李文峰，陶 雯，陈露红，郑俏然，周 凤，谭 飔，邢 洁
（长江师范学院现代农业与生物工程学院，重庆 408000 ）
左旋肉碱是红肉的一种固有成分，主要存在于杂食者的饮食中[1]。目前，它的推荐摄入量从1 g/d增加到3 g/d[2]。左旋肉碱属于类维生素，与动物体内的脂肪酸代谢密切相关[3]，以左旋肉碱作为膳食补充剂可以调节脂肪肝患者血脂浓度，降低肝酶活性，改善肝脂肪变性，减轻患者体质量[4]。虽然左旋肉碱的短期摄入确实会有效降低体质量，但是长期摄入会改变小鼠盲肠微生物构成，显着提高小鼠体内三甲胺和氧化三甲胺的合成，从而增加小鼠患动脉粥样硬化的风险[5]。此外，先前的研究结果表明，连续10 周灌胃质量分数3%左旋肉碱水溶液会导致小鼠出现肌肉萎缩和肝脏损伤[6]。尤其是长期口服左旋肉碱会加速活性氧（reactive oxygen species，ROS）在血清和肝脏中的产生，并削弱超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化酶的活性[2,6]，表明左旋肉碱的长期摄入会导致氧化应激。氧化应激水平的升高可上调P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和其他ATP结合盒（adenosine triphosphate-binding cassette，ABC）式转运体的过度表达，继而诱发强烈的首过代谢[7]。首过代谢是指口服药物经胃、肠道吸收后，经门静脉输送至肝脏代谢灭活，导致进入血液循环的有效药量显着减少的现象，它与P-gp、多药耐药蛋白（multidrugresistant protein，MRP）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（uridine diphosphate-glucuronosyltransferase，UGT）和磺酸基转移酶（sulfotransferase，SULT）等外排转运泵及II相代谢酶紧密相关[8]。肠道组织过度表达外排转运泵及II相代谢相关蛋白意味着药物或外源性营养成分遭受了严重的首过代谢，导致生物利用度降低[9]。就此推测，左旋肉碱可能会影响小肠的外排转运蛋白等首过代谢相关蛋白的表达。已有研究发现，黄芪和灵芝多糖能够调控细胞对P-gp和多药耐药性相关蛋白的表达，从而拮抗药物的首过代谢[10-11]。
可溶性大豆多糖（soybean soluble polysaccharides，SSPS）是一种酸性多糖，主链由聚半乳糖醛酸和鼠李半乳糖醛酸聚糖组成，侧链是β-1,4-半乳聚糖，支链具有果糖和阿拉伯糖残基[12]，它作为抗氧化剂可以防止肾上皮细胞的氧化损伤[13]。本研究旨在探究长期过度摄入左旋肉碱对肠组织首过代谢、氧化应激和炎性反应的影响，并考查SSPS的健康保护作用。以期为合理摄入左旋肉碱提供科学依据，为拓展大豆可溶性多糖的应用领域提供参考。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
健康昆明种雄性小鼠（体质量20～25 g，动物生产许可证号：XJYYLL-2015689）、标准鼠粮 第四军医大学实验动物中心；左旋肉碱（食品级） 西安万昌生物科技有限公司；SSPS 上海生物技术蔬菜蛋白有限公司；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）试剂盒 上海酶联生物技术有限公司；SOD试剂盒、羟自由基（·OH）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒 南京建成生物工程研究所；乙腈、甲酸乙酯（色谱级） Adamas试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
F10均质机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）仪 北京Bruker公司；LDZ5-2台式自动平衡离心机 常州恒隆有限公司；UPLC系统美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 方法
1.3.1 动物分组
小鼠被饲养在有光和温度控制的动物实验室（12 h/12 h光/暗周期、（22±2）℃）。在为期1 周的适应性喂养期间，小鼠可摄入自来水和正常食物。适应喂养期后随机分为3 组，每组8 只。正常组：小鼠每天摄入自来水，灌胃0.4 mL生理盐水；左旋肉碱组：小鼠每天摄入3%（质量分数，下同）左旋肉碱水溶液，灌胃0.4 mL生理盐水；SSPS组：小鼠每天摄入3%左旋肉碱水溶液，灌胃0.4 mL 250 mg/kg SSPS[14]。所有操作均在19∶00～20∶00进行，灌胃实验连续进行56 d，每隔1 d更新一次3%左旋肉碱水溶液，每周称量一次小鼠的体质量。此外，在喂食期间，所有小鼠都允许自由摄入标准鼠粮。在最后一次灌胃2 h后，对所有小鼠采取禁食管理，12 h禁食期间允许摄入蒸馏水。用异氟烷将小鼠麻醉后处死，解剖后收集小鼠小肠。
1.3.2 小肠的生化分析和ELISA分析
将0.3 g小肠组织与2.7 mL生理盐水混合后均质，3 000 r/min离心10 min[15]。按照ELISA试剂盒说明书测定上清液的P-gp、MRP1、MRP3、IL-1、IL-6、TNF-α质量浓度和UGT、SULT活力，按试剂盒说明书测定MDA浓度、SOD活力和·OH清除能力。
1.3.3 小肠内容物代谢物含量分析
将小肠切开，用生理盐水清洗，收集小肠内容物。将100 μL小肠内容物与400 μL冷提取溶液（V（甲醇）：V（乙腈）：V（水）＝1∶1∶1）充分混合，3 000 r/min离心15 min后取上清液备用。将300 μL上清液和1 000 μL甲醇加入到1.5 mL离心管中，混匀后用0.22 μm聚偏二氟乙烯过滤，滤液采用UPLC-Q-TOF/MS仪进行分析。为了验证仪器稳定性，将每个样本等量混合，制成质量控制样品[16]，将其随机插入到真实样品队列中进行8 次分析[17]。进样量为5 μL，采用AcclaimTMRSLC C18柱（100 mm×3.0 mm，2.2 μm）。UPLC条件：柱温25 ℃，流速0.2 μL/min，用0.1%（体积分数，下同）甲酸（流动相A）和含有0.1%甲酸的乙腈（流动相B）进行梯度洗脱。梯度洗脱程序如下：0～5 min，95%～70%流动相A；5～10 min，70%～40%流动相A；10～15 min，40%～10%流动相A；15～18 min，10%流动相A；18～25 min，10%～95%流动相A；25～30min，95%流动相A。MS条件：毛细管加热器和蒸发加热器的温度分别为220 ℃和450 ℃，在SCAN模式下采集m/z 50～1 000的离子信息，扫描速度为600 ms/cyc。干燥气（流速8 mL/min）和碰撞气均为氮气，碰撞能量为10 eV。
1.3.4 UPLC-Q-TOF/MS数据分析
使用M a s s Ly n x软件M e t a b o N e x u s程序对UPLC-Q-TOF/MS数据进行预处理[18]。将MetaboNexus中得到的数据矩阵通过一个样本中所有代谢物的响应之和进行归一化。用R软件（https://www.r-project.org）对归一化数据矩阵进行处理[19]。通过主成分分析（principal component analysis，PCA）、有监督的偏最小二乘法分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和稀疏的PLS-DA（sparse PLS-DA，sPLS-DA）处理数据矩阵。采用sPLS分析生物标志物水平、抗氧化活性和ABC-转运蛋白表达水平之间的相关性。采用Multi Experiment Viewer软件（http://www.tm4.org/）进行单因素分析。以Benjamini-Hochberg方法为基础的Kruskal-Wallis测试和错误发现率（false discovery rate，FDR）修正评估结果。z-值按照文献[20]方法进行计算。根据与标准物的MS/MS图和公共数据库谱图（包括HMDB数据库（http://www.hmdb.ca/w/databases）、LipidomicsGateway数据库（http://www.lipidmaps.org/）、KEGG数据库（http://www.kegg.jp）和METLIN数据库）进行对照以确定不同的代谢产物。
1.4 数据统计与分析
通过GraphPad Prism 6软件作图。利用SPSS软件对数据进行Q-Q图分析，判断数据是否符合正态分布；若数据符合正态分布，则使用最小显着性差异法进行多重比较分析；如果数据不符合正态分布，则采用非参的Kruscal-Wallis法进行统计分析，当存在显着性差异时进一步采用Wilcoxon检验；P＜0.05表示差异显着。
2 结果与分析
2.1 SSPS对小鼠小肠内转运蛋白的影响
图1 SSPS对小鼠小肠内P-gp（A）、MRP1（B）、MRP3（C）质量浓度及SULT（D）、UGT（E）活力的影响Fig. 1 Effect of SSPS on P-gp (A), MRP1 (B) and MRP3 (C)concentrations, and SULT (D) and UGT (E) activities in the small intestine of mice
由图1A可知，连续8 周灌胃质量分数3%左旋肉碱导致小鼠小肠P-gp质量浓度显着增加了194%（P＜0.05），表明小鼠摄入过量左旋肉碱会引起强烈的外排转运。但SSPS处理能将P-gp质量浓度从（1.62±0.82）ng/mL降低到（0.97±0.40）ng/mL（P＜0.05）。在8 周实验后，摄入过量左旋肉碱的小鼠相对于正常小鼠的小肠组织MRP1（图1B）和MRP3（图1C）质量浓度分别增加了65%（P＞0.05）和55%（P＜0.05）。SSPS能使左旋肉碱组小鼠小肠的MRP1和MRP3质量浓度轻微降低（P＞0.05）。除外排泵转运蛋白P-gp、MRP1和MRP3外，UGT和SULT也是诱导强烈首过代谢的关键蛋白。如图1D、E所示，在不同处理组的小鼠小肠组织中SULT和UGT活力没有明显变化（P＞0.05）。因此，左旋肉碱和SSPS并不会通过诱导II相代谢酶表达而诱发强烈的首过代谢。
2.2 SSPS对小鼠小肠抗氧化能力的影响
图2 SSPS对小鼠小肠SOD活力（A）、·OH清除能力（B）、MDA浓度（C）的影响Fig. 2 Effect of SSPS on SOD activity (A), hydroxyl radical scavenging activity (B) and MDA content (C) in the small intestine of mice
如图2A所示，小鼠摄入质量分数3%左旋肉碱导致小肠SOD活力显着下降（P＜0.05）。此外，左旋肉碱组小鼠小肠也具有更低的·OH清除能力（图2B）。然而，连续8 周的SSPS处理可有效预防左旋肉碱诱导的SOD活力和·OH清除能力的降低。与正常组小鼠比较，摄入过量左旋肉碱小鼠小肠的MDA浓度从（0.96±0.14）nmol/mL显着提高到（1.68±0.31）nmol/mL（P＜0.05）（图2C）。SSPS组小鼠小肠的MDA浓度与左旋肉碱组小鼠相比降低了34%。因此，SSPS对过量左旋肉碱引起的氧化应激具有很强的保护作用。
2.3 SSPS对小鼠小肠内炎症因子的影响
如图3所示，3 组小鼠小肠的IL-1、IL-6和TNF-α质量浓度变化不显着（P＞0.05），表明连续8 周摄入过量左旋肉碱或SSPS不会引起小肠的炎症反应。
2.4 小鼠小肠内容物的代谢组学分析
图4 正离子模式（A）和负离子模式（B）下小鼠小肠内容物的UPLC-Q-TOF/MS图Fig. 4 Chromatograms of small intestinal contents in positive ion mode (A)and negative ion mode (B) obtained from ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry analysis
如图4所示，在基于100%峰缺失值识别之后，从实际样品中获得了1 622 个正离子和508 个负离子，并且通过MetaboNexus软件对出峰时间和m/z信息进行排列和对齐。为了减少假阳性结果，以质量控制数据集为标准，将峰面积相对标准偏差大于30%的代谢产物信息从数据集中去除[12]。最后得到1 209 个离子，包括798 个正离子和411 个负离子。
2.5 小鼠小肠内容物代谢标志物的鉴定结果
如图5A所示，第1主成分将左旋肉碱组小鼠与正常组和SSPS组小鼠进行了判别，而第2主成分则区分了SSPS组小鼠与另外2 组小鼠。然而，PCA的第3主成分并不能判别不同的膳食对小鼠小肠内容物代谢指纹图谱的影响。此外，由PCA得分图可知，第1主成分和第2主成分可累计解释44%的变量。因此，进一步的sPLS-DA选择了2 个主成分为预测距离筛选参数。采用中心距离时sPLS-DA具有最小标准偏差，故在正式的sPLS-DA中采用中心距离和2 个主成分。在sPLS-DA得分图（图5B）中，正常组、左旋肉碱组小鼠和SSPS组小鼠之间有明显的区别。据此筛选出的6 种代谢物的sPLS-DA得分图如图5C所示，它们与其他代谢物相比具有更大的自变量投影重要性指标（variable importance in projection，VIP）和载荷值（图5D），表明这6 种代谢物对3 组小鼠的区分具有更重要的价值。为了更准确地确定潜在生物标志物，本实验分析了基于z-值的FDR，结果表明支链淀粉可能是假阳性结果（P＞0.05），因此将其从候选池中移除（图5E）。最终确定了5 个潜在生物标志物，它们分别为1,2-双-(二十四烯酰)-丙三基-3-胆碱磷酸（PC(24∶1/24∶1)）、1-(二十碳五烯酰)-2-(十九烷基)-丙三基-3-磷酸-(1’-甘油)（PG(20∶5/19∶0)）、sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-(二十碳五烯酰)-2-(二十碳四烯酰)-丙三基-3-胆碱磷酸（PC(20∶5/20∶4)）和N(Omega)-(ADP-D-核糖基)-L-精氨酸。
图5 小鼠小肠内容物代谢指纹图谱的多元变量分析Fig. 5 Multivariate analysis of intestinal metabolite fi ngerprints
2.6 差异物关系以及与首过代谢关系
图6 生物标志物的关系图Fig. 6 Relationship among biomarkers
如图6所示，长期过量摄入左旋肉碱引起了磷脂酰甘油、卵磷脂和sn-甘油-3-磷酸乙醇胺3 种脂质的代谢变化，表明小鼠肠道的能量代谢发生了紊乱。
图7 左旋肉碱和SSPS处理小鼠的代谢组学结果（A）和生化分析结果（B）相关性Fig. 7 Correlation between metabonomic (A) and biochemical analysis (B)of L-carntine and SSPS-treated mice
SSPS处理可将左旋肉碱喂养小鼠体内的脂质和能量代谢维持在正常水平（图7A）。如图7B所示，sPLS分析表明MDA浓度与P-gp质量浓度、PC(24∶1/24∶1)与PG(20∶5/19∶0)、sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、PC(20∶5/20∶4)含量具有很好的正相关性。同时MRP3质量浓度与P-gp质量浓度、MDA、PC(24∶1/24∶1)、PG(20∶5/19∶0)、sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、PC(20∶5/20∶4)含量之间也存在一定的正相关关系。此外，P-gp质量浓度、MDA、PC(24∶1/24∶1)、PG(20∶5/19∶0)、sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、PC(20∶5/20∶4)含量分别与·OH清除能力和SOD活力呈负相关。
3 讨 论
左旋肉碱作为红肉中的固有成分，一直以来被推崇为一种特效减肥食品[1,21]。然而，近年来一些研究发现，长期摄入高剂量的左旋肉碱会导致肾脏代谢压力[22]。SOD活力和·OH清除能力被广泛用于反映体内的氧化应激状态[13,23]；MDA作为一种脂质氧化产物，具有比ROS更长的半衰期，且能显着增强体内氧化应激的水平[24]。与先前研究结果[2,4]类似，摄入过量左旋肉碱导致小鼠小肠SOD活力以及·OH清除能力减弱，MAD含量显着增加，表明左旋肉碱确实可以诱导氧化应激。值得注意的是，目前的研究结果表明SSPS作为重要的食物抗氧化剂可有效抑制左旋肉碱诱导的小鼠小肠氧化应激[13]。体内氧化应激水平的提升可诱导外排泵转运蛋白和II相代谢酶的过度表达，继而引发强烈的首过代谢，导致食品成分或药物的生物利用度降低[9]。
P-gp是人和啮齿动物体内药物外排转运体ABC家族中最重要的成员，在人体内由MDR1基因编码[25]，是参与药物首过效应的主要转运体[26]。P-gp的过度表达会导致外源性活性成分的II相代谢产物被迅速排出，从而使其生物利用度降低，导致营养成分功效下降[27]。本研究发现，长期过量摄入左旋肉碱导致小鼠小肠P-gp质量浓度显着增加，表明左旋肉碱强化了首过代谢。SSPS有效抑制了左旋肉碱诱导的P-gp质量浓度的增加，说明SSPS可以抑制首过代谢的外排转运通路，从而有助于提升营养成分的生物利用度。
营养物质在遭受外排转运前，会先在UGT和SULT等II相代谢酶的作用下发生II相生物转化，生成水溶性更高的葡萄糖醛酸化和磺酸化代谢产物以便转运[28-29]。无论是长期摄入过量的左旋肉碱还是同时摄入SSPS与左旋肉碱均不能改变小鼠小肠的SULT和UGT活力，因此，左旋肉碱和SSPS对首过代谢过程的II相代谢基本没有影响。
虽然氧化应激也可诱导脂质过氧化反应继而刺激炎症因子的形成和释放[30-31]，但左旋肉碱和SSPS处理均未引起小鼠小肠中标志性炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α质量浓度的显着变化。氧化应激除了引起强烈的首过代谢和炎症外，也可导致体内脂质代谢的紊乱。大量研究表明，长期口服摄入大剂量的左旋肉碱会导致肝脏脂质代谢与血脂代谢的失衡[3]。本研究中代谢组学分析结果表明，左旋肉碱引起了小鼠肠道能量及脂质代谢的紊乱，且这种紊乱与氧化应激参数MDA浓度及抗氧化活性间存在着一定的正相关关系。SSPS可维持左旋肉碱组小鼠小肠代谢的稳态，这或许是其抑制氧化应激水平提升的原因。因此，SSPS可能是一种能有效预防长期摄入左旋肉碱导致副作用的膳食营养因子。
