李 素，周慧敏，赵 冰，潘晓倩，朱 宁，吴倩蓉，刘 梦，张顺亮
（中国肉类食品综合研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）
牛肉在人们饮食习惯中占有重要地位，国内传统食用方法以卤制为主，通过香辛料及调味料赋予牛肉特有的味道，卤汤也为日常饮食增加滋味。卤汤牛肉产品多用于快餐牛肉面的制作，因其方便、营养、美味等特点，在节奏日益加快的现代化生活中，逐渐成为消费主流，而风味是影响其食用品质的重要因素。为提升牛肉制品食用品质，国内外学者开展了多项研究。Conroy[1]及Fellendorf[2]等研究了低钠盐或钠盐替代物对牛肉产品食用品质的影响。Lepper-Blilie等[3]研究了烤肉大小、烹调方法和加热过程对防止牛肉块在烘烤中的过热风味形成的影响。国外学者对牛排类产品研究也较多，Legako等[4]开展了烹调方法对牛排脂肪酸含量及中性和极性脂组分含量的影响，提出了极性脂的氧化在牛肉风味的形成中起很大的作用。Fatih等[5]研究烤肉种类和烹调水平对牛排中杂环芳香胺和多环芳烃生成的影响。有学者研究牛的种类、饲养条件、屠宰工艺等对牛排中脂肪酸变化及其对风味物质的影响[6-7]。Gong Hui等[8]发现煮制4 h辣味卤牛肉风味最丰富。国内学者在卤牛肉及卤汤相关品质保持技术方面有一定研究[9-11]，黄名正等[12]研究添加不同NaCl对炖煮牛肉挥发性风味成分的影响；唐春红等[13]研究了反复卤煮对老汤的品质影响；也有学者在腌制用水量、加工过程等方面对酱牛肉风味影响进行了研究[14-15]，但鲜见有关卤汤牛肉在贮藏期间牛肉及卤汤的风味物质变化研究，牛肉在有卤汤存在的情况下保存，其食用品质会发生一定变化，包括质地、色泽、风味等品质变化，因此，探究卤汤牛肉贮藏期间风味品质变化对该类产品品质保持有重要作用。
国内外学者从食品等物质中鉴定出多种挥发性化合物，并研究了该类物质的嗅觉阈值，可根据判定的嗅觉阈值，采用气味活度值（odor activity value，OAV）进行风味贡献率的评价[16]。气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术常用于挥发性风味物质检测，将GC-MS联用技术结合OAV分析可精确判断对样品有主要贡献的风味成分。目前，对于卤汤牛肉制品在贮藏期间其牛肉及肉汤的风味分析鲜见报道，本实验采用吹扫/捕集-热脱附进行风味物质吸附前处理，借助GC-MS技术及OAV分析方法研究卤汤牛肉在贮藏期间牛肉及卤汤的挥发性风味物质的变化，为提升卤汤牛肉贮藏期间食用品质及生产加工改善提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
卤汤牛肉 北京李先生加州牛肉面大王有限公司；2-甲基-3-庚酮、C6～C25系列正构烷烃（均为色谱纯）美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
SCIENTZ-11L型均质机 宁波新芝生物科技股份有限公司；TRACE 1310 GC-TSQ 8000 MS联用仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Tenax TA石英玻璃吸附管、Gerstel TDS半自动热脱附进样器、ODP2嗅闻检测仪德国Gerstel公司。
1.3 方法
1.3.1 样品准备
卤汤牛肉中，牛肉约为3 cm×3 cm×3 cm肉块，每包产品含肉约55 g，卤汤约400 g，采用110 ℃、30 min杀菌条件，成品完成后取足量样品运输至实验室在25 ℃、相对湿度50%的恒温恒湿箱中贮藏，以样品运输至实验室时间为初始取样点，贮藏期间每2 个月取样一次进行测定，根据样品的气味及色泽等感官品质确定以贮藏0、2、4、6 月和8 月为实验取样点，对样品中牛肉及肉汤的挥发性风味物质分别进行测定，分别编号为R0、R2、R4、R6、R8与T0、T2、T4、T6、T8。
1.3.2 样品风味物质捕集及热脱附处理
卤汤牛肉在不同贮藏节点每次取3 包样品，将牛肉与汤分离，牛肉用均质机在相同条件下粉碎后准确称取10.0 g于吹扫/捕集制样瓶中，卤汤直接称取10.0 g于吹扫/捕集制样瓶中，参考文献[8]中方法进行实验，牛肉与汤各平行测定3 次取平均值。
1.3.3 GC-MS检测
1.3.3.1 GC-MS进样条件
GC条件：使用TG-Wax MS极性色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：进样口温度250 ℃，初始柱温40 ℃，维持时间2 min，再以4 ℃/min升温至200 ℃，维持1 min，以8 ℃/min升温至220 ℃，维持5 min。载气：氦气（纯度＞99.99%），流速1.0 mL/min维持2 min，不分流。
MS条件：电子电离源；接口温度260 ℃；传输线温度240 ℃；电压1.2 kV；质量扫描范围m/z40～600，全扫描模式，扫描时间2 s；离子源温度260 ℃；电子能量70 eV。
1.3.3.2 挥发性风味物质定性定量分析
定性：采集数据对照美国国家标准与技术研究所与Willey谱库进行检索，选取正反相似度指数均大于800的化合物分析；通过C6～C25的正构烷烃标准物，按式（1）计算测定物质的保留指数[17]（retention index，RI）：
式中：tx、tn、tn＋1分别为样品、正构烷烃Cn、正构烷烃Cn＋1的保留时间/min。
定量：根据已知内标2-甲基-3庚酮的含量，依据化合物的峰面积比值与含量呈正比的原理，对挥发性风味物质进行定量分析，按式（2）计算：
式中：C为测定物质的含量/（μg/kg）；Ax为测定物质的峰面积；C0为内标物质量浓度/（μg/μL）；V为内标物进样体积/μL；A0为添加的内标物峰面积；m为测定样品质量/g。
1.3.4 OAV计算
OAV是风味物质的质量浓度与其阈值的比值，按式（3）计算：
式中：C为测定挥发性化合物的含量/（μg/kg）；T为相同物质在水介质中的嗅觉阈值/（μg/kg）。
1.4 数据处理
利用SPSS Statistics 21.0对数据进行平均值、标准偏差计算及显着性差异分析，P＜0.05，差异显着，利用UnscramblerX 10.1进行主成分分析及作图。
2 结果与分析
2.1 样品贮藏期间挥发性风味物质变化规律
表1 贮藏期间牛肉中挥发性风味物质含量Table 1 Concentrations of volatile flavor compounds from stewed beef samples during storage
续表1
由表1～3与图1可知，卤汤牛肉样品在贮藏过程中从牛肉中分别检测出46、50、42、44、41 种物质，总含量分别为2 537.62、4 505.18、5 380.24、4 149.90、1 677.10 μg/kg；肉汤中分别检测出50、40、48、47、38 种物质，总含量分别为3 840.15、3 877.84、1 236.24、1 003.36、833.18 μg/kg。卤汤牛肉样品贮藏过程中，牛肉中风味物质呈先上升后下降的趋势，0、2、4 月样品风味物质逐渐增加，且差异显着（P＜0.05），6 月牛肉样品风味物质开始降低，与2 月样品差异不显着，与贮藏时间差异显着，贮藏至8 月，牛肉样品中风味物质显着低于其他组别。肉汤中挥发性风味物质含量呈逐渐降低趋势，0 月与2 月肉汤中挥发性风味物质总含量无显着差异，贮藏至4 月，风味物质含量显着降低，4 月及8 月肉汤样品间挥发性风味物质总含量无显着差异。牛肉样品中醇类、醛类物质占比例较高，其次是其他类及碳氢化合物；肉汤样品中醇类、醛类物质占比较高，其余几种物质占比较低。
表2 贮藏期间肉汤中挥发性风味物质含量Table 2 Concentrations of volatile flavor compounds from broth samples during storage
表3 贮藏期间样品中挥发性风味物质含量及数量Table 3 Kinds and contents of volatile compounds identified in samples during storage
图1 贮藏期间牛肉（A）和肉汤（B）样品风味物质占比Fig.1 Proportions of various classes of volatile flavor compounds in stewed beef samples (A) and broth samples (B) during storage
2.2 样品贮藏期间挥发性风味物质分析
2.2.1 碳氢化合物分析
不同贮藏期间牛肉样品中分别检测出12、10、12、12、10 种碳氢化合物，肉汤种检测出12、8、10、10、8 种。碳氢化合物在牛肉中总含量呈先上升后下降的趋势，肉汤中呈逐渐降低的趋势，牛肉中检测出碳氢化合物含量明显高于肉汤中此类物质含量。碳氢化合物的形成与脂肪酸烷氧自由基均裂有关[18]，大多含量低、觉察阈值高，对风味贡献不明显，但是有助于提高肉的整体风味。某些饱和烃类物质出现先上升后降低现象，可能由于此类化合物是杂环化合物形成中间体[19]，在贮藏过程中发生了成分转化；贮藏过程中一些烯烃类化合物未全部检测到，可能是由于双键不稳定发生了氧化反应[20]，使其含量低于检出限。牛肉及肉汤中D-柠檬烯含量较高，有类似柑橘及柠檬的香气，一般来源于香辛料。
2.2.2 醇类物质分析
贮藏期间卤汤牛肉样品中醇类物质是主要成分，主要来自脂肪氧化、醛的还原及香辛料[21]，牛肉中分别检测出10、12、10、11、11 种，肉汤中检测出14、11、13、15、12 种，醇类物质在牛肉及肉汤中均呈先上升后降低的趋势。从表2、3可知，芳樟醇、松油烯-4-醇、α-松油醇含量较高，可提供类似花香、肉豆蔻及薄荷的香气，是八角、肉桂中常见挥发性风味成分[22]，可为肉类产品提供良好风味，芳樟醇在酱牛肉中也是最重要的风味物质之一[14]。肉汤中1-十二醇含量较高，具有持久的油脂气味，可能由不饱和脂肪酸氧化形成[23]。
2.2.3 醛类物质分析
贮藏期间从卤汤牛肉样品的牛肉中分别检测出13、14、13、12、11 种醛类物质，肉汤中为11、9、11、9、7 种。醛类物质是形成肉制品风味的重要物质，从表3可看出，牛肉中醛类物质含量呈先上升后降低的趋势，4 月时样品中醛类物质含量最高，结合表2可发现此时形成了大量的壬醛及苯甲醛，壬醛为油酸的氧化产物[24]，是卤制类牛肉中代表性风味物质[25]，苯甲醛则是苯丙氨酸的降解产物[26]，说明贮藏至4 月牛肉发生了较大程度脂肪氧化及氨基酸降解。肉汤中醛类物质在0 月及2 月含量较高，4 月时总量显着降低，其中，壬醛、苯甲醛及对茴香醛含量显着降低，茴香醛主要来自香辛料，其含量降低可能是发生较严重逸失，壬醛、苯甲醛降低说明肉汤在加工过程中已经发生脂肪氧化作用，随贮藏时间延长，此类物质逐渐分解或转化。
2.2.4 酮类、酯类及其他类物质分析
卤汤牛肉样品中检测出酮类物质及酯类物质含量较低，贮藏期间两类物质均呈逐渐降低趋势，且肉汤中酮类及酯类物质的含量高于牛肉中的含量。酮类化合物一般由不饱和脂肪酸氧化、脱羧基作用形成，部分酮类物质来源于香辛料，对肉类整体风味有重要作用[27-28]。酯类物质可能由醛类物质氧化形成的酸类与醇类经酯化反应形成，也可能加入了酒类调味物质[29]。牛肉中及肉汤中均检测出4-烯丙基苯甲醚，该物质呈类似甘草、茴芹的味道，可赋予产品愉悦的香气，在牛肉样品中含量较高，肉汤中含量较低，可能源于八角、茴香、小茴香等香辛料[30]，且在肉块上大量附着。样品中检测出3 种杂环类含氮化合物，分别为2,6-二甲基吡嗪、苯并噻唑及2-乙酰基吡咯，此类物质阈值低，对肉制品风味贡献大，牛肉中含氮化合物贮藏至4 月即未检出，肉汤中此类物质保持时间则较长。
2.3 样品OAV分析及主成分分析
根据所选取阈值[16]计算OAV大于1的挥发性风味物质，一般OAV越大，该物质对产品风味贡献越大。贮藏期间，从卤汤牛肉样品的牛肉及肉汤中分别检测出19、18、19、18、16 种及14、10、17、13、10 种对风味贡献较大的物质，醛类物质种类最多，牛肉中主要风味贡献物质种类多于肉汤，香叶醇、3-甲基丁醛、十四醛仅在牛肉中有重要贡献，乙酸异戊酯仅在0 月的牛肉样品中有重要贡献，十二烷醛仅在肉汤中有贡献。随贮藏时间延长，总OAV呈先上升后降低的趋势，牛肉样品4 月时总OAV（732.80）最高，肉汤中2 月时总OAV（454.06）最高。整体来看芳樟醇OAV最高，其次是壬醛、辛醛、对茴香醛，是形成卤汤牛肉的主要风味贡献物质，与前期工作中[14]对酱牛肉主要风味贡献物质的研究结果接近。
表4 不同卤汤牛肉样品挥发性风味物质OVATable 4 OAVs of volatile compounds in stewed beef with broth samples
采用主成分分析法对表4中OAV大于1的主要风味贡献物质进行分析，如图2所示。第1主成分贡献率为91%，第2主成分贡献率为6%，累计贡献率为97%。由图2A可看出，第1主成分主要贡献物质为芳樟醇，其次为壬醛及辛醛，第2主成分主要贡献物质为壬醛，其次为辛醛及对茴香醛，与OAV分析结果一致。从图2B可看出，卤汤牛肉样品的牛肉及肉汤中主要挥发性风味物质分布较为随机，主要在第1主成分上有差异，说明同一卤汤牛肉样品中肉汤及牛肉的风味物质随贮藏时间延长变化规律并非一致，与2.1节中分析结果一致。
图2 主成分分析载荷图（A）和得分图（B）Fig.2 Correlation loading plot (A) and score plot of PCA (B)
3 结 论
通过对贮藏期间卤汤牛肉样品中的牛肉及肉汤分别进行挥发性风味物质分析可知，随贮藏时间逐渐延长，卤汤牛肉样品中牛肉与肉汤的挥发性风味物质变化规律不同。牛肉样品挥发性风味物质总含量呈先上升后降低的趋势，贮藏4 月时总含量最高，8 月时最低，贮藏期间醇类、醛类物质占比例较高；肉汤中挥发性风味物质总含量基本呈逐渐降低趋势，0 月时含量高于牛肉中总含量，贮藏期间醇类、醛类物质占比较高。通过OAV分析发现醛类物质是主要风味贡献物质，牛肉中主要风味贡献物质种类与OAV高于肉汤，随贮藏时间延长，总OAV呈先上升后降低的趋势，牛肉样品4 月时总OAV（732.80）最高，肉汤中2 月时总OAV（454.06）最高，结合主成分分析发现不同组样品主要在第1主成分的贡献率有差异，壬醛、辛醛、对茴香醛是卤汤牛肉的主要风味贡献物质。
