佛手皮渣果胶改性及其对镉诱导肝肾损伤的预防作用

吴莎极，寇兴然，丁寅翼，王洪新*

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏 无锡 214122 ）

镉（cadmium，Cd）是一种对人体健康非常有害的重金属，具有很高的“土壤-植物迁移转化率”，能够从土壤向稻米、花生、向日葵、烟草等多种作物中迁移，并大量蓄积，从而进入食物链，影响食品安全，进一步影响人体健康[1]。近十年来，针对北京、上海、江苏、浙江、福建、广州等地的食品抽查结果显示，含镉食品检出率超过50%，超标率达到7.3%。镉污染的主要食品包括大米、蔬菜、食用菌、动物内脏、水产品等[2]。镉进入人体的主要渠道是消化道和呼吸道，对于非职业接触镉及无吸烟习惯的普通人群来说，镉的暴露途径主要为膳食渠道[3]，即镉通过食物摄入被消化道吸收，进入血液，继而在各个组织器官中长时间积蓄[2]，其中，主要的靶点器官为肝脏和肾脏[4]。镉引起急性中毒症状包括咳嗽、胸闷、呼吸困难、恶心、腹痛，以及急性肝脏损伤导致死亡[5-6]。慢性中毒症状包括肾脏和肝脏的损伤、生殖器官损伤、心血管疾病以及癌症等[7-8]。由于静脉注射螯合剂药物防止镉中毒的方法存在毒副作用和有效性较低等缺陷[9-10]，目前，相关研究主要采用营养干预或膳食疗法，包括补充微量元素[11]、植物提取物[12-13]等。

佛手是一种广泛种植于东方国家的植物，属于芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）。长期以来，佛手一直被作为一种中医药物用于治疗高血压、呼吸道感染等慢性疾病。现在食品工业关注对佛手相关食品的研发，将佛手作为功能性食品原料加以利用，例如佛手果脯、佛手发酵酒、佛手饮料、佛手保健茶、佛手酥等[14]。但是，传统的佛手食品加工工艺首先会去除佛手果皮，因此会产生大量未被利用的皮渣，丢弃后造成严重的环境问题。研究发现，佛手皮渣中含有多种具有生理活性的功能性物质，例如精油、黄酮、果胶等。其中，果胶的质量占干质量的15%～25%[15]。因此，提取佛手皮渣中的果胶物质，既能缓解佛手皮渣对环境造成的影响，还能大大提高佛手的综合利用价值。

果胶是一类植物性多糖物质，由超过100 个（α-1,4）相连的α-D-半乳糖醛酸残基组成[16]。目前，果胶被主要用作生物清除剂。Khotimchenko等[17]研究发现，果胶具有很强的重金属离子吸附力，能够清除人体血液中的重金属离子。果胶能够有效吸附土壤和水环境中的重金属污染，例如铅、铜、汞等[18]。然而，将果胶作为食品添加剂，用于缓解食品中镉超标对人体损害的研究还非常少。因此，进一步研究佛手皮渣中果胶的提取具有很高的应用价值和发展前景。目前，提取果胶的方法包括微生物提取法、酸提法、酶提法、微波提取法等[19-20]。与这些传统方法相比，超声辅助提取法具有高频特性，且有加热速度快、加热均匀、易控制、节能环保等优点[21]。本实验在酸提的基础上，使用超声辅助的方法获得佛手皮渣果胶。然后通过调节pH值方法对获得的佛手进行改性，获得低酯化度果胶，并对其镉的吸附能力及吸附性质进行分析。然后，通过动物模型探究佛手皮渣果胶对镉引起的肝肾损伤的预防作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

成年雄性ICR小鼠及SD大鼠，体质量（30±2）g，购于上海斯莱克动物实验有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2007-0005。

佛手原料由浙江省金华市金手宝有限公司提供。

苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GPx）试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）试剂盒、谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）试剂盒、总胆红素试剂盒、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）试剂盒、尿素氮试剂盒、肌酐试剂盒、尿蛋白试剂盒南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度试剂盒 碧云天生物技术公司。本实验所用试剂均为优级纯。

1.2 仪器与设备

UV-2100紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；SHZ-III循环水式真空泵 上海姜强仪器有限公司；FW80高速粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；SCIENTZ-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；原子吸收分光光度计 美国瓦里安公司；Epoch微孔板分光光度计 美国BioTek公司；台式高速冷冻离心机5804R 德国Eppendorf公司；超低温冷冻冰箱、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）仪 美国Thermo Fisher公司；电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma source mass spectrometer，ICP-MS）仪 美国PerkinElmer公司；Ussing Chamber体外吸收模拟系统 上海赞德仪器有限公司；石蜡切片机 德国Leica公司；小鼠代谢笼江苏赛昂司生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 佛手皮渣的预处理与提取

将佛手皮刮下，佛手皮渣质量约占佛手总质量的8.22%。参考毕双同[22]的方法对佛手原料进行预处理及灭酶：将佛手皮渣用无水乙醇回流（100 ℃，15 min）灭酶，再用体积分数70%乙醇溶液回流（85 ℃，1 h），重复3 次，去除小分子糖，过滤，用体积分数70%乙醇溶液洗涤沉淀，直至上清液中不再发生糖的Molish反应为止，将样品在55 ℃下鼓风干燥，粉碎，用60 目筛子过筛，干燥备用，测定水分含量。

参照邓刚等[23]的方法，使用超声辅助酸提法从预处理后的佛手皮渣粉中提取果胶，提取条件如下：使用盐酸作为提取酸，料液比为1∶60，提取温度为70 ℃，超声功率为350 W，pH 1.5。将上述条件下获得的果胶提取液通过真空旋转蒸发浓缩，然后加入体积分数95%乙醇溶液，于4 ℃冰箱中静置12 h，将沉淀包裹在滤布中，挤掉乙醇，并用无水乙醇洗涤沉淀。最后将沉淀置于真空冷冻干燥机中干燥后称量。最后果胶的得率为22.7%。

1.3.2 果胶含量的测定

参照NY/T 2016—2011《水果及其制品中果胶含量的测定 分光光度法》测定果胶含量。用咔唑比色法制作半乳糖醛酸标准曲线，以半乳糖醛酸的含量计果胶含量。果胶含量按式（1）计算。

式中：ω为实验样品中的果胶质量分数（以半乳糖醛酸计）/%；ρ为根据标准曲线得到的半乳糖醛酸质量浓度/（μg/mL）；V为果胶浸提液的总体积/mL；N为浸提液的稀释倍数；m为样品的质量/g。

1.3.3 果胶改性

根据Wai等[24]的方法，通过改变pH值和温度对本研究提取的佛手皮渣果胶（finger citron peel residue pectin，FCP）进行改性。改性目的是降低果胶酯化度，增加游离羧基数量，从而提高果胶的重金属吸附能力。主要步骤如下：将果胶用蒸馏水配制成质量分数1.5%的溶液。然后使用NaOH将溶液的pH值调整至10.0，在60 ℃下孵育1 h。溶液冷却至室温后，用HCl调节pH值至3.0，90 ℃振荡10 h。然后加入体积分数95%乙醇溶液，并在4 ℃下放置过夜。过滤获得沉淀，用体积分数95%乙醇溶液洗涤沉淀。将获得的果胶置于真空冷冻干燥机中干燥，并研磨。所获得的果胶即为改性佛手皮渣果胶（modified fi nger citron peel residue pectin，mFCP）。

1.3.4 果胶酯化度检测

根据Wai等[24]的方法使用FT-IR对果胶中的游离羧基进行分析。果胶酯化度测定方法参照GB 25533—2010《食品安全国家标准 食品添加剂 果胶》，采用高甲氧基果胶的碱液滴定法。果胶酯化度按式（2）计算。

式中：Y为果胶酯化度/%；V1为初始滴定时消耗的0.1 mol/L NaOH标准滴定溶液的体积/mL（初始滴定度）；V2为皂化滴定时消耗的0.1 mol/L NaOH标准滴定溶液的体积/mL（皂化滴定度）。

1.3.5 果胶吸附镉的吸附热力学和动力学特性

参考Kartel[25]和Senthikumaar[26]等的方法研究果胶吸附镉的热力学和动力学特性。

1.3.5.1 吸附热力学解析

将mFCP以1∶100（m/V）比例溶于0.06～90 mg/L CdCl2溶液中，37 ℃匀速搅拌至吸附平衡，抽滤获得滤液，用原子吸收光谱法测定滤液和原液中镉的含量，并按式（3）计算果胶吸附量。

式中：ω为果胶吸附量/（mg/g）；ρi为吸附初始镉质量浓度/（mg/L）；ρe为吸附平衡时镉质量浓度/（mg/L）；V为反应液体积/L；m为体系中果胶质量/g。

1.3.5.2 吸附动力学解析

将佛手皮渣果胶以1∶100（m/V）比例溶于10 mg/L CdCl2溶液中，37 ℃匀速搅拌，分别在2.5、5、7.5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240、270、300 min时取样测定吸附后溶液，抽滤获得滤液，用原子吸收光谱法测定滤液和原液中镉的含量，并计算吸附量。果胶吸附量按式（4）计算。

式中：ω为果胶吸附量/（mg/g）；ρ0为吸附初始镉质量浓度/（mg/L）；ρ1为吸附后镉质量浓度/（mg/L）；V为反应液体积/L；m为体系中果胶质量/g。

1.3.6 动物实验设计

60 只成年雄性ICR小鼠饲养于江南大学实验动物中心，饲养环境中无致病菌，光暗周期为12 h，室温控制（24±2）℃，相对湿度55%～65%。小鼠饲料为标准颗粒饲料，自由饮用纯净水。动物实验流程经江南大学实验动物伦理委员会许可，所有操作均参考欧盟关于动物实验的指导条例。

1.3.6.1 实验分组

ICR小鼠预饲一周后，随机分为6 组（n＝10），每组平均体质量保持一致：1）正常对照组（CON组）：每天灌胃生理盐水；2）镉暴露组（Cd组）：每天灌胃CdCl2溶液，灌胃量为0.25 mg/kg mb；3）低剂量FCP干预组（Cd+FCP1组）：每天灌胃FCP，灌胃量为0.5 mg/kg mb，30 min后灌胃CdCl2溶液，灌胃量为0.25 mg/kg mb；4）高剂量FCP干预组（Cd+FCP2组）：每天灌胃FCP，灌胃量为1 mg/kg mb，30 min后灌胃CdCl2溶液，灌胃量为0.25 mg/kg mb；5）低剂量mFCP干预组（Cd+mFCP1组）：每天灌胃mFCP，灌胃量为0.5 mg/kg mb，30 min后灌胃CdCl2溶液，灌胃量为0.25 mg/kg mb；6）高剂量mFCP干预组（Cd+mFCP2组）：每天灌胃mFCP，灌胃量为1 mg/kg mb，30 min后灌胃CdCl2溶液，灌胃量为0.25 mg/kg mb。

灌胃20 d后，将小鼠置于代谢笼内24 h，收集小鼠尿液和粪便用于镉含量分析。最后，用乙醚麻醉小鼠，摘眼球取血，断颈处死小鼠。肝脏、肾脏用于脏器指数分析、形态学分析、组织镉含量分析、抗氧化指标测定。脏器指数按式（5）计算。

1.3.6.2 血浆、肝脏、肾脏抗氧化能力指标测定

小鼠眼球取血，血液收集于肝素钠抗凝管，将全血3 500 r/min、4 ℃离心获得血浆。取一定量的肝脏和肾脏，用生理盐水制成质量分数10%的匀浆液，3 000 r/min离心10 min，取上清液。按照试剂盒说明书测定小鼠血浆T-AOC，肝脏和肾脏SOD、CAT、GPx活力，以及NO和MDA的水平。

1.3.6.3 肝肾功能指标的测定。

取小鼠血浆，按照试剂盒说明书测定血浆中AST、ALT、总胆红素、γ-GT、尿素氮、肌酐水平，以及尿液中蛋白质量浓度。

1.3.6.4 肝脏肾脏形态学分析

小鼠肝脏和肾脏用体积分数10%多聚甲醛磷酸缓冲液固定，经乙醇梯度脱水，用石蜡包埋机进行石蜡包埋。在石蜡切片机上制成厚度为5 μm的连续切片。根据HE染液试剂盒说明书方法进行HE染色。光学显微镜下观察组织形态并拍照。

1.3.7 小鼠血液、尿液、粪便、组织中镉含量的测定

将一定量的粪便、肝脏、肾脏、尿液、血液样品转移至消化罐内，并记录样品的质量或体积。加入适量硝酸，在微波消解系统中进行消化。然后使用ICP-MS系统检测镉的含量。

1.3.8 FCP和mFCP的Ussing-Chamber体外模拟吸收实验设计

配制好新鲜的Krebs-Ringer缓冲液（含有118 mmol/L NaCl、4.75 mmol/L KCl、1.18 mmol/L KH2PO4、1.18 mmol/L MgSO4、2.5 mmol/L CaCl2、25 mmol/L NaHCO3和11 mmol/L葡萄糖）[27]，通入混合气体（95% O2和5% CO2）15 min。分离SD大鼠空肠置于Krebs-Ringer缓冲液中冰浴培养5 min。剪取4 cm左右的空肠，迅速分离筋膜层，将肠黏膜固定在Ussing-Chamber的扩散池上。将0.5 g/100 mL和1 g/100 mL两种不同质量浓度的FCP和mFCP溶液（用Krebs-Ringer缓冲液配制）与Krebs-Ringer缓冲液预热至37 ℃，通入混合气体（95% O2和5% CO2），整个系统保持在37 ℃恒温。向黏膜侧分别加入5 mL生理盐水和配制好的FCP、mFCP溶液，浆膜侧加入相同体积的Krebs-Ringer缓冲液。分别于0、30、60、90、120 min在浆膜侧取样100 μL。并补充100 μL预热的Krebs-Ringer缓冲液。检测浆膜侧溶液中果胶的含量，检测方法同1.3.2节。

1.4 数据统计分析

所有测定数据均采用平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，组间比较采用t检验，双侧检验，P＜0.05时表示存在显着差异，P＜0.01时表示存在极显着差异。用Origin Pro 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 FCP和mFCP酯化度比较

本实验未改性的FCP的酯化度为78.3%～81.5%，属于高酯化度果胶，而mFCP酯化度为35.4%～45.6%，属于低酯化度果胶[28]。

图1 mFCP和FCP的FT-IR光谱结果Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of mFCP and FCP

1 760～1 730 cm-1和1 630～1 600 cm-1条带分别表示酯羰基和羧基的振动条带。由图1可知，FCP的酯羰基条带的强度明显高于羧基条带的强度。相反，mFCP的羧基条带强度明显高于酯羰基条带的强度。结合酯化度结果，本研究通过酸碱改性手段，降低了佛手皮渣果胶的酯化度，让更多的游离羧基暴露出来，而游离羧基则被认为是果胶吸附重金属的主要位点[23]。

2.2 mFCP对镉离子的吸附热力学分析

图2 mFCP对镉的平衡吸附等温线Fig. 2 Adsorption isotherm of cadmium binding by mFCP

为分析mFCP吸附镉的热力学性质，选取不同初始质量浓度下的CdCl2溶液进行吸附实验，获得平衡吸附量和平衡溶液质量浓度之间的平衡吸附等温线。由图2可见，在较低的初始质量浓度下，果胶表面具有较多的镉离子结合位点，吸附效率比较高，吸附能力随着初始镉质量浓度的增加而增加，直到平衡。通过不同的模型对获得的吸附等温线进行拟合，各模型参数值见表1。由3 个模型相关系数R2可知，Langmuir-Freundilich双模型具有最佳的拟合优度（R2＝0.994 2），可以更好地描述果胶对镉离子的吸附过程。另外，Langmuir模型和Freundlich模型的相关系数分别为0.983 8和0.973 6，也有较高的吻合度。

表1 各等温线模型及相关吸附常数Table 1 Adsorption constants derived from simulations with different isotherm models

Langmuir模型是假设吸附剂表面均匀，各处吸附能相同，且吸附过程为单分子层吸附的模型。当吸附剂表面被吸附对象占位饱和时，吸附量达到最大值，该过程对应物理吸附过程[29]。该模型方程各参数中，Qmax表示吸附剂的最大吸附容量，本实验果胶对镉的理论最大吸附量为981.54 mg/g，实际最大吸附量为985.36 mg/g，比较相近。bL表示吸附系数，是吸附速率常数和脱吸附速率常数的比值，表示吸附对象和吸附剂之间的亲和强度[30]。本研究中吸附热力学曲线与Langmuir吸附模型有一定吻合度，说明mFCP对镉的吸附过程涉及表面物理性吸附。Freundlich模型是假设吸附剂表面不均匀，吸附热随着覆盖度的增加而呈现指数下降，适用于化学吸附和物理吸附等多种情况[31]。该模型方程中，KF表示吸附剂的吸附能力，nF是Freundlich平衡参数，代表吸附强度。当0.1＜1/nF＜0.5时，吸附强度较大；当0.5＜1/nF＜1时，吸附强度较差；而当1/nF≥1时，吸附强度最弱[32]。本研究获得的mFCP对镉离子的吸附满足0.1＜1/nF＜0.5（1/nF＝0.434 9），说明具有很高的吸附强度。Langmuir-Freundlich双模型中，n是一个不均匀性参数。n值越偏离1，则说明吸附剂表面越不均匀[33]。本研究中，n为1.775 5，表示吸附剂（果胶）表面的吸附能量是不均匀的，吸附中心呈现多样性。另外，本实验吸附过程与Langmuir-Freundlich双模型吻合度最高，说明吸附过程主要涉及离子交换过程[34]。

2.3 FCP和mFCP对镉离子的吸附动力学比较

图3 mFCP和FCP在不同时间点对镉的吸附Fig. 3 Cadmium binding of mFCP and FCP at different time points

如图3所示，在相同质量浓度条件下，mFCP对镉的吸附平衡质量浓度明显高于FCP。本实验通过对佛手皮渣果胶进行改性，降低其酯化度，从而大大提高了对镉的吸附能力。

2.4 FCP和mFCP体外模拟吸收特性

表2 FCP和mFCP的Ussing-Chamber浆膜侧溶液中的果胶含量（以半乳糖醛酸含量计）Table 2 Concentration of pectin at the serosa side of FCP and mFCP(calculated as concentration of galacturonic acid)

吸收实验开始后的0、30、60、90、120 min分别在浆膜侧取样测果胶含量。如表2所示，在黏膜侧加入不同质量浓度的FCP和mFCP溶液后，浆膜侧始终未检测到半乳糖醛酸，说明这两种果胶均不能被肠道吸收进入体循环。结合FCP和mFCP对镉离子的结合能力结果，本实验说明FCP和mFCP对镉离子的吸附主要在肠道内进行，而不是在血液中进行。该结果进一步证实，FCP和mFCP在胃肠道内对镉离子进行结合后，能够有效防止镉离子被肠道吸收而进入体循环。

2.5 镉暴露和mFCP、FCP预防对小鼠肝肾指数的影响

图4 镉暴露及FCP、mFCP预防对小鼠肝肾指数的影响Fig. 4 Effects of cadmium exposure and FCP versus mFCP on visceral indices of liver and kidney

如图4所示，镉暴露导致小鼠肝脏指数极显着高于对照组小鼠（P＜0.01），说明肝脏出现肿胀。进行mFCP和FCP预防处理后，肝脏肿胀现象显着好转，肝脏指数极显着低于镉暴露组小鼠（P＜0.01）。另外，镉暴露小鼠肾脏指数极显着低于对照组小鼠（P＜0.01），说明肾脏出现萎缩。进行mFCP和FCP预防处理后，肾脏萎缩现象显着好转，肾脏指数显着高于镉暴露组小鼠（P＜0.05，P＜0.01）。同剂量下FCP与mFCP对肝脏和肾脏的指数影响差异不显着（P＞0.05）。

2.6 FCP和mFCP预防镉诱导的肝脏功能损伤

如图5所示，相比对照组，镉暴露组小鼠血浆中AST、ALT、γ-GT、总胆红素水平均极显着上升（P＜0.01），说明镉暴露诱导小鼠肝脏出现损伤。FCP和mFCP干预组小鼠的上述指标均极显着低于镉暴露组小鼠（P＜0.01），说明FCP和mFCP能够预防镉引起的肝脏损伤。另外，同剂量下，mFCP保护肝脏的效果略好于FCP。

图5 镉暴露及FCP、mFCP预防对小鼠肝脏功能的影响Fig. 5 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on liver function in mice

2.7 各组小鼠尿样比较

图6 各组小鼠尿样比较Fig. 6 Urine samples from mice in each group

如图6所示，相比对照组，镉暴露组小鼠尿样颜色较深且浑浊，而FCP和mFCP干预组小鼠尿样颜色较为清亮透明。说明镉灌胃可能导致小鼠肾脏功能出现损伤，而FCP和mFCP预防处理后，有很好的缓解作用。

2.8 FCP和mFCP预防镉诱导的肾脏功能损伤

如图7所示，相比对照组，镉暴露组小鼠血浆中肌酐、尿素氮水平以及尿蛋白水平均极显着上升（P＜0.01），说明镉暴露诱导小鼠肾脏功能出现损伤。FCP和mFCP干预组小鼠的上述指标均极显着低于镉暴露组小鼠（P＜0.01），说明FCP和mFCP能够预防镉引起的肾脏损伤。另外，同剂量下，mFCP保护肾脏的效果相较于FCP无显着性差异（P＞0.05）。

图7 镉暴露及FCP、mFCP预防对小鼠肾脏功能的影响Fig. 7 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on kidney function in mice

2.9 镉暴露对肝肾形态学影响及FCP和mFCP的预防作用

图8 镉暴露及FCP、mFCP预防对小鼠肝脏形态学特征的影响（400×）Fig. 8 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on morphological features of liver in mice (400 ×)

如图8所示，对照组小鼠肝组织结构正常，肝细胞以血管为中心，向周围呈放射状排列，肝索清晰可见，细胞核膜明显。镉暴露小鼠肝细胞排列紊乱，肝索不明显，细胞核膜不清晰，细胞质呈气球样病变，细胞质流失，炎性细胞浸润。FCP和mFCP干预组小鼠肝脏上述病例现象不明显，说明FCP和mFCP对肝脏起到很好的保护作用。

图9 镉暴露及FCP、mFCP预防对小鼠肾脏形态学特征的影响（400×）Fig. 9 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on morphological features of kidney in mice (400 ×)

如图9所示，对照组小鼠肾脏组织结构正常，肾小球形态饱满。镉暴露小鼠肾小球出现明显萎缩现象。FCP和mFCP干预组小鼠肾脏肾小球萎缩不明显。说明FCP和mFCP对肾脏起到很好的保护作用。

2.10 镉暴露对肝肾氧化还原指标的影响及FCP和mFCP的预防作用

表3 镉暴露及FCP、mFCP预防对小鼠肝脏抗氧化能力的影响Table 3 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on antioxidant capacity of liver in mice

如表3、4所示，镉暴露导致小鼠肝脏和肾脏NO水平和MDA水平极显着上升（P＜0.01），说明肝脏和肾脏出现了明显的氧化损伤。FCP和mFCP预防处理能够显着缓解镉暴露引起的肝肾氧化损伤。另外，与对照组相比，镉暴露组小鼠肝脏和肾脏的T-AOC及抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）活力极显着下降（P＜0.01）。FCP和mFCP干预组小鼠肝脏和肾脏的T-AOC及抗氧化酶活力极显着高于镉暴露组小鼠（P＜0.01）。说明FCP和mFCP能有效缓解镉暴露引起的小鼠肝肾抗氧化能力下降。

表4 镉暴露及FCP、mFCP干预对小鼠肾脏抗氧化能力的影响Table 4 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on antioxidant capacity of kidney in mice

2.11 各组小鼠尿液、血液、粪便、组织中镉含量比较

表5 镉暴露及FCP、mFCP预防对小鼠尿液、血液、粪便、组织中镉含量的影响Table 5 Effects of cadmium exposure versus FCP and mFCP on cadmium levels in urine, blood, feces, and tissues in mice

由表5可见，镉暴露组小鼠尿液、血液、肝脏、肾脏中镉含量极显着高于CON组小鼠（P＜0.01），进行FCP和mFCP预防后，尿液、血液、肝脏、肾脏中镉的含量极显着低于镉暴露组小鼠（P＜0.01）。与之相反，FCP和mFCP预防组小鼠的粪便中镉的含量极显着高于镉暴露组小鼠（P＜0.01）。说明FCP和mFCP在胃肠道内结合镉后以粪便的形式排出体外。

3 讨 论

目前，有关柑橘果胶的研究发现，柑橘水果的果皮和果肉中的果胶具有很强的重金属吸附能力[15]。然而，有关柑橘果胶的镉吸附能力的研究还比较少，且果胶的重金属吸附能力主要应用在污水处理方面，在食品工业方面的研究还很少。提取佛手皮渣果胶，既能解决佛手相关产品生产造成的环境污染问题，又可以提高佛手的工业利用价值。本研究通过体外和体内实验证实佛手皮渣果胶具有非常好的吸附镉的能力；因此，本研究为将来佛手皮渣果胶在食品工业的应用提供可能，能够降低镉污染通过食物链对人体造成的伤害。

果胶对重金属吸附主要依赖于其结构中存在的大量活性基团，如羟基、羧基等。其中，果胶中游离羧基的含量对其重金属吸附能力起到决定性作用，果胶吸附重金属的能力与其分子的酯化度有关，酯化度越低则重金属吸附能力越强[35-36]。改性果胶在水溶液中有较多的游离羧基阴离子，每个阴离子都需要与阳离子结合形成稳定的“蛋壳”结构。毒性重金属通常含有更多的电荷，因此具有比钠、钾等金属离子更强的与羧基阴离子结合的能力。重金属与果胶结合后，以粪便的形式排出体外[37]。本研究中，通过改变pH值的方法，佛手皮渣果胶的酯化度显着下降，FT-IR结果证实佛手皮渣果胶改性后，其结构中游离羧基数量增加。另外，有研究认为，果胶对重金属的吸附作用机理可以归结为离子交换和表面吸附[38]。本实验通过热力学研究，证实佛手皮渣果胶对镉的吸附同样涉及离子交换和物理吸附。

肝脏是镉暴露的主要攻击器官，大量研究发现，镉暴露会导致肝脏出现肿胀，以及血液中ALT和AST水平升高现象[39]。肝脏指数是反应肝细胞膜损伤和炎性浸润的重要指标。ALT和AST分别存在于肝细胞的胞液和线粒体中，当肝功能损伤，肝细胞坏死时，ALT和AST会释放进入血液。肝脏对胆红素的代谢起着重要作用，肝功能一旦发生障碍，可导致胆红素在血液中含量急剧上升。另外，血液中γ-GT水平的升高也反映了肝组织的损伤。本研究中，镉暴露导致小鼠血液中ALT、AST、总胆红素、γ-GT水平显着高于对照组小鼠，说明镉暴露导致小鼠出现肝损伤。形态学结果也证实以上结论。FCP和mFCP预防处理能够显着缓解镉暴露导致的肝功能损伤。肾脏也是镉的主要攻击器官。研究发现，镉暴露会导致肾脏出现萎缩现象，血液中尿素氮、肌酐水平，以及尿液中蛋白的含量会显着上升[40]。本研究中，镉暴露导致小鼠血液中尿素氮、肌酐水平显着上升，而尿液中的蛋白含量也显着上升。结合肾脏石蜡切片结果以及小鼠尿液颜色结果，证实镉暴露导致小鼠肾脏损伤。不同剂量FCP和mFCP预防处理后，能够显着降低镉引起的肾脏损伤的程度。

机体自身的抗氧化能力主要依赖于细胞内的抗氧化酶系，包括SOD、CAT、GPx等。研究发现，镉进入体内后，可以和抗氧化酶结构中的二价金属离子发生竞争性作用，从而降低抗氧化活力[41]。NO是L-精氨酸在一氧化氮合酶的作用下生成的，NO过高可直接导致线粒体呼吸链受阻，导致组织细胞内能量代谢障碍，引起细胞凋亡[42]。脂质过氧化产物MDA也是细胞氧化损伤的重要检测指标。本研究中，镉暴露导致小鼠肝脏和肾脏NO和MDA含量显着上升，说明出现氧化损伤。另外，抗氧化酶活力显着下降，说明抗氧化能力下降。然后，FCP和mFCP预防处理能有效缓解镉暴露引起的肝肾抗氧化能力下降，减弱氧化应激损伤。

果胶的生理活性及功能与其特定结构有关，溶解性差、肠道吸收困难等因素严重制约了果胶的扩展应用[43]。目前，已有临床研究将小分子改性果胶通过口服的形式治疗重金属超标引起的疾病，能够有效降低患者血液中重金属的含量[44]。说明通过适当的改性，可以将果胶的分子质量降低至肠道能够吸收的级别。然而，本实验中，Ussing-Chamber体外模拟体系结果显示，本实验制得的佛手皮渣果胶及其改性产物并不能通过肠道被机体吸收。结合粪便中镉含量的测定结果，本实验制得的佛手皮渣果胶和改性佛手皮渣果胶能够有效结合胃肠道内的镉，避免镉透过肠壁进入内循环，并以粪便的形式排出体外，从而缓解镉对机体的损伤。

综上所述，通过pH值改性手段能够显着降低佛手皮渣果胶的酯化度，提高其对镉的吸附能力。此外，佛手皮渣果胶和改性佛手皮渣果胶能够拮抗镉毒性，降低镉引起的肝肾氧化损伤和功能缺失。今后研究将重点关注佛手皮渣果胶对镉诱导的肝肾损伤相关机制和剂量选择，并通过改性条件优化降低佛手皮渣果胶的分子质量，提高其在肠道的吸收率，从而进一步提高佛手加工的附加价值。