利用LAMP技术快速检测羊肉制品中的鼠源性成分

陈珍金，张 璜，石 磊，叶 蕾，蔡凯贤，颜栋林，韦 涛，谢耐珍，陈小聪,*

（1.暨南大学食品安全与营养研究院，广东 广州 510632；2.广州双螺旋基因技术有限公司，广东 广州 510000；3.广西东盟食品药品检验检测中心，广西 南宁 530000）

肉类掺假的历史非常悠久，自古代起就有“挂羊头卖狗肉”的说法[1]。时至今日，从欧洲马肉事件到近期报道的鼠肉冒充羊肉串等羊肉制品以及假冒伪劣的牛肉等事件，“肉类掺假”不停地冲击着食品安全体系，给社会带来了巨大的负面影响[2-3]。其中最值得关注的是羊肉制品的鼠肉掺假事件，虽然我国的食品监察管理部门针对鼠肉掺假等一系列问题进行严格的筛查，但是我国在鉴别肉类掺假方面尚未有完善的检测标准和监察体系[1,4-5]，尤其像鼠肉这种特殊的肉源性成分，且由于肉类产品具有产品流通量大和常温下贮藏保质期短等特点[6]，在实验室条件下常用的定量和定性检测方法很难满足实时、快捷、大批量的产品检测需求，因此亟需开发出快速、简易、准确、便捷的肉源性成分快速检测技术及产品。

目前，对肉类制品中的种属鉴定主要包括高效液相色谱、等电聚焦电泳和酶联免疫测定等客观仪器分析技术检测方法[7-12]，但都因为其检测方法灵敏度低、操作周期长、操作要求高等劣势而未被基层广泛推广使用。以DNA为目标的动物种属鉴定是当前普遍使用的肉类掺假分子生物学检测方法，实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）和微滴式数字PCR等PCR检测方法凭借其特异性强、灵敏度高等特点，且由于其具有高时效性和高准确性，已经逐渐取代了常规PCR检测技术，成为肉类种属鉴定的主要检测方法[13-17]。但是real-time PCR和微滴式数字PCR需使用昂贵的仪器设备作为实验支撑，检测成本相对较高，且反应过程需要升降温，导致该检测技术不能很好应用于广大基层单位[18-19]。因此，亟待研究开发一种快速准确、性价比高、恒温且易于广大基层单位操作的分子检测方法，为广大基层单位肉制品掺假诊断提供新的选择。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作为近几年来的新型核酸扩增技术，克服了传统PCR、real-time PCR和微滴式数字PCR等PCR检测方法反复升降温且检测周期相对较长的缺点，利用BstDNA聚合酶和根据特定靶序列设计的3 对特殊的内、外、环引物，特异性识别靶序列上的6 个独立区域，启动循环链置换反应，可实现恒温条件下的连续快速扩增。因其具有恒温、特异性强、灵敏度高、性价比高和操作简易等特点[20-22]，本研究将基于LAMP检测技术首次开发出大鼠、小鼠鼠源性检测试剂盒，实现快速准确、易于操作的检测目的，从而向广大基层单位推广使用，实现对掺假羊肉制品中大鼠、小鼠鼠源性成分的检测，以期为肉制品质量控制提供有效的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊、猪、黄牛、水牛、鸡、水鸭、番鸭、鹅、家兔、田鸡、狗、马、驴的动物组织均购自本地农贸市场或超市。大鼠、小鼠组织由暨南大学食品安全与营养研究院提供。将羊和2 种生鲜鼠肉分别按不同质量比例进行混合制备模拟样品，用于确定混合肉制品当中鼠源性成分的检出限。

BstDNA聚合酶 美国NEB公司；Tris、NaCl、Na2EDTA、甜菜碱 美国Sigma公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs 大连宝生物工程有限公司；动物组织基因组DNA提取试剂盒 广州双螺旋基因技术有限公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 仪器与设备

Dhelix-1610恒温荧光检测仪 广州双螺旋基因技术有限公司；Synergy UV超纯水系统 美国Millipore公司；－80 ℃超低温冰箱 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 LAMP引物设计与合成

选用大鼠和小鼠的线粒体基因作为特异性基因，针对GenBank数据库中已发表的大鼠和小鼠的线粒体基因序列，采用BLAST对相应序列进行同源性分析，确定大鼠环氧化酶（cyclooxygenase，COX）基因（KP244683.1）和小鼠的16S rRNA基因序列（KY018919.1）为保守序列，使用软件Primer Explorer Version 4设计了LAMP引物。LAMP引物包括2 条外引物F3、B3，2 条内引物FIB（F1c+F2）、BIP（B1c+B2）和2 条环引物FLP、BLP，分别如图1所示，引物序列详见表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物纯化方式为高效液相色谱。

表1 用于检测鼠源性成分的LAMP引物Table 1LAMP primers used for detecting murine-derived ingredients

图1 小鼠源性成分（A）和大鼠源性成分（B）LAMP引物设计Fig.1 Primer design for LAMP of mouse-derived (A) and rat-derived (B) ingredients

1.3.2 DNA提取

样品DNA的提取参考广州双螺旋基因技术有限公司动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作，取适量组织样本剪碎后置于含蛋白酶K的细胞裂解液中进行消化，后续通过对总DNA的吸附、洗涤和洗脱，最终得到纯化的样品基因组DNA。采用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，经测定DNA的质量浓度分布在200～300 ng/μL，采用TE溶液将DNA模板稀释到100 ng/μL，于－80 ℃保存。

1.3.3 LAMP反应体系的建立和优化

根据文献报道初步确定25 μL LAMP预反应体系，其组成包括：1 mol/L甜菜碱、6 mmol/L MgSO4、1.6 μmol/L FIP、1.6 μmol/L BIP、0.2 μmol/L F3、0.2 μmol/L B3、0.8 μmol/L FLP、0.8 μmol/L BLP、1.6 mmol/L dNTPs、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer、0.4 µmol/L SYTO-9、8UBstDNA聚合酶及2 μL模板。以双蒸水为阴性对照，分别以大鼠、小鼠DNA模板为阳性对照进行引物筛选。使用DHelix-1610恒温荧光检测仪进行，程序设置为63 ℃、45 min。对MgSO4浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶用量进行反应体系优化，确定最佳反应体系。

1.3.4 鼠源性LAMP特异性实验

按照1.3.3节建立的最佳LAMP反应体系进行特异性实验，以大鼠和小鼠的DNA为阳性对照，以超纯水作为阴性对照，以猪、黄牛、水牛、鸡、水鸭、番鸭、鹅、家兔、田鸡、狗、马、驴的DNA为特异性实验模板，以确定该恒温检测方法的特异性。

1.3.5 鼠源性LAMP灵敏度实验

以羊肉为基底肉，分别制备大鼠、小鼠不同质量比例制备的混合模拟样品（50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%），提取各浓度模拟样品的DNA，按照1.3.3节所述反应体系进行扩增，以确定该恒温检测方法对大鼠、小鼠的检测灵敏度。

1.3.6 鼠源性LAMP稳定性实验

以大鼠、小鼠的检出限浓度进行10 个平行实验，按照1.3.3节所述的反应条件进行LAMP检测，以确定该恒温检测方法的稳定性。

1.3.7 实际羊肉样品鼠源性检测

利用本研究建立的LAMP方法与real-time PCR检测方法针对市售的羊肉制品进行鼠源性成分检测，对比分析检测结果，评价并比较其实际应用性。

2 结果与分析

2.1 LAMP反应体系的建立和优化

本研究主要对MgSO4浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、BstDNA聚合酶含量等参数进行优化，结果如表2所示。根据实验结果，最终确定25 μL LAMP体系成分如下：8 mmol/L MgSO4，0.8 mol/L甜菜碱，内引物FIP和BIP各1.6 µmol/L，外引物F3和B3各0.2 µmol/L，环引物FLP和BLP各0.8 μmol/L，2.5 μL 10×Thermo pol Buffer，1.4 mmol/L dNTPs，10 UBstDNA聚合酶，最佳的LAMP体系反应结果如图2所示。

表2 LAMP体系优化筛选Table 2Optimized LAMP system

图2 鼠源性体系优化扩增曲线Fig.2 Amplification curves for murine-derived ingredients under optimized conditions

2.2 鼠源性LAMP特异性实验结果

按照优化的反应体系进行大鼠和小鼠的特异性实验，检测结果见图3。结果显示阴性对照和猪、黄牛、水牛、鸡、水鸭、番鸭、鹅、家兔、田鸡、狗、马、驴等样品DNA均未发生扩增，仅对大鼠、小鼠样品DNA出现了S型扩增曲线，表明该恒温检测方法的特异性良好。

图3 鼠源性特异性检测结果Fig.3 Specificity analysis of LAMP for murine-derived ingredients

2.3 鼠源性LAMP灵敏度实验结果

为确定本方法的灵敏度，以羊肉为基底肉制备大鼠、小鼠质量分数分别为50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%的混合肉样品，进行DNA提取后进行LAMP检测。结果表明，大鼠源性成分的检测灵敏度为0.1%；小鼠源性成分的检测灵敏度为0.5%，结果如图4所示。

图4 大鼠（A）和小鼠（B）源性成分的检测灵敏度Fig.4 Sensitivity analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

2.4 鼠源性LAMP稳定性实验结果

为确定该方法的检测稳定性，对大鼠的检出限0.1%，小鼠的检出限0.5%各设置10 个平行，进行LAMP检测，实验结果如图5所示。结果表明，该检测方法具有良好的稳定性。

图5 鼠源性检测方法0.1%大鼠（A）和0.5%小鼠（B）重复性Fig.5 Repeatability analysis of LAMP for rat-derived (A) and mousederived (B) ingredients

2.5 实际样本检测结果

用建立的LAMP检测方法和real-time PCR检测方法对49 份市售羊肉制品进行检测，如表3所示。本研究的LAMP检测方法与real-time PCR方法特异性为100.00%，灵敏度为100.00%，总符合率为100.00%。由于目前检测阳性样本数较少，需后续增加样本数判断2 种方法的一致性。

表3 鼠源性成分的LAMP和real-time PCR法检测结果Table 3Results of LAMP and real-time PCR for murine-derived ingredients adulterated in real samples

3 讨 论

在利益的驱动下，市面上肉制品掺假行为时有发生，自从“欧洲马肉”事件曝光以来，肉制品掺假逐渐成为社会关注的热点问题[23-25]。随着时间的推移和科学技术的不断发展，肉制品鉴伪领域的检验技术日益完善。分子生物学检测技术逐渐成为食品检验领域监管的有效手段，基于PCR和real-time PCR的羊、牛、猪、鸭等动物源性快速检测技术已日趋成熟，并逐步进入国内外检测技术标准[26-27]。然而，使用鼠肉假冒羊肉违法行为被揭露的时间较短，而且，如今LAMP技术在肉制品掺假领域还没有成熟的标准可供应用。因此，国内外使用LAMP技术进行鼠源性成分定性和定量检测鲜有报道。目前，李欣南[1]使用PCR、电泳检测、LAMP等方法对小白鼠鼠源性成分进行检测；Suryawan等[28]基于PCR对牛肉丸子的大鼠肉掺假进行检测。而基于快速、灵敏、准确的LAMP技术建立的食品中大鼠和小鼠源性成分定性、定量检测方法鲜见有报道。

本研究设计了用于肉制品中大鼠和小鼠源性成分鉴定的LAMP引物，拟建立鼠源性成分的定性检测方法，基于鼠线粒体基因组序列设计特异性引物，与核DNA相比，线粒体DNA因为其独特的遗传方式和多拷贝而具有灵敏度高的特点，因此，线粒体DNA被广泛用于国内外饲料、生鲜及肉制品的来源追踪和食品中动物源性成分的鉴别以及掺假肉类的定性、定量检测[29-34]。本研究以大鼠COX基因（KP244683.1）和小鼠的16S rRNA基因（KY018919.1）作为目的基因设计LAMP引物，开发出鼠源性成分LAMP检测体系。结果表明，本研究建立的LAMP方法具有较好的特异性，大鼠和小鼠源性成分的检出限分别为0.1%和0.5%，对市售羊肉制品的恒温检测和real-time PCR方法检测结果具有高度一致性，总符合率为100.00%。

与李欣南[1]使用PCR、电泳检测和LAMP等对鼠源性成分进行检测方法相比，本研究建立的LAMP方法分别对大鼠和小鼠2 种鼠源性成分进行研究，而李欣南[1]仅针对小白鼠展开鼠源性检测，在实验对象方面本实验建立的鼠源性检测方法覆盖面更广。与其实验结果相比，本实验在确保检测方法特异性的前提下，将鼠源性检测的灵敏度提高了1 个数量级；同时，通过10 个平行实验的验证，本研究建立的鼠源性成分检测方法具有更高的稳定性。因此，本研究建立的鼠源性LAMP检测方法具有灵敏度高、特异性强、稳定性良好、操作简单、性价比高等优点。补充和完善了鼠源性检测的分子生物学检测方法，适用于基层检测单位或现场快速检测，实用性强，具有良好的研究、推广价值和应用前景。