王祖文，杨忠敏，黄先智，丁晓雯,*

（1.西南大学食品科学学院，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400716；2.西南大学科技处，重庆 400716）

肝纤维化是由各种刺激如病毒感染、乙醇、药物毒性或其他因素诱导的慢性炎症反应的最终结果[1-2]。肝纤维化也是肝损伤发展至肝硬化的中间环节，延缓或逆转肝纤维化的发生是治愈大多数慢性肝病的关键[3]。

大量研究表明，天然活性成分如总生物碱类（排钱草生物碱[4]、巴莲莲子生物碱[5]和小檗碱[6]）、多糖类（黄芪多糖[7]和杜仲多糖[8]）、酚类物质（姜黄素[9]和白芦藜醇[10]）等具有抗肝纤维化的作用。桑叶广泛分布于全国各地，作为中药的历史源远流长。《中国药典（2015版）》中记载桑叶甘、苦，寒，归肺、肝经，具有疏风散热、益肝通气、清肝明目等功效[11]，桑叶营养丰富、无毒副作用，可作为药食两用植物。桑叶生物碱作为桑叶的一种特征活性成分，具有降糖[12]、降脂[13]、抑制病毒活性[14]、抗肿瘤细胞生长[15]和减轻肾损伤[16]等作用。本实验室前期研究结果表明，桑叶生物碱能显着降低高脂饮食诱导的肝损伤小鼠血浆谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性，调节肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）和细胞凋亡因子Bcl-2与Bax mRNA表达水平，对高脂饮食引起的肝损伤有显着改善作用[17]。基于前期研究结果，本实验利用低剂量（体积分数10%）四氯化碳（CCl4）橄榄油溶液联合高脂饮食建立小鼠肝纤维化模型，通过灌胃不同剂量桑叶生物碱，观察桑叶生物碱对肝纤维化小鼠肝功能、肝纤维化的改善作用，旨在为桑叶资源的合理利用以及作为保肝食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级雄性昆明小鼠（4 周龄，体质量（20±2）g；生产许可证号：SCXK（渝）2018-0003；使用许可证号：SYXK（渝）2018-0003）和基础饲料由重庆医科大学实验动物中心提供。高脂饲料为实验室自制，配方参照文献[17]，并进行适当修改：基础饲料69.5%（质量分数，下同）、猪油12%、蔗糖10%、蛋黄粉4%、胆固醇4%、胆酸钠0.5%。

桑叶粉末由重庆畜牧科学院蚕业研所提供；桑叶生物碱为重庆市农产品加工及贮藏重点实验室自制，方法参照文献[18]；采用硅钨酸沉淀法[19]测得样品中总生物碱质量分数为93.57%。

橄榄油、CCl4成都市科龙化工试剂厂；水飞蓟宾（纯度≥98%） 南京道斯夫生物科技有限公司；AST、ALT、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、总胆红素（total bilirubin，TBil）、直接胆红素（direct bilirubin，DBil）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；透明质酸（hyaluronic acid，HA）、层黏连蛋白（laminin，LN）、IV型胶原（type IV collagen，IV-C）、III型前胶原（type III precollagen，PC-III）酶联免疫吸附检测试剂盒 上海优选生物科技有限公司；31050102W型组织包埋盒 江苏世泰实验器材有限公司。

1.2 仪器与设备

ALPAAI-4LSC型高速离心机 德国CHRIST公司；DW-HL438型超低温冰箱 合肥美菱股份有限公司；XW-80A型微型漩涡旋混仪 上海精科实业有限公司；Synergy H1型酶标仪 美国基因有限公司；DHP-9082型恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；5880R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；EG1105H型石蜡切片机 德国徕卡公司；生物显微镜 日本OLYMPUS株式会社。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组及处理

本实验获得西南大学实验动物保护协会许可，小鼠按照西南大学实验动物保护和使用规则饲养，室温22～25 ℃，相对湿度40%～60%，12 h明暗交替（9∶00－21∶00），自由进食饮水。60 只昆明种小鼠适应性喂养7 d后，随机分为6 组，分别为正常对照组、模型组、阳性药物组、桑叶生物碱低、中、高剂量组，每组10 只。除正常对照组，其余各组小鼠均腹腔注射体积分数10% CCl4橄榄油溶液（5 mL/kgmb），每隔1 d注射1 次，持续8 周，并在此期间给予高脂饲料，建立小鼠肝纤维化模型；正常对照组小鼠腹腔注射等量橄榄油，并给予基础饲料。以正常对照组与造模小鼠之间血浆ALT、AST活力和肝纤维化4 项指标差异显着，且肝纤维化小鼠肝脏组织病变明显、胶原沉积，判定造模成功。待造模成功后，分别以低（50 mg/kgmb）、中（100 mg/kgmb）、高（200 mg/kgmb）剂量桑叶生物碱溶液和阳性药物水飞蓟宾溶液（100 mg/kgmb）灌胃小鼠，正常对照组和模型组给予等量蒸馏水（10 mL/kgmb），每日1 次，连续灌胃45 d，同时喂饲基础饲料。实验期间观察并记录小鼠一般生长情况。

1.3.2 血脂、血浆肝功能相关指标和肝纤维化标志物水平测定

末次灌胃后，小鼠禁食不禁水16 h，各组小鼠在进行取材前称量并记录体质量。摘眼球取血，放于含肝素钠的真空采血管中，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，收集上清液，于－80 ℃保存备用。血浆AST、ALT、ALP、TP、ALB、TBil、DBil、TC、TG、HA、LN、IV-C、PC-III水平测定均按照试剂盒 说明书步骤进行。

1.3.3 小鼠肝脏指数计算

采血完毕后，颈椎脱臼处死小鼠，快速取出肝脏，用冷生理盐水漂洗除去表面血液，滤纸拭干，称质量，按下式计算肝脏指数[20]。

1.3.4 肝脏组织病理学观察

取肝脏左叶浸泡于体积分数10%甲醛溶液中，固定48 h，脱水，石蜡包埋，切片（厚度约为4 μm），苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光学显微镜下进行组织病理学观察。

1.4 统计学分析

实验结果均以平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0软件对结果进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显着。采用Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠一般生长情况的影响

实验期间，正常对照组小鼠在饲养过程中状态良好；模型组小鼠精神萎靡、行动迟缓、皮毛不光滑、腹部微隆、食欲减退并伴有不同程度的腹泻；与模型组比较，阳性药物组及桑叶生物碱各剂量组小鼠状况均有所改善。

2.2 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠体质量和肝脏指数的影响

表1 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠体质量和肝脏指数的影响（ ＝10）Table 1 Effect of mulberry leaf alkaloids on body mass and liver index of mice with hepatic fifi brosis ( = 10)

在动物实验中，脏器质量和指数是药物慢性实验指定检测项目，通过实验动物的脏器质量和脏器指数可大概确定脏器损伤或病变的性质和程度[21]。由表1可知，与正常对照组相比，模型组小鼠体质量显着降低（P＜0.05），肝脏指数显着增加（P＜0.05），表明CCl4联合高脂饮食对小鼠体质量增长产生了影响，对小鼠肝脏造成了一定的损伤。阳性药物组和桑叶生物碱各剂量组小鼠体质量虽呈现不同程度的增长，但与模型组无显着差异（P＞0.05）；其中低剂量组与正常对照组之间无显着差异（P＞0.05）。与模型组相比，阳性药物组和桑叶生物碱各剂量组小鼠的肝脏指数均有所下降，其中阳性药物组趋于正常，与正常对照组无显着差异（P＞0.05）；桑叶生物碱高剂量组小鼠肝脏系数与模型组之间存在显着差异（P＜0.05），与阳性药物组之间无显着差异（P＞0.05），但显着高于正常对照组（P＜0.05）。结果表明，桑叶生物碱能改善肝损伤小鼠的体质量和肝脏指数，但在实验剂量与时间内未能使之恢复到正常水平。

2.3 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆ALT、AST和ALP活力的影响

ALT、AST和ALP是反映肝毒性的重要指标。正常情况下，机体ALT、AST主要分布于肝细胞内，当肝细胞出现损伤或坏死时，肝细胞膜通透性增加，ALT、AST被释放入血液，引起血液中ALT、AST含量上升，因此血液中ALT、AST含量的升高反映了肝脏损伤程度[22-23]。此外，ALP在正常情况下存在于骨骼中，由胆道系统排出；当肝脏受到损伤时，ALP会反流入血液，从而使血液中ALP含量显着升高[24]。

表2 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆ALT、AST和ALP活力的影响Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma ALT, AST and ALP activity of mice with hepatic fi brosis

由表2可知，与正常对照组相比，模型组小鼠血浆ALT、AST、ALP活力均显着升高（P＜0.05），提示肝细胞受损，造模成功。与模型组比较，阳性药物组及桑叶生物碱各剂量组小鼠血浆ALT、AST、ALP活力均有不同程度降低；灌胃阳性药物水飞蓟宾45 d后，小鼠血浆ALT、AST、ALP活力分别下降了63.19%、60.29%、46.89%；桑叶生物碱高剂量组小鼠血浆ALT、AST、ALP活力分别下降了60.60%、54.85%、49.72%，且桑叶生物碱中、高剂量组与阳性药物组上述指标无显着差异（P＞0.05），但仍远高于正常对照组（P＜0.05）。结果表明，桑叶生物碱能有效降低CCl4联合高脂饮食导致的肝损伤，但在实验剂量和时间内还不能使ALT、AST、ALP活力恢复到正常水平。

2.4 桑叶生物碱对小鼠肝纤维化程度的影响

CCl4会引起肝脏细胞外基质过度增生与异常沉积，引起肝脏纤维化。HA、LN、PC-III、IV-C是反映肝纤维化程度的重要指标，其中HA水平能较为灵敏地反映肝纤维量；LN水平反映了肝脏的损伤程度，是判断有无活动性肝纤维的指标之一；PC-III与肝纤维形成的活动密度相关，反映肝纤维合成状况和炎症活动性；IV-C是最早增生的纤维，能敏感地反映肝炎向肝纤维化发展的过程和程度，是肝纤维化早期诊断的良好指标[25-26]。

表3 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆HA、LN、PC-III和IV-C质量浓度的影响Table 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma HA, LN, PC-III and IV-C levels of mice with hepatic fifi brosis

由表3可知，与正常对照组比，模型组小鼠血浆肝纤维化标志物HA、LN、PC-III、IV-C质量浓度均显着升高（P＜0.05），表明CCl4联合高脂饮食诱导小鼠肝纤维化造模成功。与模型组比较，阳性药物组与桑叶生物碱中、高剂量组小鼠血浆HA、LN、PC-III、IV-C质量浓度均显着下降（P＜0.05）；灌胃阳性药物水飞蓟宾45 d后，小鼠血浆HA、LN、PC-III、IV-C质量浓度分别下降了18.06%、17.50%、20.82%、18.44%；桑叶生物碱高剂量组小鼠血浆HA、LN、PC-III、IV-C分别下降了12.01%、15.77%、17.55%、17.42%，其中LN、PC-III、IV-C质量浓度与阳性药物组无显着差异（P＞0.05），但与正常对照组比差异显着（P＜0.05）。此外，各指标质量浓度随剂量增加整体呈下降趋势，但无明显量效关系。以上结果表明，桑叶生物碱能降低肝纤维化标志物水平，对小鼠肝纤维化具有改善作用。

2.5 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆TP和ALB质量浓度的影响

表4 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆TP和ALB质量浓度的影响Table 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma TP and ALB concentrations of mice with hepatic fi brosis

TP包含ALB和球蛋白，主要来自肝脏的合成。当肝细胞受损，蛋白质在机体内的合成、运输和释放受到影响，血液中蛋白质含量会下降[5,27]。由表4可知，与正常对照组相比，模型组小鼠血浆TP、ALB质量浓度均显着降低（P＜0.05），说明造模过程中CCl4和高脂饮食的联合作用造成了小鼠肝损伤，影响了肝脏蛋白质的合成、运输和释放。与模型组相比，阳性药物组与桑叶生物碱各剂量组小鼠血浆TP、ALB质量浓度均显着升高，其中，阳性药物组小鼠血浆TP、ALB质量浓度分别升高了26.36%、31.85%；桑叶生物碱高剂量组小鼠血浆TP、ALB质量浓度分别升高了26.50%、27.75%，与阳性药物组相比无显着差异（P＞0.05），与正常对照组相比差异显着（P＜0.05）。此外，TP、ALB质量浓度随剂量升高，但无明显量效关系。以上结果表明，桑叶生物碱能提高肝纤维化小鼠肝脏TP、ALB质量浓度，改善小鼠肝脏受损情况。

2.6 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆TBil和DBil浓度的影响

血液中胆红素水平反映了肝细胞通过肝脏网状内皮系统对胆红素进行摄取、结合和排泄的能力。当肝细胞受损时，肝脏对胆红素的处理能力下降，血胆红素水平升高[22]。由表5可知，与正常对照组比，模型组小鼠血浆TBil、DBil浓度均显着升高（P＜0.05），说明造模过程中CCl4和高脂饮食的联合作用造成了小鼠肝损伤，影响了肝细胞对胆红素的处理能力。与模型组比较，阳性药物组与桑叶生物碱各剂量组小鼠血浆TBil、DBil浓度均显着下降（P＜0.05）。阳性药物组小鼠血浆TBil、DBil浓度分别下降了45.46%、74.91%；桑叶生物碱高剂量组小鼠血浆TBil、DBil浓度分别下降了35.56%、74.50%，与阳性药物组相比无显着差异（P＞0.05），与正常对照组相比差异显着（P＜0.05）。此外，桑叶生物碱各剂量组之间无明显量效关系。以上结果表明，桑叶生物碱能调节肝损伤小鼠血浆TBil和DBil浓度，小鼠肝脏对胆红素的处理能力有所恢复。

表5 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆TBil和DBil浓度的影响Table 5 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma TBil and DBil concentrations of mice with hepatic fi brosis

2.7 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆TC和TG含量的影响

表6 桑叶生物碱对肝纤维化小鼠血浆TC和TG含量的影响Table 6 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma TC and TG contents of mice with hepatic fi brosis

CCl4和长期高脂饮食均会引起机体脂质代谢紊乱，引起TC、TG含量的升高[28-29]。由表6可知，与正常对照组比较，模型组小鼠血浆TC、TG含量均显着升高（P＜0.05），表明小鼠脂代谢出现异常。与模型组比较，阳性药物组（TG含量除外）与桑叶生物碱各剂量组小鼠血浆TC、TG含量均显着下降（P＜0.05）。阳性药物组TC、TG含量分别下降了32.44%、20.99%；桑叶生物碱高剂量组TC、TG含量分别下降了28.67%、23.76%，与阳性药物组无显着差异（P＞0.05），并且桑叶生物碱高剂量组TC、TG含量均显着高于正常对照组（P＜0.05）。此外，TC、TG含量随桑叶生物碱灌胃剂量增加而减少，但无明显量效关系。以上结果表明，桑叶生物碱对CCl4联合高脂饮食引起的小鼠血脂异常具有改善作用。

2.8 桑叶生物碱对小鼠肝组织病理变化的影响

小鼠处死后取肝脏进行外观观察发现，正常对照组小鼠肝脏表面光滑、红润、质地柔软、边缘锋利；模型组小鼠肝脏表面粗糙有颗粒状、边缘圆钝，略带油腻感，体积偏大。

图1 HE染色观察小鼠肝组织病理切片（×200）Fig. 1 Histopathological section of liver tissue of mice in each group (× 200)

由图1可知，正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐，肝窦正常，细胞核结构清晰，无胶原纤维沉积；模型组小鼠肝小叶结构模糊，胞质疏松，胞核体积变小，肝细胞排列紊乱，纤维增生明显；与模型组比，阳性药物组和桑叶生物碱各剂量组小鼠肝小叶结构相对清晰，肝细胞排列较为整齐，胶原沉积减少，肝损伤明显减轻。

3 讨 论

CCl4是一种肝毒性化学物质，是肝纤维化模型的经典诱导剂[30]。CCl4被机体吸收后，在肝内经微粒体细胞色素氧化酶P450激活为CCl3·和Cl·[31]，这两种自由基可以与生物大分子结合，使膜完整性丧失，肝细胞坏死和胶原沉积，导致肝纤维化[32]。用高浓度CCl4进行肝纤维化造模，动物死亡率高；而长期高脂饮食虽可引起肝脏脂肪变性，但很难进展到肝纤维化阶段。采用腹腔注射低浓度CCl4联合高脂饮食的方式进行肝纤维化造模不但可以加速肝脏损伤，且模型稳定[33-34]。

肝纤维化属可逆性病变[35]，延缓或逆转肝纤维化的发生是治愈大多数慢性肝病的关键。大量研究表明，天然活性成分在防治肝纤维化方面具有一定优势。本实验室前期研究结果发现，桑叶生物碱可改善高脂饮食诱导小鼠的肝损伤[17]，本实验进一步探讨了桑叶生物碱抗肝纤维化的效果。本研究采用腹腔注射体积分数10% CCl4橄榄油溶液联合高脂饮食喂饲小鼠构建肝纤维化小鼠模型，结果表明，CCl4联合高脂饮食导致小鼠肝脏指数增大，血浆ALT、AST、ALP活力，HA、LN、PC-III、IV-C质量浓度，TBil、DBil浓度和TC、TG含量显着升高，同时引起小鼠体质量和血浆TP、ALB质量浓度显着下降，表明在CCl4联合高脂饮食诱导下小鼠肝脏受损，肝脏出现严重病变，血浆肝纤维化标志物质量浓度显着升高，蛋白质合成、运输和释放受阻，肝脏对胆红素处理能力下降，血脂出现异常。在灌胃不同剂量桑叶生物碱45 d后，上述指标均不同程度地有所改善。本实验中桑叶生物碱低剂量组小鼠体质量恢复到正常水平，而中、高剂量组小鼠体质量未恢复到正常水平，这可能是由于灌胃桑叶生物碱剂量增加，其中具有降脂作用的特征成分——1-脱氧野尻霉素[36]含量也相应增加，进而发挥了控制小鼠体质量增加、调节血浆TC、TG含量的作用。此外，随着桑叶生物碱灌胃剂量增加，小鼠肝脏指数、血浆转氨酶活力、肝纤维化4 项指标、胆红素浓度显着降低，血浆TP、ALB质量浓度显着升高，其中高剂量桑叶生物碱的作用效果与药物水飞蓟宾无显着差异；但在实验剂量和时间内，不同剂量桑叶生物碱均未能使小鼠肝纤维化恢复正至常水平。该实验仅从基础指标改变上证明了桑叶生物碱对肝纤维化的改善作用，其在机体内的具体调节机制还需进一步研究。

综上所述，桑叶生物碱对CCl4联合高脂饮食诱导的小鼠肝纤维化有较好的改善作用，且在本实验剂量与灌胃时间范围内与药物水飞蓟宾作用效果相近。该研究结果表明，桑叶生物碱具有抗肝脏纤维化的潜力，可为桑叶在保肝食品方面的开发利用提供理论参考。