超高效液相色谱-质谱联用技术解析黑果枸杞超临界CO2萃取物中黄酮类天然产物结构

束 彤，丁丽娜，王 茜，贾彩惠，邱亦亦，阮 晖,3,4,

（1.青海省食品检验检测院，青海 西宁 810008；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058；3.浙江省农产品加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310058；4.浙江大学宁波研究院，浙江 宁波 315100）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）具有抗氧化、抗疲劳、抗缺氧、辅助降血糖、降血脂、预防心血管疾病、免疫调节、抑菌等功效[1-4]。目前，对黑果枸杞所含天然产物的提取分离研究较多，例如采用超声-微波协同萃取法提取黑果枸杞多糖[5]，采用大孔树脂吸附、超声-微波协同、超声辅助双水相、亚临界水相等方法提取黑果枸杞色素、黄酮和花青素[6-11]，均获得了较理想的得率，并且得到的天然产物也适合进行微胶囊包埋[12]。对黑果枸杞所含天然产物定量分析方法包括高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法（定量测定黑果枸杞果实中花色苷）[13]、离子色谱法（定量测定黑果枸杞中甜菜碱）[14]、pH示差法（定量测定花青素）[15]等。对黑果枸杞所含天然产物的组分及其性质也进行了分析。王琪等[16]发现黑果枸杞干果和鲜果中多酚类物质种类多于红枸杞。李进等[17]发现黑果枸杞色素属于花色苷类，并研究了其在pH值、光、氧化剂、还原剂等因素下的稳定性。楼舒婷等[18]采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术相结合，从新疆枸杞、新疆黑果枸杞和青海黑果枸杞中共鉴定出50 种物质，包括酯类19 种、酮类6 种、烯类5 种、芳烃类4 种、烷烃类2 种、醛类8 种、醇类2 种、酸类3 种和醚类1 种。

从黑果枸杞所含天然产物中还分离鉴定出多种功效性物质，包括具有强抗氧化性和免疫调理能力的糖苷和多糖[20-24]，以及种类丰富的多酚。Chen Shasha等[25-26]采用超声辅助从黑枸杞中提取了具有良好抗氧化性的酚类物质，通过HPLC识别出绿原酸、二羟基桂皮酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸5 种物质，还发现黑枸杞中矮牵牛配基衍生物占97%的花青素具有抗氧化、神经损伤修复、改善记忆等功效。Tang Jilong等[27]通过柱层析纯化系统从黑枸杞中获得矮牵牛配基花青素，显示其具有抗氧化和保护PC12细胞（一种神经损伤细胞模型）功效。Tang Peipei等[28]还发现，黑枸杞色素中，矮牵牛配基-芸香葡萄糖苷是最主要的色调贡献物质，并可在宽泛pH值范围内给出丰富色调，具有作为天然食用色素的巨大潜力。

综上所述，黑枸杞具有非常丰富的功效及相关活性成分，值得采用合适的分离制备与结构鉴定技术进行深入发掘。超临界CO2萃取技术具有低温提取、无有毒残溶和可以选择性分离等优点，特别适合分离提取微量及稳定性低的活性组分。目前解析黑枸杞超临界CO2萃取物中黄酮组分结构的研究鲜见报道。本研究采用超高效液相色谱-质谱（ultra-high performance liquid chromatographymass spectrometry，UPLC-MS）联用技术分析单体化合物的质谱裂解途径并进行结构解析，借助PeakView软件对质谱碎片给出候选分子式，再用Chemdraw软件推测拼接，推断出黄酮化合物的结构和裂解途径，全面解析青海柴达木地区黑果枸杞超临界CO2萃取物中黄酮类天然产物的组成和结构，为黑果枸杞的高值化加工利用提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞产于青海省柴达木地区。

乙醇（一级色谱纯） 天津四友精细化学品有限公司；所有黄酮类标准品（HPLC≥98%） 北京世纪奥科生物技术有限公司；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HGC-12A氮吹仪 天津恒奥科技发展有限公司；Centrifuge 5417R高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司；SFE-2超临界CO2萃取仪 美国ASI公司；I-class UPLC仪 美国沃特世科技（上海）有限公司；Triple TOF 5600+型飞行时间质谱仪（配有可变波长紫外检测器和PeakView色谱工作站） 美国AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 样品溶液的制备

取适量黑果枸杞干果，置于烘箱中以55 ℃烘干，再用粉碎机粉碎至粒状，过40 目筛，得黑果枸杞粉末。取适量黑果枸杞粉，装入50 mL提取釜中，设置提取条件为萃取压力35 MPa、萃取温度45 ℃、提取时间1 h、出口阀温度110 ℃。待萃取完毕，再以无水乙醇为夹带剂，流速0.8 mL/min，按照相同的萃取条件，更换新的萃取瓶收集萃取液。待萃取完毕后，将萃取液溶解、浓缩、冷冻离心至合适浓度，过0.22 μm滤膜，待用。

1.3.2 对照品溶液的制备

分别称取槲皮素、二氢槲皮素、山柰酚、橙皮素、异鼠李素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并配制成每个组分约0.05 mg/mL的混合对照品溶液，摇匀，过0.22 μm滤膜，备用。参考对照品的质谱裂解特征，解析黄酮类化合物的质谱裂解规律。

1.3.3 UPLC-MS方法

色谱条件：色谱柱为安捷伦ZORBAX-SBC18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；以体积分数0.1%甲酸溶液为流动相A，以体积分数0.1%甲酸-乙腈为流动相B，线性梯度洗脱，系统程序：0～2 min、5% B，2～25 min、5%～50% B，25～33 min、50%～95% B；流速0.8 mL/min；柱温35 ℃；检测波长254 nm；进样量5 μL。

质谱条件：Triple-TOF 5600+飞行时间UPLC-MS仪，正负离子扫描模式；扫描范围，m/z100～1 500；雾化气（GS1）55 psi；雾化气（GS2）55 psi；气帘气（CUR）35 psi；离子源温度600（正）～550 ℃（负）；离子源电压5 500（正）～4 500 V（负）；一级扫描，去簇电压100 V，聚焦电压10 V；二级扫描，使用TOF MS-Product Ion-IDA模式采集质谱数据，二级质谱中的诱导碰撞解离能量为20、40 V和60 V，进样前，用校正泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2×10-6。

1.4 数据统计与分析

有关数据及图表均从测定仪器中自动生成。

2 结果与分析

2.1 黑果枸杞超临界CO2萃取物中组分分离

图1 黑果枸杞超临界CO2萃取物中黄酮的UPLC图（A）及总离子流图（B）Fig. 1 UPLC-UV chromatograms (A) and total ion current chromatograms (B) of the supercritical CO2 extract of black Goji fruit

如图1所示，黑果枸杞的超临界CO2萃取物中的主要活性成分得到有效分离。黄酮类化合物在负离子模式下干扰较少，也易被离子化，碎片信息更为准确，故本研究在负离子模式下，采用电喷雾离子源串联质谱技术，根据二级质谱结果，解析化合物裂解途径，确定黑果枸杞超临界CO2萃取物中黄酮类成分的结构。

2.2 黑果枸杞超临界CO2萃取物中黄酮类化合物的识别与结构鉴定

采用PeakView软件对质谱碎片给出候选分子式，再用Chemdraw软件推测拼接，推断黄酮化合物的裂解途径，以及与标准品比对出峰时间（如果有匹配标准品），确定黄酮化合物的结构。

为方便讨论黄酮苷元及糖苷质谱断裂形成的碎片离子，本研究对黄酮类化合物裂解后的特征碎片离子进行了系统命名。如图2所示，其中，对黄酮苷元，i,jA和i,jB分别表示该黄酮苷元的碎片包含A-环和B-环，上标i和j显示了C环上键的断裂位置。对黄酮苷，k,lXj表示该碎片依然包括了黄酮苷元，下标j表示第j个糖基上键的断裂（从黄酮苷元数起），上标k和l显示了糖基环断裂的位置。

图2 本研究中裂解途径所产生碎片的系统命名Fig. 2 Nomenclatures adopted for various retrocyclization fragments observed in this study

共鉴定出13 种黄酮类化合物，按其结构类型可分为4 类，其中包括7 种黄酮醇苷元及黄酮醇苷，3 种二氢黄酮醇苷元，2 种黄酮苷元和1 种二氢黄酮苷元，结果见表1。

表1 黑果枸杞超临界CO2萃取物中黄酮类化合物的鉴定结果Table 1 Main flavonoids identified in the supercritical CO2 extract

2.2.1 黄酮醇及其苷类

化合物11、12、13、17、21、22、23推测皆为黄酮醇及其苷类。

化合物11通过和芦丁标品出峰时间以及二级质谱比对，确认为芦丁，其分子式经PeakView色谱工作站模拟，为C27H30O16，相对分子质量610。在负离子模式下，芦丁产生分子离子峰m/z609[M-H]-，m/z609丢失一分子C10H18O8生成碎片m/z343，m/z609丢失C3上所连的糖苷即C12H20O9，得到m/z301，再通过连续丢失1 个H和一分子CHO得到碎片m/z300和m/z271，最后丢失一分子C5O2生成碎片m/z179。

化合物12经推断为槲皮素-3-β-葡萄糖醛酸苷，其分子式经PeakView色谱工作站模拟，为C21H18O13，相对分子质量为478。在负离子模式下，除了产生分子离子峰m/z 477外，还通过丢失葡萄糖醛酸苷得到碎片m/z 301，而碎片301则通过狄尔斯-阿尔德以应（Retro Diels-Alder reaction，RDA）发生1,4B断裂和RDA1,3A断裂生成碎片m/z 179和碎片m/z 151，还可以通过丢失一分子CH2O2生成碎片m/z 255。二级质谱中的碎片皆可由槲皮素-3-β-葡萄糖醛酸苷通过相应的键断裂而得，并且槲皮素-3-β-葡萄糖醛酸苷出峰时间和特征碎片一致。因此，化合物12推测为槲皮素-3-β-葡萄糖醛酸苷。

化合物13经推断为金丝桃苷，即槲皮素-3-O-吡喃半乳糖苷，其分子式经PeakView色谱工作站模拟，为C21H20O12，相对分子质量为464。在负离子模式下，除了产生分子离子峰m/z 463外，还通过丢失吡喃半乳糖苷得到碎片m/z 301，碎片m/z 301通过连续丢失1 个H和一分子CHO得到碎片m/z 300和m/z 271，而m/z 271分别丢失1 个O和一分子CO生成碎片m/z 255和碎片m/z 243。二级质谱中的碎片皆可由金丝桃苷通过相应的键断裂而得，并且和金丝桃苷出峰时间和特征碎片一致。因此，化合物13推测为金丝桃苷。

化合物17通过与槲皮素标品的出峰时间和二级质谱对比，可确定为槲皮素，其分子式为C15H10O7，相对分子质量为302。除了产生分子离子峰m/z 301外，二级质谱上主要的碎片有m/z 201、183等。这也跟其他农产品中的槲皮素相关信息一致。

化合物21通过与山柰酚标品的出峰时间和二级质谱对比，可确定为山柰酚，其分子式为C15H10O6，相对分子质量为286。山柰酚二级碎片较少，主要为m/z 268、239、187，m/z 268和m/z 239分别由m/z 285丢失一分子OH和一分子CH2O2得到，而m/z 187则是由碎片m/z 239丢失一分子C3O得到。

化合物22通过与异鼠李素标品出峰时间和二级质谱的对比，可确定为异鼠李素，其分子式为C16H12O7，相对分子质量为316。在负离子模式下，除了产生分子离子峰m/z 315外，还通过丢失一分子CH3生成典型二级碎片m/z 300，再通过断裂相应的键得到碎片m/z 243、227、151等。

化合物23通过与山柰素标品的出峰时间和二级质谱的对比，可确定为山柰素，其分子式为C16H12O6，相对分子质量为300。在负离子模式下，产生分子离子峰m/z 299，还通过丢失一分子CH3生成典型二级碎片m/z 284，再通过断裂相应的键得到碎片m/z 255、227、164、151等。

2.2.2 二氢黄酮醇及其苷类

化合物14、15、16皆为二氢黄酮醇苷元。

化合物14为二氢槲皮素，其分子式经PeakView色谱工作站模拟，为C15H12O7，相对分子质量为304。其裂解途径如下：分子离子峰m/z 303失去1 个H2O生成m/z 285；m/z 303失去1分子C3H2O3生成碎片m/z 217；m/z 217失去1 个H2O生成m/z 199，或丢失一分子C2H4O4生成m/z 125。二级质谱中的碎片皆可由二氢槲皮素通过相应的键断裂而得，并且和之前报道的沙棘中的二氢槲皮素的出峰时间和特征碎片一致。因此，化合物14推测为二氢槲皮素。

化合物15为二氢异鼠李素，其分子式经PeakView色谱工作站模拟，其分子式为C16H14O7，相对分子质量为318。其裂解规律具体如下：分子离子峰m/z 317失去1 个CO生成m/z 289，而m/z 289可以通过丢失C4H2O2生成m/z 207，再丢失1 个CO生成m/z 179，或是m/z 179丢失CH2O生成m/z 149，或是丢失C2H2O生成m/z 137；m/z 317失去1 个CO2生成m/z 273，再连续丢失一分子C2H2O、C2H7O3生成碎片m/z 231、152；碎片m/z 273也可通过丢失一分子CH3生成m/z 258，再分别丢失一分子CO和C8H5O2生成碎片m/z 230、125，而碎片m/z 230通过丢失一分子C2H2O得到m/z 188。二级质谱中的碎片皆可由二氢异鼠李素通过相应的键断裂而得，并且和之前报道的沙棘中二氢异鼠李素的出峰时间和特征碎片一致。因此，化合物15推测为二氢异鼠李素。

化合物16为二氢山柰酚，其分子式经PeakView色谱工作站模拟，为C15H12O6，相对分子质量为287。二氢山柰酚的二级碎片较少，除了分子离子峰m/z 287外，还产生几个比较典型的二级碎片离子，如经RDA断裂生成m/z 151（1,3A），碎片m/z 151再分别丢失一分子H2O和1 个O生成碎片m/z 133和m/z 135，碎片m/z133通过丢失一分子C3O2得到碎片m/z 65，碎片m/z 135丢失一分子CO生成碎片m/z 107。二级质谱中的碎片皆可由二氢山柰酚通过相应的键断裂而得，并且和之前报道的沙棘中的二氢山柰酚的出峰时间和特征碎片一致。因此，化合物16推测为二氢山柰酚。

2.2.3 黄酮苷元及其苷类

化合物18、20为黄酮苷元。

化合物1 8通过与芹菜素标品的出峰时间和二级质谱的对比，可确定为芹菜素，其分子式为C15H10O5，相对分子质量为270。在负离子模式下，除了产生分子离子峰m/z 269外，还通过丢失一分子CO2生成碎片m/z 225，丢失一分子H2O生成碎片m/z 149，或通过其他断裂方式生成碎片m/z 121、117。

化合物20经推测为苜蓿素，其分子式经PeakView色谱工作站模拟，为C17H14O7，相对分子质量为330。在负离子模式下，除了产生分子离子峰m/z 329外，再通过丢失一分子C6H8O3生成碎片m/z 201，再丢失一分子H2O生成碎片m/z 183，或分子离子峰直接丢失一分子H2O生成碎片m/z 311。以上之外，m/z 329通过连续丢失一分子CH3得到碎片m/z 314和m/z 299，m/z 299又连续丢失CO和C5H2O4得到碎片m/z271、145。二级质谱中的碎片皆可由苜蓿素通过相应的键断裂而得，因此，化合物20推测为苜蓿素。

2.2.4 二氢黄酮苷元

化合物19通过与橙皮素标品的出峰时间和二级质谱的对比，可确定为成橙皮素，其分子式经PeakView色谱工作站模拟，为C16H14O6，相对分子质量为302。在负离子模式下，除了产生分子离子峰m/z301外，还通过丢失一分子CH3生成碎片m/z286，发生RDA以应生成碎片151（1,3A）和碎片149（1,3B）；还通过其他断裂方式生成碎片m/z201、107等。

2.3 化合物结构图及相关裂解途径

以下是部分代表性化合物（化合物15和19）的二级质谱图和所推断的裂解途径（图3、4），以及采用PeakView和Chemdraw软件所绘出的黄酮化合物结构（图5）。

图3 化合物15二氢异鼠李素的裂解途径Fig. 3 Fragmentation pathway of dihydroisorhamnetin

图4 化合物19橙皮素的裂解途径Fig. 4 Fragmentation pathway of hesperetin

图5 黑枸杞超临界CO2萃取物中黄酮化合物的化学结构式Fig. 5 Chemical structures of flavonoids identified in the supercritical CO2 extract

3 讨论与结论

多酚（包括黄酮）是黑果枸杞所含天然产物中最重要的一类。Zheng Jie等[29]在黑果枸杞甲醇提取物中识别出11 种花青素：矮牵牛素-3-O-半乳糖苷-5-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-芸香糖苷、(顺式对香豆酰基)-5-O-葡糖苷、飞燕草素-3-O-芸香糖苷(以式对香豆酰基)-5-O-葡糖苷、矮牵牛素-3-O-芸香糖苷(咖啡酰基)-5-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-芸香糖苷(顺式对香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-芸香糖苷(以式对香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷(苹果酰基)-5-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷(阿魏酰基)-5-O-葡萄糖苷、锦葵素-3-O-芸香糖苷(顺式对香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷；Tian Zhihao等[30]在黑果枸杞中识别出9 种花青素：天竺葵素-3-O-半乳糖苷、天竺葵素-3-O-二葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3,5-O-二葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-(6-对香豆酰基)-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-芸香糖苷(以式-对香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷和矮牵牛素-3-O-芸香糖苷(以式-对香豆酰基)-5-O-葡萄糖苷；有研究者[31-32]在黑果枸杞乙醇提取物中识别出18 种多酚，包括2 种黄酮（儿茶素和柚皮素），7 种酚酸（没食子酸、香草酸、2,4-二羟基苯甲酸、藜芦酸、苯甲酸、鞣花酸和水杨酸），并且根皮素与原儿茶酸也被准确测定，还在黑果枸杞中识别10 种花青素组分（飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、锦葵素-3-葡萄糖苷、飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素、天竺葵素和锦葵素），其中矮牵牛素-3-葡萄糖苷占比最大，并发现黑果枸杞花青素提取物和矮牵牛素-3-葡萄糖苷在谷氨酸钠诱导的大鼠痛风中发挥抗炎作用。在化学物数据库Reaxys（https://www.reaxys.com）中，目前仅收录4 种黑枸杞黄酮，即胡椒皮黄酮、山柰酚、山柰酚（芸香苷）、二羟基桂皮酸。

本研究在黑果枸杞超临界CO2萃取物中共识别出13 种黄酮化合物（7 种黄酮醇苷元及黄酮醇苷、3 种二氢黄酮醇苷元及黄酮醇苷、2 种黄酮苷元及黄酮苷和1 种二氢黄酮醇苷元，包括芦丁、槲皮素-3-β-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷即槲皮素-3-O-吡喃半乳糖苷、二氢槲皮素、二氢异鼠李素、二氢山柰酚、槲皮素、芹菜素、橙皮素、苜蓿素、山柰酚、异鼠李素、山柰素），与以往研究相比，组分谱有一定差异，特别是橙皮素和苜蓿素之前在之前对黑果枸杞的研究中还未被发现过。本实验对黑果枸杞超临界CO2萃取物中的黄酮类化合物进行较全面地分析，综合以往研究中采用其他提取媒介和分析手段所得出的研究结果，可以更加全面地诠释黑果枸杞中的黄酮组分与结构。