段伟文，全沁果，高 静,2,3,4，毛伟杰,2,3,4，郝记明,2,3,4，刘书成,2,3,4，吉宏武,2,3,4,*

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088 ；2.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东 湛江 524088 ；3.广东省海洋食品工程技术研究中心，广东 湛江 524088 ；4.广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东 湛江 524088 ）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又称南美白对虾，是我国养殖规模最大的经济虾类[1]。凡纳滨对虾水分含量高，蛋白质以肌浆蛋白和肌原纤维蛋白为主，极易在捕捞、运输、加工及贮藏过程中受细菌侵袭而迅速变质[2-3]。冰温贮藏是可以使水产品保持新鲜度且不同于冷藏、冷冻的另一种保鲜技术，而冰温结合气调包装技术是一种提升水产品保鲜的复合保鲜方法。冰温介于0 ℃至冻结点之间，避免了冻结导致的水产品蛋白变性、肌肉组织结构等品质下降问题[4-5]。气调包装通过置换食品贮藏气体环境，隔绝虾肉与氧气接触从而达到抑菌与减缓酶促氧化的效果。研究表明气调（75% CO2+25% N2）结合冰温（-2.3～0 ℃）处理可有效延长新鲜凡纳滨对虾的货架期[6-7]，但仍具有进一步的提升空间。为满足现阶段市场对鲜度的要求，有必要进一步改良现有的保鲜技术。

20世纪末始，分子生物学和细胞遗传学领域揭示了生物细胞的电磁特性及其互作效应，主要是明确了生物体中各类导体、半导体、电介质和带电粒子复杂的凝聚关系[8-9]。这一进步使得静电场技术逐步向食品保鲜领域发展，早在20世纪末，李里特等[10-11]将静电场应用到果蔬保鲜中，发现其能显着影响果蔬的冰温点及生理活动。至今，静电场技术已成为新兴的非热食品保鲜技术，根据输出电压可将静电场分为高压静电场（＞2.5 kV）和低压静电场（≤2.5 kV）[12]。常见的食品腐败菌如大肠杆菌和李斯特菌，经静电场处理后细胞表面的平整度降低，生物膜活性丧失，进而生长和繁殖受到抑制[13]。静电场还被证实可显着抑制罗非鱼肌动球蛋白的Ca2+-ATP酶活性[14]。当静电场联合冰温处理后，该压力场可对极性水分子施加力矩作用来破坏其在分子簇中的平衡状态，从而降低降温过程中晶核形成的临界温度[15]。将该原理应用到食品保鲜后可有望实现对冰温过程中冰晶生长与成核的定向调控。此外，静电场刺激还能促进肉品中肌纤维的舒张，加速僵直期后肉品的成熟，并能改善色泽、汁液损失率和感官特性[16]。相比低压静电场，高压电场在使用中存在较大的安全隐患。而低压静电场通过空间放电可在冷藏库内形成负离子氛围，避免了物料与放电板的直接接触，安全性明显提升，同时也能发挥保鲜效果，近几年来受到了广泛关注[17-18]。因此，低压静电场技术可作为凡纳滨对虾保鲜技术的一种革新思路。本实验通过比较不同贮藏条件下凡纳滨对虾的菌落总数、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、pH值、K值、汁液流失率、白度、感官评分及流变学特性的变化研究低压静电场结合气调包装对冰温下凡纳滨对虾的保鲜效果，旨在为低压静电场在凡纳滨对虾保鲜中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），35～40 只/kg，购于湛江市东风市场。

乙腈（色谱纯） 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；高氯酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂、氯化钠、硼酸、氢氧化钠、轻质氧化镁（均为分析纯） 广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

NF-2多功能静电冷冻实验机 台湾迪弗斯科技股份有限公司；MAP-500D气调保鲜包装机 上海炬钢机械制造有限公司；YP20002电子天平 上海佑科仪器仪表有限公司；SW-CJ-FD洁净工作台 苏州净化设备有限公司；LDZX-50KBS立式压力灭菌器 上海申安医疗器械厂；SPX-150B-Z生化培养箱 上海博迅实业有限公司；KK22F57TI冰箱 德国西门子有限公司；T25数显高速分散均质机 德国IKA公司；PHS-25数显pH计上海精密科学仪器有限公司；VAP450全自动凯氏定氮仪德国格哈特分析仪器有限公司；3K-15台式冷冻离心机德国Sigma公司；1200半制备高效液相色谱仪 美国Agilent公司；HAAKE MARSIII模块化高级流变仪美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

选取大小均一的新鲜凡纳滨对虾，加氧保活运至实验室，用碎冰猝死，冰水洗净、去头、去肠线，沥水晾干备用。剔除破损和鲜度不够的虾，然后将试样个体随机分成4 组，按照包装方式和贮藏条件分别标记为I、II、III、IV。采用气调保鲜包装机，对I、II组样品进行抽真空、充入普通空气后热封，对III、II组样品抽真空、充入气体（体积分数75% CO2+25% N2）后热封，于相应条件下贮藏，具体各组的贮藏条件见表1。其中冰温为（-1±1）℃；静电场条件为：2.5 kV/cm、50 Hz。冰温样品放置于KK22F57TI型冰箱中。冰温与静电场组样品放置于NF-2型多功能静电冷冻实验机。从第0天开始，每隔2 d随机取样测定指标。

表1 实验分组设计Table 1 Experimental design

1.3.2 菌落总数的测定

菌落总数参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》的方法测定。称取25 g碎虾肉，以10 倍系列稀释，选取2～3 个适宜稀释度的样品溶液1 mL，加入15～20 mL平板计数琼脂培养基进行培养，每个稀释度3 个平行。

1.3.3 TVB-N 含量的测定

TVB-N含量参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》的方法测定。称取10 g碎虾肉于消化管中，加入75 mL蒸馏水及1 g氧化镁，采用自动凯氏定氮法进行测定，每组样品做3 次平行检测。

1.3.4 pH值的测定

称取碎虾10.0 g，加90 mL 0.85 g/100 mL无菌生理盐水3 000 r/min 4 ℃下均质2 min，然后在室温（（20±2）℃）下静置30 min，用数显pH计测定pH值。

1.3.5 鲜度指标K值的测定

K值的测定参考Li Qian等[19]的方法稍作修改。取虾肉5.0 g，加入20 mL预冷的体积分数10%的高氯酸（perchloric acid，PCA），4 000 r/min均质30 min后用5 mL体积分数5%的PCA冲洗，然后4 ℃下8 000 r/min离心15 min，取上清液。先后用10 mol/L NaOH和1 mol/L NaOH将pH值调至6.5～6.8，定容至50 mL，再用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，滤液于-30 ℃保存，用于ATP及其降解产物的高效液相色谱分析。

色谱分析条件：色谱柱为高效液相色谱分析Eclips XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.05 mol/L pH 6.8的磷酸缓冲溶液；检测波长254 nm；柱温26 ℃；进样量10 μL。采用外标法定量。

鲜度指标K值按公式（1）进行计算。

式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx分别代表腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、腺苷酸、肌苷酸、肌苷和次黄嘌呤含量/（μmol/g）（结果以湿质量计）。

1.3.6 汁液流失率的测定

汁液流失率的测定参考岑剑伟等[20]的方法，贮藏前称量包装袋质量（m0/g），测定指标时将包装袋剪一小口排尽袋内气体，称取样品、包装袋及残留在包装袋内渗出的肉汁的总质量（m1/g）。小心剪开包装袋，缓慢将袋中的虾取出，称量包装袋和肉汁质量（m2/g）。汁液流失率按式（2）进行计算。

1.3.7 白度的测定

采用便捷式色差仪测定第一腹节中心部位的L*、a*和b*值。每个处理组取10 只虾样进行检测。白度的计算参考Park[21]的方法，具体见式（3）。

1.3.8 感官评价

根据傅德成[22]、Nirmal[23]等的感官评价方法，将虾样置于白色瓷盘或不锈钢工作台上，由10 名感官评定人员对南美白对虾从色泽、气味和肌肉组织3 个方面进行评分，并给出各自综合评分值，分数越高表明越新鲜，5 分以下表明虾已不可食用，评分标准见表2。

表2 凡纳滨对虾感官评分标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of L. vannamei

1.3.9 流变学特性的测定

流变学特性的测定参考郑鸯鸯等[24]的方法稍作修改，流变仪设定条件：转子型号为P35 TiL，振荡模式为Osc，频率为0.1 Hz，应变为1%，平行板间距为2.5 mm；温度范围10～100 ℃，升温速率为2 ℃/min，测定其弹性模量G’的变化。

1.4 数据统计与分析

每个实验重复3 次，数据用平均值±标准差表示，用JMP 10.0软件进行方差分析和Tukey’s HSD多重比较，采用Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对对虾贮藏期间菌落总数的影响

图1 不同处理对对虾贮藏期间菌落总数的影响Fig. 1 Effects of different treatments on total bacterial count of L. vanamei during storage

如图1所示，整个贮藏期间各实验组虾样的菌落总数总体呈持续增长趋势。在贮藏第2天，III、IV组菌落总数下降，归因于充入的CO2在凡纳滨对虾中部分溶解使得pH值下降而产生了抑菌效应[25]。研究表明菌落总数不超过5.0（lg（CFU/g））为一级鲜度，在5.0～5.7（lg（CFU/g））之间为二级鲜度[26]。I组的菌落总数上升趋势较快，在第6天超过6.0（lg（CFU/g）），达到贮藏终点，II、III组贮藏效果较优，第10天菌落总数分别为6.12（lg（CFU/g））和6.08（lg（CFU/g））。IV组抑菌效果最佳，在第14天才达到6.04（lg（CFU/g））。总体而言，静电场联合气调包装对凡纳滨对虾冰温保鲜具有正相关效应，可使货架期由6 d延长至14 d。其机理可解释为静电场通过改变腐败菌细胞膜内外电势，从而影响其生长繁殖，达到抑制或杀灭微生物的目的[27]。

2.2 不同处理对对虾贮藏期间TVB-N含量的影响

图2 不同处理对对虾贮藏期间TVB-N含量的影响Fig. 2 Effects of different treatments on TVB-N content of L. vanamei during storage

TVB-N是水产品在贮藏过程中蛋白质分解产生的氨、胺类等具有挥发性碱性含氮物质的统称，主要由内源酶代谢和细菌繁殖引起，其含量是肉制品和水产品鲜度的主要卫生评价指标[28]。由图2可以看出，凡纳滨对虾TVB-N初始含量为10.77 mg/100 g，贮藏期间各实验组TVB-N含量均有不同程度的上升。其中I组在第6天即达到31.24 mg/100 g，超过生鲜水产品TVB-N含量的安全限值（30 mg/100 g[29]）。II组上升趋势略微缓慢，这是由于低压静电场对微生物生长繁殖及内源酶的抑制作用，延缓了因细菌生长导致的虾肉蛋白分解[30]。III组的CO2气体同样可以抑制大多数微生物的生长，且优于II组。贮藏第8天，II组样品TVB-N含量已达到31.02 mg/100 g，并散发轻微腥臭味。贮藏第4天起，各实验组差异显着（P＜0.05），说明低压静电场与气调包装在贮藏后期均可显着降低TVB-N的产生，且IV组直至贮藏第14天才超过30 mg/100 g。

2.3 不同处理对对虾贮藏期间pH值的影响

图3 不同处理对对虾贮藏期间pH值的影响Fig. 3 Effects of different treatments on pH of L. vanamei during storage

pH值可以作为虾肉鲜度的一项重要参考指标[31]。一般来说，水产动物死亡后pH值呈现先降后升的趋势，前期下降是由于虾死后体内糖原的无氧酵解生成了乳酸等酸类物质，后期随着微生物活动和内源酶作用逐渐上升。如图3所示，各实验组在贮藏的前2 d均有不同程度下降，其中Ⅲ组下降程度最大，是因为部分CO2气体溶入肌肉，使得pH值下降更为显着[32]。2 d后各组样品pH值开始持续上升，是由于贮藏后期微生物活动和内源酶的作用，肌肉蛋白质被分解产生含氮类物质致使pH值上升[33]。I、II组pH值在贮藏的前4 d无显着差异（P＜0.05），从第6天起II组较低于I组，证明低压静电场对贮藏前期pH值无显着作用。贮藏过程中Ⅲ组对虾pH值均显着低于I、II组，且波动较大，说明CO2气体能显着减缓pH值上升，但随着贮藏时间的延长，其作用力会逐渐减弱。IV组样品pH值从第4天起缓慢上升，随着贮藏时间延长pH值波动不大，在贮藏前期下降速度慢于单纯气调组（III组），这可能是低压静电场改变了水分子的存在状态[15]，改善了CO2在虾肉中的溶解程度。贮藏后期IV组样品pH值上升趋势平稳，且上升速率比单纯静电场组慢，可解释为气调包装和低压静电场对微生物抑制的协同作用。pH值若接近初始pH值，则表明该样品的新鲜度较好[34]。可见，低压静电场结合气调包装组（IV）对冰温贮藏的凡纳滨对虾pH值的保持效果最好。

2.4 不同处理对对虾贮藏期间K值的影响

K值是以核苷酸的分解产物作为指标的鲜度判定方法，是对ATP降解产物分别进行定量而求得的比值。由图4可知，贮藏过程中各组样品均呈线性上升趋势但程度不同。I组的K值随着贮藏时间延长增长最快，在第6天达到56.8%，II组样品在第8天超过60%，III组样品在第10天K值未超过50%。而Ⅳ组样品在贮藏2 d后均显着低于其他各实验组，K值上升速率相对缓慢，贮藏第14天仍未超过40%，这说明冰温条件下，低压静电场结合气调包装能较好地保持虾肉K值，能延缓核苷酸的降解。贮藏第4天起，各实验组差异显着（P＜0.05），这与TVB-N含量变化趋势一致。

图4 不同处理对对虾贮藏期间K值的影响Fig. 4 Effects of different treatments on K-value of L. vanamei during storage

2.5 不同处理对对虾贮藏期间汁液流失率的影响

图5 不同处理对对虾贮藏期间汁液流失率的影响Fig. 5 Effects of different treatments on drip loss of L. vanamei during storage

贮藏期间微生物的生长繁殖以及冰温保鲜过程冰晶的形成破坏肌肉组织结构，都会引起细胞汁液流失。汁液流失过多会引起虾肉色泽暗淡，肉质口感下降，营养成分也会随之流失，这将影响到产品的销售。同时流失的汁液将成为微生物生长繁殖的优质培养基。由图5可知，冰温条件下，各实验组样品随贮藏时间汁液流失率呈快速上升趋势。贮藏前4 d，II组样品汁液流失率略高于I组，原因应该是静电场使水发生共鸣现象，引起水结构及结合状态发生变化[35]，使得食品中部分水更易丢失。贮藏第2天，III组样品汁液流失率高于其他各实验组，这是CO2溶解于虾肉减弱了虾肉的持水力造成组织液的渗出引起[36]。第6天时，III组样品汁液流失率低于I组，这可能是贮藏后期微生物的大量繁殖破坏了细胞结构，而CO2气体对微生物的抑制作用大于其对汁液流失的影响所致。IV组样品汁液流失率在整个贮藏过程中均保持着缓慢的上升趋势，至第14天时，IV组汁液流失率为2.2%。这说明冰温条件下，静电场结合气调包装能显着抑制虾肉样品汁液流失。

2.6 不同处理对对虾贮藏期间白度的影响

图6 不同处理对对虾贮藏期间白度的影响Fig. 6 Effects of different treatments on whiteness value of L. vanamei during storage

色泽是评价食品感官的重要指标，其直接关系到产品的市场价值及消费者的购买欲望。色泽的明暗程度与物体表面的光反射率有关，而食品内水分含量变化、肌球蛋白质变性均可导致食品表面散射强度加强使得白度上升[37]。从图6可以看出，I组样品总体呈快速下降趋势，II组呈先上升后下降的趋势，这可能是II组贮藏前期褐变还未开始，静电场使水发生共鸣现象，引起水结构及结合状态的改变导致散射强度加强，使得白度上升。III组样品因CO2气体溶入虾肉引起虾中蛋白变性，导致散射强度加强，使得白度上升[38]。贮藏第2天起，I组白度下降速度加快，且白度明显低于其他实验组，这说明单纯冰温结合普通空气包装很难维持良好的虾肉色泽。贮藏第6天，各组间白度差异显着（P＜0.05），这可能是PPO与微生物共同作用的结果。总体来看，贮藏期间IV组样品白度保持较好，显着高于各实验组（P＜0.05），至第14天时，依然在一个较高的水平。说明冰温条件下，低压静电场结合气调包装对凡纳滨对虾的白度有较好的保持作用。

2.7 不同处理对对虾贮藏期间感官评分的影响

表3 不同处理对对虾贮藏期间感官评分的影响Table 3 Effects of different treatments on sensory quality of L. vanamei during storage

由表3可知，各实验组感官评分随时间呈现下降趋势，其中I组随贮藏时间延长呈显着下降趋势，在第6天时超出可接受值。II、III组自贮藏第6天起随时间的延长感官评分变化差异不显着（P＜0.05），但显着高于I组，表明低压静电场和气调包装对凡纳滨对虾的感官品质均具有保护作用，这是由于气调包装改善了贮藏环境并保持相对稳定从而抑制了产品的变质过程。低压静电场同样通过抑制内源酶的活性以及减缓微生物的生长速率来达到维持样品感官品质，但相比气调包装效果略差，因此II组的感官评分低于III组。而IV组在贮藏期间感官评分始终显着高于其他实验组，说明低压静电场结合气调包装对冰温贮藏下凡纳滨对虾的保鲜具有协同作用。

2.8 不同处理对对虾贮藏期间流变学特性的影响

图7 不同处理的对虾贮藏期间G’变化Fig. 7 Effects of different treatments on G’ of L. vanamei during storage

在温度扫描过程中，虾肉中肌原纤维蛋白和肌球蛋白形成热诱导凝胶，发生了向凝胶态的转变，致使虾肉蛋白的流变学特性也随之发生了改变。加热过程中G’随着温度上升呈现波浪式增长，此过程可划分为凝胶预备区、凝胶弱化区和凝胶加强区。由图7可以发现，各实验组G’随着贮藏时间的延长呈下降趋势，II、III、IV组虾肉蛋白G’总体大于I组。贮藏第2天，III组虾肉蛋白G’小于I组，这是因为III组CO2气体溶入虾肉，一方面减弱了虾肉的持水力造成肌肉组织结构松散；另一方面pH值的改变使得部分蛋白质变性，都影响了虾肉蛋白的G’[38]。而同样充入CO2气体的IV组虾肉蛋白G’在贮藏第2天时优于Ⅲ组，这说明电场能一定程度弥补CO2气体对虾肉质构带来的负面影响。贮藏第2天起，I、II组G’下降迅速，可能是低压静电场的作用力效果较弱，无法有效抑制微生物的大量繁殖，同时低压静电场组汁液流失率较高都不利于虾肉蛋白热诱导凝胶的形成。郑鸯鸯等[24]的研究结果也表明，贮藏后期虾肉蛋白G’下降，是因为微生物作用加强，微生物的大量繁殖破坏了虾肉组织，加速了虾肉软化，在G’上占据主导作用。III、IV组在贮藏后期G’各阶段变化不明显。IV组样品G’总体上高于其他实验组，说明IV组样品最终形成的凝胶弹性优于其他实验组，从而揭示了冰温条件下，低压静电场结合气调包装可一定程度减缓虾肉蛋白的软化。

3 讨 论

虾类因其高蛋白、低脂肪等优点，在维持膳食结构平衡中的权重较高，与其他肉品相比，虾在流通环节易发生腐败和黑变。主要归因有二[39]：一是虾类集中捕捞后存活率低，头胸甲易脱落，有利于腐败菌的生长与繁殖，同时虾头中强活性酪氨酸及酶类的释放加速了虾体黑变；二是虾类集中捕捞期多处于高温季节，捕捞点与贮藏或加工点距离较远，有利于微生物的生长繁殖。因此，原料虾运至贮藏或加工点后应及时进行预处理。生产实践表明：去除虾头及肠线可降低虾的初始菌落总数，且能延缓虾体的黑变，贮存成本亦随约1/3虾体积减少而降低，具有实用性[40]；区别于冻藏，食品在冰温带可有效避免其因冻融而导致的蛋白质变性、组织损伤和汁液损失，且保质期长于冷藏保鲜。为此，加工前期在冰温环境下贮藏去头虾的库存模式逐步在企业中普及，但贮存期一般不超过一周。本实验发现，采用低压静电场结合气调包装后，去头虾的货架期由6 d延长至14 d，有效减少了因腐败而造成的经济损失。综合文中贮藏指标，冰温条件下气调结合低压静电场表现出优异的保鲜效果，能有效抑制微生物生长繁殖、减缓腐败进程中TVB-N含量、pH值、K值增加。其保鲜原理是利用了低压静电场和气调包装对微生物抑制和对内源代谢酶钝化的协同作用[17]。低压静电场条件下无论是气调包装还是空气包装，虾肉软化均得到有效的减缓，其中高体积分数的CO2在贮藏初期会加速虾肉软化并导致汁液流失加快，但结合低压静电场之后，虾肉软化速率明显减缓，这表明低压静电场能明显改善虾肉蛋白软化[41]，并能减弱气调包装对虾肉流变学特性的不利影响，在贮藏后期虾肉流变学特性依然明显优于其他组。蛋白质的降解是腐败微生物以及内源代谢酶的共同作用，研究表明电场可以有效延缓蛋白质的降解速率，其钝酶原因主要是同内源酶的二级和三级构象之间的破坏有关[42]。

4 结 论

低压静电场（2.5 kV/cm、50 Hz）结合气调包装（75% CO2+25% N2）可使凡纳滨对虾的冰温贮藏期由6 d延长至14 d，贮藏期间微生物指标、理化指标和感官特性均相比其他组较优。可见，低压静电场结合气调包装可有效延长冰温凡纳滨对虾的货架期，并能延缓期间的品质劣变，具有潜在的应用前景。而有关静电场对凡纳滨对虾的保鲜机制以及与气调包装的协同机理有待进一步研究。