ZAISe/ZnS量子点/壳聚糖复合包装的抑菌性能

周 游，王梦军，曹崇江,,*

（1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023；2.中国药科大学工学院，江苏 南京 211198）

果蔬因含有丰富的营养物质而容易滋生细菌，腐烂变质，从而丧失食用和商品价值，造成巨大的经济损失。因此，为延长果蔬货架期，开发新型抗菌保鲜包装材料具有重要意义。目前普遍使用的抗菌包装材料多以聚乙烯基为主要成分，通过添加不同的抗菌剂以达到抗菌效果。常用的抗菌剂有无机抗菌剂、有机抗菌剂和天然抗菌剂[1]。这种包装在给人们生活提供便利的同时，也带来较多白色污染[2]。为迎合我国绿色可持续发展理念，开发环境友好且抗菌性能良好的包装材料是目前主要的研究方向。

壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，具有良好的生物相容性、抗微生物活性、成膜性等[3]特点，且安全无毒。这些特性使壳聚糖被广泛应用于食品保鲜领域。近年来研究表明，壳聚糖膜可以延长草莓[4]、黄瓜[5]、天麻[6]等果蔬的货架期。张承等[7]研究发现，壳聚糖复合膜可以有效防止猕猴桃软腐病，抑制率达60%以上，同时能降低丙二醛含量，提高抗氧化酶活性，增强抗病性，且能够显着提高猕猴桃营养物质的含量。虽然已有研究表明壳聚糖复合膜具有一定的保鲜性能，但当其单独使用时，尚存在一些缺点，比如抗菌性能有限等[8]。

无机纳米材料由于具有较大的特异性表面积和较高的生物活性，被认为是抗菌剂的良好候选材料[9]。量子点属于无机纳米材料，一般由IV、II-VI、IV-VI或III-V族元素组成，多应用于生物医学领域，例如光热疗法治疗肿瘤[10]、体内荧光成像[11]等。此外，与传统无机纳米材料不同的是，量子点是一种在黑暗条件下抑菌效果较差，而光照条件下抑菌效果显着的材料。量子点在光的激发下可以产生活性氧，而活性氧过度累积引起的氧化应激则被认为是量子点发挥抗菌活性的主要机制[12]。一般原理是，当量子点被光能大于带隙的光照射时，量子点中的电子被推进穿过带隙到导带，从而在价带中产生空穴。导带中的电子和价带中的空穴分别表现出高的还原能力和氧化能力。电子可与氧分子发生反应，通过还原过程生成超氧阴离子。空穴可以从水和/或羟基离子中提取电子，通过氧化过程生成羟自由基。单线态氧主要是由超氧阴离子的水溶液反应间接产生的[13]。

本实验以壳聚糖为成膜基材，以ZAISe/ZnS量子点为光敏材料，制备量子点/壳聚糖抗菌复合膜。壳聚糖和过渡金属离子具有良好的螯合能力，壳聚糖上的氨基和羟基是量子点优良的封头基团，且壳聚糖的高黏性还可以防止量子点团聚[14]。此外，壳聚糖和量子点都有一定抑菌作用，两者复合将会发挥协同抑菌效果。鉴于量子点在光照条件下优异的抑菌效果，该复合膜有望成为超市等光照充足场所中果蔬保鲜新材料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538） 上海鲁微科技有限公司；人结肠癌细胞（HCT116、SHBCC E00078） 上海保藏生物技术中心。

醋酸锌（CH3COO)2Zn）、醋酸铟（In(C2H3O2)3）、十八烯（1-octadecene，ODE）、十二硫醇（1-dodecanethiol，DDT）、油酸（oleic acid，OA）、三巯基丙酸（3-mercaptopropionic acid，MPA）、硝酸银（AgNO3）、硒（Se）、硫（S）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；壳聚糖（脱乙酰度不低于85%）萨恩化学技术（上海）有限公司；醋酸、甲醇 上海阿达玛斯试剂有限公司；甘油 上海麦克林生化科技有限公司；蛋白胨、酵母提取物、氯化钠（NaCl）、琼脂 生工生物工程（上海）股份有限公司；无水氯化钙（CaCl2）、硝酸镁（Mg(NO3)2）、四氯化碳（CCl4）、溴化钾（KBr） 国药集团化学试剂有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT） 上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

ZNCL-TS100ML磁力搅拌器 上海羌强仪器设备有限公司；TU-1810PC紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Cary Eclipse荧光分光光度计美国Varian公司；HT7700透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM） 日本日立公司；TAXT plus型食品物性测定仪 英国Stable Micro Systems公司；MC-PF300B氙灯光源系统 北京镁瑞臣科技有限公司；SpectraMax190全波长酶标仪 南京百奥生物科技有限公司；S-3000N台式扫描电子显微镜 日本日立公司；CM-5色差仪 日本柯尼卡美能达公司。

1.3 方法

1.3.1 ZAISe/ZnS量子点的制备及表征

1.3.1.1 ZAISe/ZnS量子点的制备

取18.348 mg (CH3COO)2Zn、6.798 4 mg AgNO3和29.196 mg In(C2H3O2)3于三颈烧瓶中，加入4 mL ODE、0.5 mL DDT和50 μL OA，剧烈搅拌，N2条件下缓慢加热至175 ℃，10 min内形成透明溶液。向其中迅速注入Se溶液（将21.319 2 mg Se溶于0.5 mL OLA和0.2 mL DDT的混合溶液中），175 ℃下反应30 min。取18.348 mg (CH3COO)2Zn、3.206 5 mg S，溶于0.1 mL OLA和0.4 mL ODE的混合溶液中，充分溶解后，注入三颈烧瓶，175 ℃反应30 min[15]。

1.3.1.2 水溶性MPA@ZAISe/ZnS量子点的制备

将上述所得量子点溶液用甲醇沉淀两次，真空干燥。取10 mg干燥的ZAISe/ZnS量子点和0.919 g MPA，加入10 mL CCl4磁力搅拌6 h，加入10 mL H2O，对混合物进行涡流振荡、超声、离心。取沉淀，去离子水洗涤，冻干，制得干燥的MPA@ZAISe/ZnS量子点备用[16-17]。

1.3.1.3 量子点的表征

采用紫外可见光光度计、荧光光谱仪和TEM对量子点进行表征。

1.3.1.4 量子点的细胞毒性测定

采用Shan Jingyang等[18]的方法并稍作修改。将悬浮在DMEM培养基中的2×104个HCT116细胞（100 μL）接种于96 孔板中，37 ℃培养24 h后，再与不同质量浓度的MPA@ZAISe/ZnS量子点（0、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL）在DMEM培养基中（150 μL）孵育24 h，之后每孔加入5 mg/mL MTT（20 μL），继续孵育4 h，移除上清液，加入DMSO（100 μL），室温下振荡15 min，用酶标仪在495 nm波长处测定OD值。细胞活力按式（1）计算。

式中：OD空白为只有培养基组光密度值；OD对照为不加量子点组光密度值；OD样品为添加不同质量浓度量子点组光密度值。

1.3.2 量子点/壳聚糖复合膜的制备及表征

1.3.2.1 MPA@ZAISe/ZnS量子点壳聚糖复合膜的制备

壳聚糖膜的制备：称取1 g壳聚糖，溶于1%（体积分数）的冰醋酸溶液，加入甘油1 g，90 ℃低速搅拌20 min，用8 层纱布过滤除去不溶物，超声处理30 min后，将150 mL经上述步骤制得的膜溶液倒入模具（d≈250 mm）中，在（40±1）℃条件下干燥约48 h，保存备用[19]。

MPA@ZAISe/ZnS量子点壳聚糖复合膜的制备方法同壳聚糖膜的制备。待壳聚糖溶液搅拌完毕，加入75 mg MPA@ZAISe/ZnS量子点，搅拌、超声至完全溶解，用8 层纱布过滤除去不溶物，后续步骤同上。

1.3.2.2 膜的物理性能测定

厚度测定：在膜上选取5 个测量点，中间和四周各一个，用螺旋测微仪测定膜厚度。

抗拉伸强度、断裂伸长率测定：参照张璇等[20]的方法。将膜裁剪成长100 mm、宽15 mm长条形试样，初始夹距为80 mm，拉引速率为5 mm/min。

水蒸气透过率测定：参照张小涵[21]的方法。在洁净干燥的40 mm×25 mm称量瓶内，加入3 g无水氯化钙粉末，将待测膜覆盖在称量瓶瓶口，置于干燥器（底部加入饱和硝酸镁溶液，维持干燥器内的相对湿度为50%）内。平衡2 h后，每隔1 h测定一次称量瓶的质量，连续测定6 h。水蒸气透过率按式（2）计算。

式中：WVP为水蒸气透过率/（g·mm/（m2·h·kPa））；m为称量瓶增加的质量/g；d为膜的厚度/mm；t为测量时间/h；S为样品膜实验面积/m2；Δp为试样两侧的蒸汽压差（1.583 kPa）。

1.3.2.3 色差和透光率测定

采用色差仪对膜进行色差测定，以L*、a*和b*值表示，进行3 次测定。其中L*值为明度指数，0为黑色，100为白色；a*值为红绿度指数，从绿色（-）到红色（+）；b*值为黄蓝度指数，从蓝色（-）到黄色（+）。

透光率测定：将膜剪成1 cm×4 cm的矩形长条，将其紧密贴在比色皿壁上，以空气为对照，用紫外-可见光光度计在400～700 nm波长处测定透光率。

1.3.2.4 傅里叶变换红外光谱测定

将膜烘干剪碎后，与KBr混合研磨，均匀压片，在4 000～400 cm-1波数范围内扫描傅里叶变换红外光谱。

1.3.2.5 膜的扫描电子显微镜观察

利用扫描电子显微镜观察添加了MPA@ZAISe/ZnS量子点壳聚糖复合膜的表面形貌。将样品干燥，用导电双面胶带固定于不锈钢载物台上，溅射喷金后，壳聚糖膜和量子点/壳聚糖复合膜在10 kV加速电压下进行观察。

1.3.2.6 膜溶液的抑菌性测定

参照李迪等[22]的方法，将牛津杯铺平在培养皿上。吸取大肠杆菌/金黄色葡萄球菌细菌培养液于LB培养基中混匀，使菌液浓度为106CFU/mL，倒入培养皿，待培养基凝固后取出牛津杯，加入膜溶液。每组测试均设立3 个平行。将已制备好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实验组分为光照组和黑暗组，光照组用氙灯照1 h，黑暗组避光1 h，然后放入37 ℃的恒温培养箱，24 h后观察抑菌圈大小。使用十字交叉法记录抑菌圈直径的变化，并分析抗菌复合膜的抑菌性能。

1.4 数据处理与分析

所有实验重复3 次，结果以平均值±标准差表示。数据结果使用SPSS 20.0软件进行分析，采用独立性t检验法分析数据显着性，P＜0.01表示差异极显着。

2 结果与分析

2.1 量子点表征及毒性分析结果

2.1.1 量子点表征

由图1A可知，水溶性量子点的紫外-可见吸收光谱和初始的油溶性量子点的基本一致，而水溶性量子点的荧光强度与油溶性量子点相比较弱（图1B）。水溶性量子点的发射峰（700 nm）较初始量子点的发射峰（690 nm）发生轻微红移。通过透射电子显微镜对量子点的形貌进行分析，由图1C可知，油溶性量子点的尺寸在10 nm左右，均匀分散，而转水相后的量子点发生聚集，这是因为MPA分子链段短，并且没有去质子化，容易在两个-COOH之间产生氢键[23-24]（图1D）。

图1 采用MPA和配体交换相转移前后ZAISe/ZnS量子点表征Fig.1 Characterization of ZAISe/ZnS quantum dots before and after ligand exchange phase transfer using MPA

2.1.2 量子点的细胞毒性分析结果

食品包装的安全性是开发新型食品包装的首要前提，因此必须保证食品包装材料安全无毒。通过MTT法测定了MPA@ZAISe/ZnS量子点对HCT116人结肠癌细胞的毒性作用，细胞活力与吸光度成正相关。如图2所示，MPA@ZAISe/ZnS量子点的质量浓度为500 μg/mL时，细胞活力仍可达87.11%，根据细胞毒性反应分级，80%～99%样品毒性分级为1级，细胞毒性反应极轻微，表明该量子点安全无毒，具有良好的生物安全性。因此，该量子点可以作为抑菌剂与壳聚糖混合，制备安全无毒的复合膜。

图2 MPA@ZAISe/ZnS量子点对人结肠癌细胞（HCT116）活力的影响Fig.2 Effect of MPA@ZAISe/ZnS quantum dots on the viability of human colon cancer cells (HCT116)

2.2 膜的表征及抑菌效果

2.2.1 膜的物理性能

壳聚糖膜和量子点/壳聚糖复合膜的理化性质如表1所示。量子点的添加没有对壳聚糖膜的厚度产生显着影响，均为47 μm左右。壳聚糖膜的拉伸强度为3.24 MPa，复合膜的拉伸强度为3.97 MPa，相对有所提高。壳聚糖膜的断裂伸长率为2.56%，复合膜是2.82%，有一定程度的增加。壳聚糖膜和复合膜的水蒸气透过率分别为0.40 g·mm/（m2·h·kPa）和0.37 g·mm/（m2·h·kPa），量子点的加入相对降低了壳聚糖膜水蒸气的透过能力。

表1 膜的物理性质Table 1 Physicochemical properties of the films

2.2.2 膜的色差和透光度

由表2可知，壳聚糖膜的L*值为88.29，量子点/壳聚糖复合膜为66.95，L*值极显着下降；壳聚糖膜a*值为2.43，复合膜为5.06，a*值极显着上升；b*值则由壳聚糖膜的偏蓝变为复合膜的偏黄。由于量子点本身呈棕褐色，因此复合膜的颜色发生了改变，而量子点/壳聚糖复合膜的透光率与壳聚糖膜相比也显着降低。量子点的加入使壳聚糖膜的颜色加深，深色膜可能会影响感官评价效果，但是有研究报道，深色膜能够提高马铃薯和洋葱等农产品的贮藏品质[25]。

表2 膜的色差和透光度Table 2 Color parameters and transmittance of the films

2.2.3 膜的傅里叶变换红外光谱分析结果

通过傅里叶变换红外光谱对膜的官能团进行分析，从图3中可以看出，两种膜在3 400 cm-1处都有一个较明显的峰，这是-OH和-NH的伸缩振动吸收峰[26]。壳聚糖中存在分子内和分子间氢键，但由于氢键的长短和强弱不同，使得伸缩峰范围较宽。而量子点/壳聚糖复合膜中对应的峰相对较窄，则是由于量子点的加入影响了壳聚糖中分子间氢键。2 900 cm-1附近是C-H的两个伸缩振动峰，复合膜在3 000 cm-1处有一个峰，这是由于量子点的加入导致C-H的伸缩振动峰发生偏移。复合膜在2 560 cm-1的峰是-SH的伸缩振动峰[27]，这个特征峰在MPA@ZAISe/ZnS量子点中同样存在，因为MPA中有-SH的存在。1 650 cm-1和1 590 cm-1分别是酰胺I带吸收峰和酰胺II带吸收峰[28]，复合膜中酰胺I带吸收峰消失，酰胺II带吸收峰加强，归因于MPA中羰基的作用。

图3 膜的傅里叶变换红外光谱Fig.3 Fourier transform infrared spectra of the films

2.2.4 膜的扫描电子显微镜观察结果

如图4A所示，纯壳聚糖膜分子内和分子间氢键较多，所以结构相对规整，其表面均匀光滑没有杂质。量子点/壳聚糖复合膜的扫描电子显微镜图像（图4B）中白色部分为量子点，可以看出量子点在膜上分布较为均匀。这归因于壳聚糖网状分子结构上含有大量-NH3和-OH，可以和量子点表面的-SH相互作用，从而改变量子点的表面性质，最终改善了其在壳聚糖溶液中的分散效果[29-30]。

图4 膜的扫描电子显微镜图Fig.4 Scanning electron microscopic images of the films

2.2.5 膜溶液的抑菌性能

从图5A可以看出，在黑暗条件下，壳聚糖膜溶液和量子点/壳聚糖复合膜溶液均对金黄色葡萄球菌有一定的抑制效果。金黄色葡糖球菌是典型的革兰氏阳性菌，据报道，壳聚糖对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌[31]。从图5C中也可以明显看到，在黑暗条件下壳聚糖膜溶液和量子点/壳聚糖复合膜溶液对大肠杆菌的抑菌效果较差。从图5B、D中可以看出，在光照条件下量子点/壳聚糖复合膜溶液对两种菌的抑菌圈都要大于壳聚糖膜溶液的抑菌圈，并且对大肠杆菌的抑制效果更加明显。这是由于壳聚糖本身对革兰氏阴性菌的抑菌效果一般，而量子点是一种光敏材料，在光的激发下产生活性氧，活性氧可以氧化生物底物，从而导致不可逆的细胞损伤和酶失活，最终导致细胞死亡，发挥抑菌作用[32]。因此，复合膜在光照条件下表现出更显着的抑菌效果[33]。总之，光照条件下的量子点/壳聚糖复合膜溶液与壳聚糖膜溶液相比，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有极显着的抑菌效果（图5E）。活性氧还会破坏霉菌的孢子质膜的完整性，从而抑制霉菌的生长[34-35]。因此，量子点可以作为一种广谱抗菌材料，量子点/壳聚糖复合膜对果蔬表面的霉菌有潜在的抑制作用，预期该复合膜可以达到保鲜果蔬的目的。

图5 膜溶液的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effect of the film-forming solutions

3 结 论

将光敏材料ZAISe/ZnS量子点与壳聚糖复合制备成抑菌膜，通过对膜的物理性能测定发现，量子点的加入降低了壳聚糖膜的透光性；并且该复合膜在光照条件下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都表现出显着的抑菌效果，而在黑暗条件下的抑菌效果不显着。若要将该复合膜实际应用于果蔬的抗菌保鲜，其保鲜性能还有待进一步验证。总之，由于该量子点在光照条件下具有显着抑菌效果，并且这种量子点安全无毒，因此将ZAISe/ZnS量子点光敏材料加入壳聚糖等成膜基质中，有望成为果蔬保鲜方面新的发展方向。