薛 辉，涂勇刚，熊春红，李建科，罗文翔，赵 燕,*

（1.南昌大学 生物质转化教育部工程研究中心，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西农业大学食品科学与工程学院，江西 南昌 330045）

抗菌肽，又称抗微生物肽，是一类具有抑菌功能的特殊生物活性肽。抗菌肽一般由15～50 个氨基酸构成，带正电荷，呈两亲性，它们的分子质量相对较小，容易到达被感染的位置[1-2]，且有广谱抗菌活性；抗菌肽具有不同于传统抗生素的作用机制，不易产生耐药性，因此被认为是最有希望代替抗生素的物质[3-6]。抗菌肽除了在医药领域最有希望替代抗生素外，在食品、饲料行业也有广泛的应用，目前被批准用作食品添加剂的抗菌肽有Nisin（乳酸链球菌素）[7]和ε-聚赖氨酸[8]。在动物饲料中添加少量的抗菌肽就可以达到增强动物免疫能力、提高饲料利用率的效果；还可以降低抗生素的使用量，减少人们因食用了被抗生素污染的畜禽制品而产生的一系列问题[9-11]。抗菌肽的诸多优点使其成为食品、生物、医药等领域的研究热点，自从上世纪八十年代瑞典科学家Boman从惜古比天蚕中发现了第一个抗菌肽——天蚕素，之后有很多抗菌肽被发现[12-13]。从来源广泛、成分复杂的原料中筛选出抗菌肽是其研究和广泛应用的前提和关键，传统的筛选方法多以体外抑菌活性为导向，采用提取、分离、纯化、结构鉴定等步骤进行跟踪式筛选抗菌活性组分，其往往费时费力且效果不佳；而近年来出现的细胞膜色谱法等快速筛选方法具有新型、高效、靶向性强的优点，其大大提高了抗菌肽的筛选效率，成为目前人们研究的热点。无论是传统筛选方法还是新发明的快速筛选方法，从天然资源的宝库中获得抗菌肽一般包括抗菌粗肽的制备和抗菌肽的筛选两大步骤。

1 抗菌粗肽的制备

抗菌肽广泛存在于多种生物体内，是生物机体抵抗病原体侵害的第一道防线，且在不同的生物体内存在的部位也是不一致的，如两栖动物的皮肤黏液，哺乳动物的血液和肠道、微生物的次级代谢产物等。对于来源如此复杂的抗菌肽，一次性直接提取抗菌肽难度较大，因此，需要首先制备抗菌粗肽，然后再从抗菌粗肽中筛选抗菌肽，而抗菌粗肽的制备首先考虑的是预处理方法，根据原材料的不同选择不同的预处理方法。抗菌肽广泛存在于自然界生物中，对于自然存在于生物体内的或诱导生物体产生的天然抗菌肽，多采用溶剂提取法将其从原料中提取，其中乙酸是使用频率最高的提取剂。Chaparro等[14]用乙酸浸提除去头部和钳子的巴西蜈蚣，经冰浴搅拌、离心等步骤制得抗菌粗肽。溶剂提取法是提取抗菌粗肽最常用的方法，其操作简单；但是该法提取效果相对较差，且容易破坏对酸或者高浓度盐敏感的抗菌肽，使其失活，减少抗菌肽的种类，并且产生较多有毒有害的废料，对操作人员和环境的伤害较大。对于蛋白质含量较高的原料和微生物的次级代谢产物常使用硫酸铵沉淀法，该法利用高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来的原理，其技术含量相对较低，易操作。Regmi等[15]取泡菜中分离的植物乳酸杆菌用硫酸铵粗提得到抗菌粗肽。硫酸铵沉淀是盐析的原理，跟蛋白（肽）的疏水性质有关，经硫酸铵沉淀后，部分抗菌肽可能在上清液中，部分会在硫酸铵的作用下沉淀，如果只在其中一部分筛选可能会导致抗菌肽“丢失”。蛋白酶限制性酶解富含蛋白质的原料也是抗菌肽的制备途径之。Bougherra等[16]用细胞外丝氨酸金属蛋白酶酶解牛酪蛋白得到粗肽。该方法反应条件温和，反应过程容易控制，并且本身无抗菌作用的蛋白质也可能通过酶解的方法获得抗菌活性，而抗菌蛋白也可以作为酶解作用的前体物质释放一些新的抗菌肽类；因此蛋白酶酶解法可能开辟一条新型的大规模制备有效、安全性高抗菌肽的具有成本效益的战略之路[17]，但是该方法水解产物复杂，易导致后续分离难度加大，分离成本增加。

其他制备方法如超滤等也曾用于抗菌肽的研究中，但溶剂提取法、硫酸铵沉淀法、蛋白酶酶解法这几种方法比较常用，存在各自的特点（表1），具体可根据原料和目的的不同选择以获得预期的效果。

表1 抗菌粗肽制备方法的比较Table 1 Comparison of preparation methods for crude antibacterial peptides

2 抗菌肽的快速筛选

抗菌粗肽的纯度和抗菌效果均难达到研究和应用的要求，为此还需对抗菌粗肽进行再次筛选。研究初期常使用传统的筛选方法，它是把制备好的抗菌粗肽经RP-HPLC、凝胶层析等反复纯化，结合抗菌实验以得到纯的单一抗菌肽，此类筛选方法又称作“活性制导纯化”[33]，Maria等[21]取巴西的Lecythy pisonis树的种子，经石油醚脱脂后，于含体积分数1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1 mol/L HCl、体积分数5%甲酸和质量分数1% NaCl的溶液中浸提1 h，离心后经C8和C18RP-HPLC分离，将分离得到的组分进行抑菌检测，取其中最强抑菌的组分F4再次经C18RP-HPLC分离，再次做抑菌实验，得到最强抗菌活性组分F4.7'命名为L.pisonisdefensin1，其氨基酸序列为DVCESQSHRFHGA CVSNTNCANVCRTEGFPGGHCRG，该抗菌肽对白色念珠菌具有极强的抑菌活性，研究表明其是通过损害细菌的线粒体使细菌死亡从而达到抑菌效果。传统方法靶向性不强、耗时耗力、成本较高，多用于科学研究。

随着抗菌肽研究的不断深入，越来越多的快速筛选方法逐渐被人们发现，初期快速筛选的方法是根据抗菌肽的抗菌机制而发展起来的。抗菌肽来源广泛、种类繁多，目前还没有统一的适用于所有抗菌肽的抗菌机制；但无论抗菌肽采用何种作用方式，大多数抗菌肽都会与细菌细胞膜发生作用，这也是目前大部分抗菌肽快速筛选的理论依据，但是这些方法一般一次性只能提取几种抗菌肽；后来有学者从分子和基因角度进行研究，发明了能一次筛选多种抗菌肽的方法。与传统筛选方法相比，快速筛选方法具有靶向性、高效性。目前有报道的快速筛选方法包括抗菌肽-细菌吸附结合法、细胞膜色谱法、模拟细胞膜色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱自显影法和高通量测序法等。

2.1 抗菌肽-细菌吸附结合法

抗菌肽-细菌吸附结合法是利用抗菌肽与微生物作用前期与细菌膜吸附结合的原理，通过对比与微生物孵育前后液相色谱或凝胶过滤层析图谱，找出孵育后减少或消失的峰，收集减少或消失的峰即可能是潜在抗菌肽（抗菌粗肽中的抗菌肽与细菌吸附结合使得其含量减少）。高飞[34]取蝇蛆和大豆蛋白经粗制备后，与培养至对数期的大肠杆菌充分混合孵育，经离心后过滤、冷冻干燥得到孵育后样品，然后将孵育前后的样品经超高效液相色谱分析，筛选出减少或消失的峰，分别命名为HLP7和HLP8（蝇蛆），FSP6、FSP8和FSP9（大豆），经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定其氨基酸序列分别为：KPPLNGPAL、QPVYHWYWH、VVTSSSLP、RMRLLLRRKGGQ和RVLLLPAFAEK，这5 个组分对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、枯草杆菌与金黄色葡萄球菌等致病菌均具有较强的抗菌活性，其中FSP8和FSP9对工程菌也有抗菌活性。郝刚等[35]以牦牛血的胰蛋白酶水解液为原料，用此法得到抗菌肽YakB-1和YakB-2，两者对细菌和真菌都具有抗菌活性，总体上说抗菌肽YakB-2对细菌的抗菌活性比YakB-1强，但是YakB-1对真菌的抑菌活性更强。

该方法通过对比粗肽经细菌混合孵育前后所得液相的差异峰即可锁定抗菌肽所在峰位置，与传统方法相比，大幅缩短了筛选时间，但是使用的活体细菌除了会吸附抗菌肽外，还可能会吸收粗肽中的一些营养物质导致峰减少或者消失，使得收集的峰不全是抗菌肽，其准确性相对低，加大了后面分离的难度，仅适用于科研层面对抗菌肽的研究。

2.2 细胞膜色谱法

细胞膜色谱法是将活性组织细胞膜结合到特定载体表面制成细胞膜固定相，再利用色谱学技术研究流动相中药物与与固定相上细胞膜及膜受体的相互作用规律的受体动力学新方法。被分析成分如果与特定的细胞膜受体存在特异性结合，就可在细胞膜色谱模型中反映出来。该法由贺浪冲等[36]首创，起初是用于中草药中药效成分的筛选，后来根据该法的原理结合抗菌肽的作用机制将其用于抗菌肽的研究。Xiao Jianhui等[37-39]先将脱毒后的麻风树籽粕用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等蛋白酶酶解，经离心、过滤后得到粗肽。然后用活化好的大孔硅胶与大肠杆菌的细胞膜（大肠杆菌已用细胞破碎仪破碎，只剩下细胞膜）融合，形成大肠杆菌细胞膜固定相，最后用酶解后的粗肽与大肠杆菌细胞膜固定相反应，得到反应后的样品，将反应前后的样品进行超高效液相色谱分析，比较两者指纹图谱差异，收集的差异峰分别命名为抗菌肽JCpep7和JCpep8，经基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱鉴定其氨基酸序列分别为Lys-Val-Phe-leu-Gly-leu-Lys和Cys-Ala-Ile-Leu-Thr-His-Lys-Arg，这两种抗菌肽对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌与肺炎链球菌均有抗菌活性，JCpep7和JCpep8对热稳定性相对较强，并且对胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶具有一定的抵抗力，JCpep8在低浓度下还不会出现溶血现象和血凝集反应，可以作为一种注射剂在医学中使用。苑华宁[40]用类似的方法从牛酪蛋白中分离出一种抗菌肽Cpep11，其氨基酸序列为Leu-Arg-Leu-Lys-Lys-Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu，它对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果最强。

该方法原理与抗菌肽-细菌吸附法相似，且同样具有快速筛选抗菌肽的优点，与抗菌肽-细菌吸附法相比，不存在因活体细菌吸收营养物质而导致准确性相对较低的现象，但是该方法操作复杂，需将收集的菌膜包裹在大孔硅胶中，并保持其活性，活体细菌细胞膜的制备较为繁琐，且在筛选条件下易失去活性，使用寿命短，获得的抗菌肽较少，成本相对较高。

2.3 模拟细胞膜色谱法

模拟细胞膜色谱法是基于抗菌肽优先作用于细胞膜中特定磷脂特性的原理而发明的一种方法[41]，根据磷脂分子能在水相中自发形成稳定的脂质双层膜的特点构建模拟细胞膜并运用抗菌肽与膜磷脂结合的原理来连续性分离抗菌肽。Tang Wenting等[42-46]在模拟细胞膜构建并将其用于抗菌肽靶向性筛选方面做了系列研究工作，利用3 种不同脂质来源的模拟细胞膜，从3 种原料中成功筛选出3 种新型抗菌肽。首先向活化好的大孔硅胶中添加磷脂酰胆碱/磷脂酰甘油复合物来构建模拟细胞膜固定相，采用磷脂模拟细胞膜固相萃取联用HPLC筛选出卵白蛋白胃蛋白酶酶解产物中的抗菌肽Opep12，其氨基酸序列为RVASMASEKMKI；鉴于真实细菌细胞膜磷脂构成的复杂性，从大肠杆菌细胞中提取脂质，将其涂敷于硅胶载体表面并水化，构建大肠杆菌模拟细胞膜固定相。然后将该固定相装填于不锈钢柱中，建立大肠杆菌模拟细胞膜色谱法，并采用该方法筛选到鳀鱼粗肽提取物中的抗菌肽Apep10，其氨基酸序列为GLARCLAGTL；最后取鳀鱼蒸煮液蛋白的Protamex水解产物，向活化好的大孔硅胶中添加金黄色葡萄球菌脂质来构建模拟细胞膜固定相，通过HPLC技术得到了抗菌肽ACWpep10，其氨基酸序列为GLSRLFTALK。其中Opep12、Apep10和ACWpep10带1～2 个净正电荷，它们对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和痢疾志贺氏菌等均有很好的抑菌效果，Opep12和ACWpep10在较低浓度下还不会出现溶血现象。

该方法在细胞膜色谱法的基础上再次拓展，用模拟细胞膜代替菌膜包裹大孔硅胶，减少了菌膜收集和菌膜活性的问题，与细胞膜色谱法相比具有可选择性多、使用寿命长、操作相对简单、耗时短等优点，如在保证模拟细胞膜仿真性的基础上提高其稳定性，有望实现模拟细胞膜在抗菌肽规模化生产中的应用；但是该方法不能完全模拟活性细胞膜，与抗菌肽作用于活性细胞膜还有一定区别。

2.4 毛细管电泳法

毛细管电泳法是利用抗菌肽与菌膜结合的原理，建立抗菌肽与活菌结合的毛细管电泳模型，利用该模型中的抗菌肽与菌体存在的特殊亲和力的作用，快速筛选出抗菌肽的方法，这是近年来发明的一种快速筛选抗菌肽的方法，目前技术还不是很成熟，国内外的报道也较少，而且多为对其条件的研究。Tůmová等[47]取GIMSSLMKKLAAHIAK、GMWSKILGHLIR等12 种已知氨基酸序列的抗菌肽，运用毛细管电泳法测定抗菌肽的有效电荷、离子迁移率和其他物理化学参数，并证明了抗菌肽的有效电荷和相对分子质量的比例与抗菌肽的离子迁移率有很好的相关性。Tůmová等[48]取Gly-Met-Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu、Trp-Ser-Lys-Ile-Leu-Gly-His-Leu-Ile-Arg等8 种已知氨基酸序列的抗菌肽，发现毛细管电泳柱在pH 2.00～12.25之间有较好的稳定性。Xia Zhijun等[49]取酵母发酵液的粗制备样品，加入到自由流动电泳中分离，将分离得到的抗菌肽进行Tricine-SDS-PAGE和ImageJ软件定量分析，发现其分子质量分别为5.5 kDa和7.0 kDa，并且有87%纯度和89%的回收率，并且对大肠杆菌具有很好的抑菌效果。

该方法理论上来说具有产量高、重现性好、耗时短等优点，该技术可能加速抗菌肽在制药和临床领域的发展，是一种快速筛选天然抗菌肽的方法，而且能够实现活菌条件下抗菌肽与菌膜结合机制的探索，但是该方法技术上还不够成熟，还有很多理论问题待解决。

2.5 薄层色谱自显影法

薄层色谱自显影法是利用抗菌物质具有抑菌效果而发明的一种方法，通常用于筛选植物或细菌代谢物中的抗菌化合物[50-52]，后来有人将这种方法用于抗菌肽的研究。Jaskiewicz等[53]首先取Silica gel 60RP-18 F254S、Nano-SIL 20 UV 254等多种薄层色谱板进行预实验，发现只有Nano-SIL 20 UV-254和Nano-ADAMANT UV 254薄层色谱板是足够稳定且分离效果较好的，然后取Nano-SIL 20 UV-254和Nano-ADAMANT UV 254薄层色谱板施加GLFDVIKKVASVIGGL、KWKLFKKIGAVLKVL等多种已知氨基酸序列的抗菌肽和未分离的抗菌粗肽及ICHHCI-OH、Pal-K(TFA)K(TFA)-NH 2等无抗菌效果的多肽并经展开剂分离，接着接种细菌后恒温培养，最后喷洒细胞活力试剂刃天青溶液进行显色反应，结果显示添加抗菌肽的薄层色谱板出现了白色抑菌圈，而添加无抗菌效果的多肽则未出现，证明了抗菌肽可以被这种方法分离。

该方法利用抗菌肽对细菌的抑菌能力能间接用染色剂显示，从而从薄层色谱板中筛选出目标肽，其理论上具有目标性强、耗时短等优点，而且可以一次性筛选出多种抗菌肽，可能在未来实现规模化筛选抗菌肽，但是该方法需在无菌条件下操作，且对培养时间要求苛刻，对技术要求较高，而且较难分离成分复杂的粗肽，目前技术上还不够成熟，还有很多基础问题需要研究，如展开剂的选择、展开时间、接种细菌浓度等。

2.6 高通量测序法

高通量测序法是一种能一次性对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的方法，并可能对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析。目前，高通量测序主要应用于寻找疾病的候选基因上[54]，但是近年来也有学者运用这种方法筛选抗菌肽。有研究表明，抗菌肽的基因具有同源序列相似性的特点[55-56]，Yi Yunhai等[57]根据这一特点，收集大弹涂鱼和大鳍弹涂鱼这两种有代表性的两栖涂鱼的转录组和基因组，在BLAST上对照之前组装的标准同源性基因组和转录组数据进行搜索，结果鉴定出507 条抗菌肽转录本，共30 组，其中含有两组高活性抗菌肽——血红素和淀粉体，它们在对外源病原体中能发挥重要作用。在这些鉴定的抗菌肽中，449 条抗菌肽序列是未曾被报道的，48 条是在大弹涂鱼和大鳍弹涂鱼中共有的序列，用化学合成其中的血红蛋白β1和胰淀素，发现它们对藤黄微球菌具有较强的抑菌活性。这是首次报道应用高通量技术将基因组学、转录组学和蛋白质组学数据结合来鉴定抗菌肽。该方法具有高效、快速、全面等的特点，而且可以一次性获得大量的抗菌肽，为抗菌肽建立数据库，是一种技术含量很高且新颖的方法，但是该方法也有很大局限性，它必须依靠已知的抗菌肽基因为模板预测抗菌肽基因序列，并且只对同源性物种有效。

综合抗菌肽快速筛选的全过程，前4 种均是基于肽-膜相互作用的原理，但研究方法和技术手段却在不断更新，从与活体细菌直接作用的抗菌肽-细菌吸附结合法，到基于抗菌肽与细菌细胞膜间存在特异亲和力而建立的活菌细胞膜色谱法，再到基于抗菌肽优先作用于细胞膜中的特定磷脂特性而构建的模拟细胞膜色谱法，随着研究的逐渐深入，筛选的靶向性、准确性和效率都在逐步提高，但前4 种方法均不能大量地筛选抗菌肽，且只能筛选出能与细胞膜特异性反应的抗菌肽。而近些年发明的薄层色谱自显影法虽然可以筛选出较多抗菌肽且对所有的抗菌肽均有效果，但目前其技术上不成熟，还需深入研究；而高通量测序法可以筛选出大量的抗菌肽，但其需要有同源基因模板和基因库作为基础，成本较高且对实验设备的要求较高。综合各快速筛选方法的特点如表2所示。

表2 抗菌肽快速筛选方法的比较Table 2 Comparison of rapid screening methods for antibacterial peptides

3 结 语

抗菌肽因为其特有的抗菌优势成为学者们的研究焦点，从步骤繁琐、分离效率低下的传统筛选方法到操作简单、准确性高的快速筛选方法，抗菌肽的筛选速度得到了大幅提高，但是目前应用的模拟细胞膜色谱法等方法还不能模拟成完整的细胞，不能筛选出原料中全部的抗菌肽，也不能大批量的筛选抗菌肽，而那些可以大批量筛选抗菌肽的方法也有较大的局限性。因此，探寻快速、高效、灵敏、高通量的筛选策略是抗菌肽的主要研究方向之一。除了快速筛选外，规模化制备也是抗菌肽能广泛应用面临的巨大瓶颈。关于抗菌肽的作用机理，目前被学者普遍接受的是膜作用机理，但其具体抗菌作用的多样性与机制仍需深入研究。在此基础上，利用抗菌肽的抑菌机理来研发新的抗菌肽的快速筛选技术，使其在发现更多新抗菌肽、丰富抗菌肽库和规模化开发利用抗菌肽资源方面发挥越来越大的作用。