP质量比对吸光度与DPPH自由基清除活性的影响均呈现先上升后降低的趋势（图1b），在Xyl与FSP质量比为1∶1时DPPH自由基清除率最大；随着Xyl与FSP总质量浓度的增加，DPPH自由基清除率与吸光度均增加，在质量浓度90 mg/mL时，趋近于平缓（图1c）；美拉德反应历程因反应pH值不同有所差异，pH值为11、12时DPPH自由基清除活性与吸光度均大幅度增加（图1d），表明较高初始pH值条件有利于美拉德反应的进行；由图1e可知，反应温度为90 ℃时吸光度与DPPH自由基清除活性影响急剧上升，100 ℃后趋于平缓，表明高温条件有利于美拉德反应的进行。
2.1.2 响应面优化试验分析
以DPPH自由基清除率为响应值，进行四因素三水平的响应面试验，结果如表2所示，对试验数据进行回归模型的方差分析，所得结果如表3所示，经分析得DPPH自由基清除率与反应时间、Xyl与FSP质量比、Xyl与FSP总质量浓度、初始pH值的四元二次回归方程为：DPPH自由基清除率/%=68.67＋8.57A＋2.77B＋4.12C＋16.96D＋1.13AB＋1.37AC-1.84AD＋0.97BC－8.09BD＋1.91CD－3.83A2－12.10B2－2.62C2＋3.90D2。由表3可知，此回归模型P值小于0.000 1，为极显着，失拟项（P=0.099＞0.05）不显着，即表明此模型的拟合度较好，且一次项A、C和D，交互项BD、二次项B2对DPPH自由基清除率的影响极显着，一次项B、二次项A2、D2对DPPH自由基清除率的影响较显着，二次项C2对DPPH自由基清除率的影响显着，表明各因素对DPPH自由基清除率的影响不是简单的线性相关。
通过回归模型分析预测得FSP-MRPs的制备工艺参数为：反应时间4.05 h、Xyl与FSP质量比1.3∶1、Xyl与FSP总质量浓度77.19 mg/mL、初始pH 11.85，预测的DPPH自由基清除率为88.65%。为实际操作方便将参数调整为反应时间4.05 h、Xyl与FSP质量比1.3∶1、Xyl与FSP总质量浓度78 mg/mL、初始pH 11.85，进行3 次平行实验，得FSP-MRPs的DPPH自由基清除率为（88.55±1.12）%，与预测值接近，证明所建立模型的可靠性及响应面优化对所制备FSP-MRPs的DPPH自由基清除率的预测具有可行性。
表2 响应面优化试验设计与结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model
2.2 FSP-MRPs结构分析
2.2.1 荧光光谱分析
图2 荧光光谱分析图Fig. 2 Fluorescence spectra
由图2可知，FSP、FSP-Xyl在347 nm波长处有荧光强度，而FSP经美拉德反应后347 nm波长处的荧光消失，并伴随着420～430 nm波长处荧光强度的增加，这与文献[24]报道的多肽-Xyl体系美拉德反应的结果相似，即表明FSP与Xyl发生美拉德反应后，肽链结构发生变化，并伴随活性中间体产物形成及醛糖氨基的Strecker降解。
2.2.2 红外光谱分析
FSP、FSP-MRPs、Xyl红外光谱分析如图3所示，Xyl的红外光谱图在1 200～760 cm－1处出现很多振动吸收峰，即所谓的指纹图谱区，这归因于C—C、C—O键的伸缩振动以及C—H键的弯曲振动。与FSP发生美拉德反应后，大部分吸收峰消失，而FSP-MRPs在1 200～1 050 cm－1处的吸收峰增强，表明FSP与Xyl发生了共价交联。1 420～1 360 cm－1处为C—N键的伸缩振动吸收峰，1 690～1 600 cm－1处则为酰胺I带C＝O键的伸缩振动吸收峰，3 400 cm－1附近为O—H键的伸缩振动吸收峰，经美拉德反应后吸收峰强度变大，与美拉德反应过程中Schiff碱（C—N）、吡嗪（C—N）、Amadori重排产物（C＝O）等化合物的形成有关[25]，并与文献[8]报道的结果相似，表明FSP与Xyl经美拉德反应后肽链结构发生变化。
图3 红外光谱图Fig. 3 FT-IR spectra
2.2.3 Tricine-SDS-PAGE过碘酸Schiff碱染色
图4 Tricine-SDS-PAGE图Fig. 4 Tricine-SDS-PAGE patterns
由图4可知，在泳道I上，明胶大部分堆积在中间胶上，且表现出较深的洋红色条带，这是因为鱼鳞富含胶原蛋白，而胶原蛋白是糖蛋白且分子质量较大，因而其变性形成的明胶可能也含有糖链，且分子质量较大、分布范围较广，因而展现出洋红色条带。泳道II上无条带显示，这可能是由于明胶经酶解后生成了分子质量较小的多肽片段，较快穿过凝胶而不被截留。FSP经美拉德后，在泳道I、IV上展现出了颜色较淡的洋红色条带。此外，FSP经美拉德反应后游离氨基含量由0.87 mmol/L降低到0.41 mmol/L，这是由Schiff碱及美拉德反应高级阶段Heyns化合物降解共同作用的结果[26-27]。另外，FSPMRPs接枝度为52.97%，综合表明FSP与Xyl发生了共价交联，生成了糖肽聚合物，分子质量变大。
2.3 抗氧化分析
赵谋明等[28]研究表明草鱼肽经美拉德反应后还原力及羟自由基清除能力加强。FSP、混合物FSP-Xyl、FSPMRPs自由基清除能力及还原力如图5所示。
图5 FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs抗氧化活性Fig. 5 Antioxidant activities of FSP, FSP-Xyl and FSP-MRPs
由图5a可知，FSP的DPPH自由基清除活性较弱，IC50为2.33 mg/mL（数据未在图中体现），经美拉德反应后DPPH自由基清除活性大大提高（P＜0.05），FSP-MRPs的IC50为125.32 µg/mL，即半数抑制活性提高了17.59 倍，表明FSP-MRPs可通过提供氢原子方式与DPPH自由基结合，形成DPPH-H分子[29]，提高DPPH自由基的清除活性。ABTS法检测物质的抗氧化性是通过电子或氢原子转移来还原、猝灭自由基这两种机制进行的[30]，FSP-MRPs、FSP及FSP-Xyl对ABTS＋·清除均呈剂量依赖性，FSP经美拉德反应后，ABTS＋·清除活性提高（P＜0.05），其IC50由100.69 µg/mL降低至33.53 µg/mL，半数抑制活性为FSP的3.0 倍（图5b）。此外，FSP经美拉德反应后，羟自由基清除活性增强，其IC50由4.27 mg/mL降到2.41 mg/mL（图5c）。这些结果表明，美拉德反应可提高FSP的自由基清除能力（P＜0.05），FSP-MRPs具有较强自由基清除活性。还原力作为物质抗氧化能力的评价方法，吸光度越大则抗氧化能力越强，FSP-MRPs的还原力均大于FSP与FSP-Xyl，在1.5 mg/mL时，FSP-MRP还原力吸光度分别为FSP和FSPXyl的5.58、17.71 倍（图5d），这是因为美拉德反应初期Amadori降解产物、杂环类化合物以及类黑精中的吡咯铜和吡啶酮部分的羟基，能够供体电子阻断自由基介导的链式反应[31]，因而表现出较强的抗氧化性，可作为一种还原剂。
2.4 美拉德反应产物PPO抑制活性与机制分析
2.4.1 PPO抑制活性
图6 PPO抑制活性Fig. 6 PPO inhibitory activity of FSP-MRPs
FSP、FSP-Xyl及FSP-MRPs对PPO抑制活性结果如图6所示，FSP-MRPs质量浓度为1 mg/mL时，PPO的相对残余活力为41.99%，即表明有58.01%的酶活性受到抑制，而相同质量浓度的FSP对PPO活性的抑制较FSPMRPs低，表明FSP经美拉德反应后，PPO抑制作用增强，IC50为0.54 mg/mL。Brun等[12]认为MRPs具有PPO抑制活性部分归因于产物的Cu2＋螯合特性，同时，MRPs可修饰PPO或TYR活性中心附近的组氨酸残基，影响酶构象及结构的完整性，从而变成失活的蛋白，另外，MRPs具有螯合、还原和消除氧的特性。因而，FSPMRPs可能是通过消除活性氧、与PPO活性中心的Cu2＋结合及修饰活性中心附近的组氨酸残基，使得PPO部分活性丧失。
2.4.2 苹果切片褐变结果
由图7可知，对照组在0.5 h内发生急剧褐变，但在随后褐变时间内，褐变程度增加缓慢，总体上表现为切片表皮颜色暗黄无光泽。而FSP-MRPs处理组中，苹果切片的色泽保护程度因FSP-MRPs质量浓度不同略有不同，1 mg/mL与3 mg/mL的FSP-MRPs处理组，苹果切片褐变抑制能力较弱，3 h后褐变较明显，但颜色仍优于对照组，FSP-MRPs质量浓度为5 mg/mL和10 mg/mL时，苹果切片保持着一定的亮黄色，褐变程度较微弱，表明FSPMRPs能够延缓苹果褐变，也有相关研究报道组氨酸-葡萄糖模式美拉德反应所得MRPs对苹果PPO的活性具有抑制作用且随加热时间延长而增强[13]，此外，Yuan Debao等[10]也表明MRPs能够降低香蕉切片的酶促氧化褐变，因而，FSP-MRPs延缓苹果褐变可能是通过降低PPO的酶促氧化，这为果蔬加工护色研究提供了新的思路。
2.4.3 FSP-MRPs Cu2＋螯合能力分析
Rendleman等[32]表明MRPs是良好的金属离子螯合剂，可通过释放2 个氢原子和消耗氧原子将Cu2＋还原，形成配合物。张晓溪等[33]表明果糖与氨基酸的MRPs具有螯合Cu2＋、Fe2＋的特性。FSP-MRPs对Cu2＋的螯合特性如图8所示。
图8 FSP-MRPs的Cu2＋螯合（a）及荧光光谱分析（b）Fig. 8 Cu2+ chelating activity of FSP-MRPs (a) and fluorescence spectra of FSP-MRPs in the presence of Cu2+ (b)
由图8a可知，随着FSP-MRPs质量浓度增加，Cu2＋螯合能力增强，表明FSP-MRPs具有Cu2＋螯合能力，这可能是因为FSP经美拉德反应后产生的类黑精、还原酮以及杂环化合物具有螯合金属离子的特性。为进一步探究FSPMRPs与Cu2＋的相互作用，采用荧光光谱扫描分析以探究其螯合机制（图8b），随着Cu2＋浓度增加，FSP-MRPs荧光强度逐渐降低，从757.625下降到294.926，其中Cu2＋添加量为2 μmol时，荧光强度降低幅度最明显，这可能是因为Cu2＋的加入使得FSP-MRPs发生折叠和结构的修饰。表明Cu2＋能使FSP-MRPs的荧光发生猝灭，能够形成FSPMRPs-Cu螯合物。
2.4.4 螯合位点猜测
表4 不同浓度的Cu2＋对FSP-MRPs抗氧化活性的影响Table 4 Effect of Cu2+ concentration on the antioxidant activities of FSP-MRPs
由表4可知，在不同浓度的Cu2＋环境中，FSPMRPs的DPPH自由基、羟自由基和还原力降低显着（P＜0.05），这与文献[34-35]报道的结果相似，其中，还原力下降幅度最明显，而DPPH自由基与羟自由基清除能力下降幅度较小，Cu2＋可能是通过与FSP-MRPs中供电子基团或供氢体发生相互作用进行螯合，这些螯合位点与表现出自由基清除能力以及还原力的基团有关。
3 结 论
反应时间、初始pH值、反应温度等因素对FSP 美拉德反应影响显着。延长反应时间、提高初始pH值及反应温度，有利于美拉德反应进行及活性中间产物的形成。FSP经美拉德反应后形成共价交联，肽链结构发生变化，生成糖肽聚合物。FSP经美拉德反应后自由基清除能力及还原力均显着提高（P＜0.05），具有较强的抗氧化活性，呈剂量依赖性。在反应时间4.05 h、Xyl与FSP质量比1.3∶1、Xyl与FSP总质量浓度78 mg/mL、初始pH 11.85、反应温度100 ℃条件下所得的FSP-MRPs具有较强的PPO抑制活性，能够抑制苹果褐变，可能是由于FSP-MRPs具有Cu2＋螯合特性，螯合位点与抗氧化基团有关。
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