凝固型苦荞酸奶对小鼠肠道菌群的调节作用

周一鸣，赵 燊，冯 飞，刘 倩，周小理*，肖 瀛

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418 ）

酸奶是一种健康营养的食品，主要是以新鲜牛乳为原料，添加适量砂糖，经巴氏灭菌和冷却后加入乳酸菌发酵剂，在适宜条件下进行发酵而成的乳制品[1]。已有研究表明：酸奶具有改善肠道菌群[2]、减轻乳糖不耐症、降低血清胆固醇[3]、抗氧化延缓衰老[4]、降血压[5]和增强机体免疫力[6-7]等功能。酸奶制备时普遍以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂[8]；而植物乳杆菌ST-III因其具有抑制肠道中致病菌、增殖有益菌群以及降胆固醇的作用，越来越多地被应用到发酵食品当中[9-10]。

目前，许多研究表明，植物蛋白更为健康，其不仅有助于预防糖尿病、高血压、心脏病和某些癌症，而且对于环境、可持续发展和动物保护问题方面也优于动物蛋白[11-13]。苦荞作为一种天然“药食两用”的绿色食品[14]，具有较高的营养价值和药用价值。苦荞蛋白是苦荞中主要的生物活性成分，其约占苦荞籽粒的15%～17%，主要由谷蛋白、水溶性清蛋白和盐溶性球蛋白组成，富含18 种氨基酸[15]。功能研究表明，苦荞蛋白具有调节血脂、提高抗氧化能力、改善氧化应激[16]、促进胆酸排泄、促进肠道中乳酸杆菌的生长[17]以及调节肠道菌群平衡[18]等多种功效。

在正常生理状况下，肠道菌群以双歧杆菌、乳杆菌等有益菌占优势，从而使非致病菌与致病菌之间相互制约、相互作用，保持肠道正常的微生态平衡[19-20]。然而肠道菌群组成会随生理和病理情况的改变而发生变化，在某些病理条件下现代的高脂饮食容易引发人体肠内菌群紊乱，有益菌数量减少和有害菌数量大量增加，引起菌群失调，最终导致人体失去抵抗致病菌的天然保护屏障，正常的生理状况受损，出现急、慢性腹泻和消化不良等一系列临床症状[21-25]。研究表明肠道菌群在肠道健康及体内稳态平衡等方面起重要作用，通过膳食补充益生菌和益生元，可选择性地调节肠道菌群的组成，保持肠道菌群平衡，是促进人体健康的有效措施[26-27]。因此，肠道菌群已成为近几年来世界各地学者的研究热点。

本研究通过进行动物实验，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）方法、气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）、Illumina高通量测序技术，对小鼠肠道菌群数量和种类，以及主要代谢产物——短链脂肪酸的含量进行分析，初步探究了凝固型苦荞酸奶对小鼠肠道菌群的调节作用，以期获得新型功能性苦荞酸奶新产品，为苦荞发酵食品的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级4 周龄雄性实验用C57BL/6小鼠36 只，体质量在15～18 g之间，购于上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0018。

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus GIM1.155）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles GIM1.83） 广东省微生物菌种保藏中心；植物乳杆菌（L. plantarum ST-III） 光明乳业研究院；苦荞粉雁门清高食品有限公司；UltaSYBR Mixture、DM 1000 DNA Marker、粪便基因组DNA提取试剂盒、6×DNA Loading Buffer、RNase A 康为世纪生物科技有限公司；50×TAE、DNA Ladder、TE buffer、Glod View核酸染色剂 碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

qTOWER2.2 qPCR仪、Chem Studio化学发光成像仪德国耶拿分析仪器股份公司；GCMS-TQ8040 GC-MS仪日本岛津公司；DYCP-31DN型水平电泳仪 北京六一仪器厂；YQX-II型厌氧培养箱 上海龙跃仪器设备有限公司；SW-CJ-IFD垂直洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸奶的制备

凝固型苦荞酸奶的制备参考刘兰杰[28]的方法并稍作修改，将苦荞粉与水1∶5（m/V）混合，90 ℃糊化1 h得苦荞浆。脱脂乳粉与水1∶6（m/V）混合得脱脂乳。将30%（质量分数，下同）苦荞浆、6%蔗糖加入脱脂乳中，使其混合均匀。于20～22 MPa、50～60 ℃条件下均质，95 ℃水浴10 min进行巴氏杀菌，冷却至40 ℃。在无菌条件下，接种5%的混合发酵剂（植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌菌液体积比2∶1∶1），42 ℃恒温发酵6 h，4 ℃冰箱中冷藏后熟10 h，4 ℃贮存备用。制备普通酸奶时不添加苦荞浆。

1.3.2 实验动物的饲养

实验小鼠在清洁级环境（温度22～24 ℃、相对湿度55%～65%）下，低脂低糖标准饲料预饲2 周，随机分成3 组，每组12 只，分别为对照组（CON）、苦荞酸奶组（BYG）和普通酸奶组（YG）。3 组均喂食高脂饲料，饲养期间小鼠自由取食。CON组灌胃生理盐水，BYG和YG组分别灌胃凝固型苦荞酸奶和普通酸奶，灌胃剂量为0.4 mL/d，连续灌胃4 周（灌胃前4 h禁食、禁水）。饲料配方见表1。

表1 实验小鼠饲料配方Table 1 Formulation and composition of experimental diets

1.3.3 小鼠粪便中主要肠道菌群数量的测定

最后一次灌胃24 h后，以实验分组为单位收集各组小鼠粪便于干燥的灭菌试管中。粪便于-80 ℃冰箱中保存。用粪便基因组提取试剂盒对小鼠粪便中细菌基因组进行提取，用SYBR Green I染料法[29]对6 种主要常见肠道菌（柔嫩梭菌、拟杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、肠球菌）进行实时荧光定量分析，6 种常见肠道菌的特异qPCR引物名称及引物序列见表2，扩增条件参考Rinttilä等[30]的方法。

采用25 μL qPCR体系：UltaSYBR Mixture 12.5 μL、10 µmol/L引物1.0 μL、（20.0±0.5）ng/μL模板1 μL、ddH2O 10.5 μL。设置NTC并做3 个重复反应。各样品的分子拷贝数根据各样品的熔解温度Ct值与其相应标准曲线的回归方程精确计算出样品菌群数量，最后换算成样品中基因的拷贝数（copies/g）。

表2 菌群特异类群qPCR引物Table 2 qPCR primers for specific groups

1.3.4 小鼠粪便中短链脂肪酸含量的测定

称取粪便样品0.30～0.40 g于10 mL离心管中，加甲醇溶液2.6 mL、蒸馏水2 mL溶解，6 000 r/min离心10 min，取上清液，加入体积分数60%硫酸溶液调节至pH（1.50±0.10），70 ℃水浴1 h。冷却至室温，加二氯甲烷1 mL振荡混匀，6 000 r/min离心10 min，吸取下层有机溶剂，作为GC-MS的进样样品[31]。

GC-MS条件[32]：采用程序控制升温，起始温度为35 ℃，持续1 min，以10 ℃/min升温到100 ℃，持续1 min，以20 ℃/min升温到250 ℃，持续3 min；载气为氦气，流速1.0 mL/min，分流比10∶1，进样量1 μL；接口温度260 ℃。

1.3.5 小鼠肠道菌群多样性分析

将收集到的各组小鼠的粪便样品均分为4 份，采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取小鼠粪便样品中微生物总DNA。所提取的DNA于-40 ℃冰箱中保存，后将DNA样品送上海美吉生物医药科技有限公司，对样品进行qPCR扩增及测序，qPCR产物采用Illumina MiSeq高通量测序平台进行测序。

1.4 数据处理与分析

用SPSS 20.0软件进行方差分析（最小显着性差异法检验），检验水准α＝0.05进行显着性分析；每组数据均3 个平行，结果以平均值±标准差表示，并运用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 小鼠粪便中主要肠道菌群数量的测定结果

由表3可知，YG组及BYG组小鼠粪便中的肠道有害菌（肠球菌、肠杆菌、拟杆菌）数量较CON组显着减少，其中，BYG组小鼠粪便中的肠道有益菌（乳酸杆菌、双歧杆菌、柔嫩梭菌）较CON组分别增加了523.81、911.01、12.18 倍，较YG组分别增加了4.89、13.79、1.95 倍；且肠道有益菌（乳酸杆菌、双歧杆菌、柔嫩梭菌）较对照组显着增多，其中BYG组小鼠粪便中的肠道有害菌（肠杆菌、肠球菌、拟杆菌）较CON组分别减少了99.89%、97.31%、99.02%，较YG组减少了88.52%、84.15%、88.52%。该结果表明普通酸奶和凝固型苦荞酸奶均对小鼠粪便中主要的几种肠道菌群有一定的调节作用，可抑制有害菌的生长并促进有益菌的增殖，且凝固型苦荞酸奶的调节作用比普通酸奶更为显着。

表3 小鼠粪便中主要肠道菌群数量的测定结果（n=3）Table 3 Contents of main intestinal microorganisms in the feces of mice (n= 3)

2.2 小鼠粪便短链脂肪酸含量的测定结果

图1 小鼠粪便短链脂肪酸的含量Fig. 1 Contents of short chain fatty acids in the feces of mice

由图1可知，凝固型苦荞酸奶和普通酸奶均可促进小鼠肠道内短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、乳酸）的生成。YG组小鼠粪便中的短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、乳酸）含量较CON组显着增加，这可能是由于酸奶中的益生菌成分具有调节肠道菌群、增加短链脂肪酸含量的功效。BYG组小鼠粪便中的乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的含量比CON组分别增加了36.87%、75.59%、56.26%、92.36%，比YG组分别增加了30.09%、19.60%、14.45%、70.91%。因此，凝固型苦荞酸奶促进小鼠体内短链脂肪酸生成的效果优于普通酸奶，这可能是由于凝固型苦荞酸奶综合了益生菌成分和苦荞营养成分的作用。

2.3 小鼠肠道菌群多样性分析

采用Illumina高通量测序技术，对本研究中的样品进行测序，利用各样本的测序量在不同测序深度时观测到的物种数量（Sobs指数）构建稀释性曲线（图2），以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。结果表明当曲线趋向平坦时，测序数据量足够大，可以反映出样本中绝大多数的微生物信息。

图2 稀释性曲线Fig. 2 Rarefaction curve

高通量测序结果显示，经97%相似性归并后，CON组、BYG组、YG组小鼠粪便样品分别共计有248、295、232 个操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。3 组小鼠粪便菌群在97%相似性水平的Alpha多样性指数见表4，多样性指数组间差异见图3。Sobs指数、Ace指数和Chao指数是评价肠道菌群丰富度的指数，与菌群丰富度成正比[33]。Coverage指数是指各样品文库的覆盖率，可反映样品的测序深度[34]。Alpha分析表明，3 组之间的Sobs指数、Ace指数和Chao指数差异显着，BYG组的菌群Alpha多样性指数最高，CON组次之，YG组最低。3 组样品的Coverage指数均在0.89以上，表明样品测序深度合理，测序覆盖率较高。以上多样性分析结果表明，灌胃凝固型苦荞酸奶可以增加小鼠肠道菌群的物种丰富度。

表4 各组小鼠粪便样品菌群的Alpha多样性指数Table 4 Alpha diversity index of fecal samples of mice in each group

图3 各组小鼠粪便样品菌群的Alpha多样性指数组间差异Fig. 3 Difference in Alpha diversity index of fecal samples between three groups

2.4 小鼠肠道菌群组成分析

图4 各组小鼠粪便样品菌群的Venn图Fig. 4 Venn diagram of fecal samples in each group

Venn图可用于统计多组或多个样本中所共有和独有的物种（如OTU）数目，可以比较直观地表现环境样本的物种（如OTU）数目组成相似性及重叠情况。由图4可知，相比于YG组和CON组，BYG组的样品物种数量有明显的增加。3 组样品的共有物种有192 种，其中YG组和CON组样品的特有物种均有15 种，而BYG组样品的特有物种多达61 种。由此可见，在凝固型苦荞酸奶的作用下小鼠肠道菌群会增加新的物种，肠道菌群的多样性会得到提升。

图5 各组小鼠粪便样品群落在门水平上的分布Fig. 5 Distribution of intestinal microf l ora at the level of phylum in each group

图6 各组小鼠粪便样品群落在属水平上的分布Fig. 6 Distribution of intestinal microf l ora at the level of genus in each group

根据分类学分析结果，可以得知不同分组样品在各分类水平上的群落结构组成情况。3 组样品群落在门水平、属水平的分布见图5、6。从门水平上看，BYG组较YG组和CON组，厚壁菌门（Firmicutes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）的相对丰度显着降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度显着升高。Zhang Chenhong等[35]研究发现饲喂高脂饲粮的大鼠，其肠道菌群中拟杆菌门所占比例减少，而厚壁菌门和变形菌门（Proteobacteria）所占比例增加。这说明凝固型苦荞酸奶可以缓解由高脂饮食引起的小鼠肠道菌群内拟杆菌门和厚壁菌门的变化，使之更趋向于正常水平。从属水平上看，与CON组相比，BYG组能显着提高norank_f__Bacteroidales_S24-7_group、Faecalibaculum菌属的相对丰度，降低Ruminococcaceae_UCG-014、unclassified_f__Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_UCG-006菌属的相对丰度。与普通酸奶相比，凝固型苦荞酸奶能够提高norank_f__Bacteroidales_S24-7_group、Blautia菌属的菌群丰度，降低unclassified_f__Lachnospiraceae、Ruminococcaceae_UCG-014菌属的菌群丰度，提高小鼠肠道中优势菌属的地位。Park等[36]研究发现Blautia属可将肠道中气体转化成乙酸，使气体得以清除并增加肠道短链脂肪酸的含量，该菌种的首次发现是在小鼠的粪便中，且具有产乳酸的作用。Faecalibaculum的首次发现是在小鼠的粪便中，且具有产乳酸的作用，可以增加肠道菌群的短链脂肪酸含量[37]。这几种菌属相对丰度的增加可以促进小鼠体内短链脂肪酸的生成，从而使小鼠粪便中短链脂肪酸含量提高，这与本研究中短链脂肪酸含量测定结果一致。Lachnospiraceae菌属的部分菌种已被发现会在无菌小鼠中引起糖尿病[38]。Rooks等[39]研究发现Norank_f__Bacteroidales_S24-7_group丰度的增加可缓解高脂饮食小鼠的结肠炎。Shang Qingsen等[40]研究发现Ruminococcaceae部分种属可能与抗抑郁相关，在重度抑郁人群中，其相对含量显着减少。综上，苦荞酸奶可以增加肠道优势菌属的相对丰度，从而起到优化肠道菌群组成的作用。

3 结 论

本研究通过进行动物实验，利用qPCR方法、GC-MS、Illumina高通量测序技术，对小鼠肠道菌群数量和种类，以及主要代谢产物——短链脂肪酸的含量进行分析，初步探究了凝固型苦荞酸奶对小鼠肠道菌群的调节作用。结果表明，凝固型苦荞酸奶对小鼠肠道中3 种有害菌（肠杆菌、肠球菌、拟杆菌）的生长具有抑制作用且高于普通酸奶，在其抑制作用下，3 种菌的数量较对照组分别减少了99.89%、97.31%、99.02%；对3 种有益菌（乳酸杆菌、双歧杆菌、柔嫩梭菌）的生长具有促进作用，较对照组分别增加了523.81、911.01、12.18 倍，且促进作用显着高于普通酸奶。同时，凝固型苦荞酸奶可以显着提高小鼠肠道内短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、乳酸）的含量，凝固型苦荞酸奶组小鼠粪便中的乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的含量比对照组分别增加了36.87%、75.59%、56.26%、92.36%。高通量测序结果表明，灌胃凝固型苦荞酸奶可以提高小鼠肠道菌群多样性，并且在门水平上显着降低厚壁菌门和疣微菌门的相对丰度，显着提高拟杆菌门的相对丰度，在属水平上显着提高norank_f__Bacteroidales_S24-7_group、Faecalibaculum菌属的丰度，降低Ruminococcaceae_UCG-014、unclassified_f__Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_UCG-006菌属的丰度，提高肠道优势菌属的地位。

综上所述，凝固型苦荞酸奶显着增加了小鼠肠道内几种产短链脂肪酸的菌属的丰度，从而对乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等短链脂肪酸的生成起到了促进作用，降低肠道的pH值进而抑制肠道有害菌（肠杆菌、肠球菌、拟杆菌）的生长，并增加了肠道优势菌属的相对丰度。凝固型苦荞酸奶相比普通酸奶，可以更好地促进小鼠肠道内有益菌（双歧杆菌、乳酸杆菌等）的增殖并抑制有害菌（肠杆菌、肠球菌和拟杆菌等）的增殖，增加肠道短链脂肪酸的含量，改善肠道环境，增加小鼠肠道菌群的多样性，提高肠道优势菌属的相对丰度，优化小鼠肠道菌群组成。