冻融对牛瘤胃平滑肌胶原蛋白降解、交联及品质的影响

曹银娟，韩 玲,*，余群力，林 娟，李维正，邹小红，韩广星，韩明山

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃祁连牧歌实业公司，甘肃 张掖 734000；3.山东绿润食品有限公司，山东 临沂 276000；4.内蒙古科尔沁牛业股份有限公司，内蒙古 通辽 028000）

冷冻是目前食品保藏中较为重要的贮藏方法，然而新鲜牛瘤胃在运输、贮藏、消费过程中由于冷链技术不健全，温度波动比较大，在被食用之前一直处于冻结和解冻（冻融循环）的过程[1]，因此反复冻融在商业中不可避免。然而，反复冻融对肉制品品质会造成一定的影响，如色泽劣变、组织机械损伤、蛋白质变性、解冻后水分损失增加、脂质氧化等品质劣变现象[2-3]。

目前已有相关研究证明反复冻融是影响肉品品质变化的重要因素。反复冻融会引起重结晶现象的发生，致使冰晶数量减少和体积增大，破坏细胞膜结构，损伤细胞组织结构，加速蛋白质氧化变性和汁液流失[4]。李银等[5]研究发现牛肉中主要蛋白质的降解导致肌纤维结构破坏，使肌肉持水能力下降。Kim等[2]指出猪肉冷冻时随着冰晶体的形成，肌细胞受到机械损伤而破裂，大量水分渗出，同时肌纤维也会发生变形和断裂，使肌肉持水能力下降，导致解冻后肌肉大量汁液流失。有研究发现猪肉肌原纤维蛋白降解程度的增加显着加快了肌肉汁液的流失[6]。Zhou Feibai等[7]指出猪肉中氧化反应产生的羟自由基也会引发肌纤维蛋白氧化，使其发生变性和降解。游辉煌[8]研究发现随着冻融次数的增加，猪蹄感官品质下降，可能是由于猪蹄中含有较高的胶原蛋白。然而，平滑肌蛋白组成和结构均与骨骼肌存在差异，胶原蛋白含量较骨骼肌高10.1%[9]，而平滑肌在反复冻融过程中品质稳定性及引起品质变化的生化过程尚不清楚。

因此，本实验以牛瘤胃为研究对象，探究了反复冻融过程中牛瘤胃平滑肌品质稳定性变化及变化机理，旨在了解冻融次数对牛瘤胃平滑肌品质劣变的影响机制，以期为平滑肌肉用价值的开发、加工和品质控制提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛瘤胃购自于张掖市万禾草畜产业科技开发有限责任公司，源于随机选取的生长发育正常、健康无病、平均年龄3～4 岁体质量（600±30）kg的6 头公牛。将瘤胃置于保温箱（放冰袋）运至实验室。

赖氨酸吡啶啉（lysine pyridinoline，LP）、羟赖氨酸吡啶啉（hydroxylysine pyridinoline，HP）、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶酶联免疫检测试剂盒 上海远慕生物科技有限公司；戊二醛 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BS223S型电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；H/T16MM台式高速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；HH-8电热恒温水浴锅 常州市亿能实验仪器厂；JJ-2组织捣碎匀浆机 江苏国华电器有限公司；C-LM3B型数显肌肉嫩度仪 北京天翔飞域科技有限公司；PHS-3C便携式pH计 上海雷磁仪器厂；UV-1601酶标仪 日本岛津公司；JSM-5600LV扫描电子显微镜 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集和制备

取瘤胃用蒸馏水将表面冲洗干净，剔除筋膜及可见脂肪，用滤纸擦干表面水分并对案板、刀具及瘤胃用体积分数75%乙醇溶液消毒至完全挥发。将肉样切成质量100 g左右的方块，用聚乙烯食品保鲜袋包装，样品随机分为6 组，每组3 份平行，在-18 ℃ 冷冻12 h、4 ℃ 解冻12 h（此为冻融1 次），分别在冻融0、1、2、3、4、5 次后测定相应的指标。

1.3.2β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸酶活力的测定

β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶活力均采用试剂盒进行测定，具体操作和计算参照各试剂盒的说明书。

1.3.3 HP和LP含量测定

HP、LP含量的测定参考莎丽娜[10]的方法，取样品1 g左右于50 mL离心管中，按1∶9（m/V）加入磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L、pH 7.4），10 000 r/min冰浴匀浆。然后4 ℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液进行测定。测定步骤及计算参照试剂盒说明书进行。

1.3.4 扫描电子显微镜观察

使用扫描电子显微镜观察牛瘤胃平滑肌微观结构，样品制备方法参考常海军[11]的方法并稍作修改。将样品切割成2 mm×2 mm×5 mm的肉条在体积分数2.5%戊二醛溶液中于4 ℃下固定3 d，用蒸馏水彻底冲洗，样品表面用离子溅射法涂覆金属薄膜（10 nm），然后在扫描电子显微镜（20.0 kV）下放大300 倍观察微观结构。

1.3.5 胶原蛋白热溶解性测定

参考常海军[11]的方法测定。以羟脯氨酸作为标准物质制作标准曲线，标准曲线方程为y＝0.217x-0.002 5，R²=0.999 8（其中x为羟脯氨酸质量浓度/（μg/mL）；y为吸光度）。羟脯氨酸的含量乘以系数7.25换算为胶原蛋白含量，其中上清液中的蛋白含量为可溶性胶原蛋白含量；沉淀中的蛋白含量为不溶性蛋白含量。胶原蛋白溶解性通过式（1）进行计算。

1.3.6 pH值测定

参考Zuo Huixin等[12]的方法，将解冻后的样品用便携式pH计测定pH值，将探头插入肉样中，使其电极与牛瘤胃平滑肌肌肉组织充分接触，待pH计读数稳定后记录数值，每个样品测定3 次平行，结果取其平均值。

1.3.7 解冻损失率测定

在第n次冷冻之前测定样品的质量（mn1/g），解冻之后用滤纸擦拭样品表面去除水分，再次称质量（mn2/g），第n次解冻损失率按式（2）计算。

1.3.8 剪切力测定

参照NY/T 1180—2006《肉嫩度的测定 剪切力测定法》，将熟制平滑肌沿平行于肌纤维方向切取40 mm×10 mm的肉样，将2～3 个样品堆叠至样品自然高度为10 mm后采用数显肌肉嫩度仪自带的“V”型剪切刀架测定剪切力，重复6 次取平均值，单位以kgf表示。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，结果采用平均值±标准差表示，相关性分析采用Pearson相关系数分析法，各处理平均数间采用Duncan多重比较法进行差异显着性分析，P＜0.05表示差异显着，P＜0.01表示差异极显着。

2 结果与分析

2.1 冻融次数对牛瘤胃平滑肌β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸酶活力的影响

β-葡糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶可降解肌内胶原蛋白基质多糖（蛋白多糖）[8]，而蛋白多糖是维持结缔组织机械强度的主要成分，其降解可以改善肉的嫩度[13]。由图1A可知，随着冻融次数的增加，β-半乳糖苷酶活力先上升后下降，在冻融4 次时达到最大（13.26 U/L），显着高于新鲜平滑肌（6.79 U/L）（P＜0.05），可能原因是冻融处理可以弱化或破坏细胞结构；但冻融5 次时β-半乳糖苷酶活力下降至11.31 U/L，可能是冻融处理对酶本身的破坏性影响使得活力下降。由图1B可知，随着冻融次数的增加，β-葡糖醛酸酶活力呈波动式上升（P＜0.05），冻融5 次时β-葡糖醛酸酶活力与新鲜平滑肌相比增加了76.60%。说明牛瘤胃冻融过程肌内胶原蛋白基质多糖降解程度增加，这与Lee等[14]的研究结果一致。

图1 反复冻融过程中牛瘤胃平滑肌β-半乳糖苷酶活力（A）和β-葡糖醛酸酶活力（B）的变化Fig.1 Changes in β-galactosidase activity (A) and β-glucuronidase activity (B) in bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.2 冻融次数对牛瘤胃平滑肌胶原蛋白HP和LP含量的影响

HP和LP是胶原蛋白交联途径中主要的稳定交联产物，其含量越高，嫩度越差，交联是胶原蛋白的主要性质，胶原蛋白在体内合成后会发生不同程度的交联[15]。如图2A所示，HP含量随冻融次数（0～4 次）的增加呈上升趋势（P＜0.05），冻融4 次时较新鲜平滑肌上升了384.50%，冻融5 次时略有下降（P＞0.05）。如图2B所示，随冻融次数的增加，LP含量基本呈“直线”趋势增加，冻融5 次时较新鲜平滑肌增加了325.93%。表明随冻融次数的增加，肌肉中胶原蛋白的交联度增大，与宦海珍[16]研究发现秘鲁鱿鱼解冻过程中肌原纤维蛋白变性导致交联物产生的结果一致。

图2 反复冻融过程中牛瘤胃平滑肌HP（A）和LP（B）含量的变化Fig.2 Changes in HP (A) and LP (B) contents in bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.3 冻融次数对牛瘤胃平滑肌微观结构的影响

反复冻融过程中瘤胃结缔组织结构变化如图3所示，新鲜牛瘤胃平滑肌整体上肌纤维结构清晰，排列规整且紧密，肌束膜完整基本没有破裂；冻融1 次时，牛瘤胃平滑肌肌纤维束之间有细小空隙，肌束膜和肌内膜有轻微的裂痕，说明牛瘤胃平滑肌肌束膜发生了轻微的收缩。冻融3 次时，牛瘤胃平滑肌肌纤维结构较为清晰，但肌纤维之间空隙增大，排列较松散；冻融5 次时，牛瘤胃平滑肌肌束膜及肌内膜破损断裂程度严重，肌纤维束间空隙增多且变大，肌纤维排列杂乱，可以观察到肌纤维与肌内膜明显剖离，说明牛瘤胃平滑肌肌束膜收缩程度更为剧烈。随着冻融次数增加，组成肌肉的各个肌束之间的缝隙明显增多，显示出组织结构的弱化。即随着冷冻-解冻次数的增加，牛瘤胃平滑肌肌纤维发生明显断裂、结缔组织膜严重受损，使肌肉失去原有的完整性，可能是与冻融过程中蛋白质的降解和冰晶体的机械破坏作用有关，这与李银等[5]的研究结果一致。

图3 反复冻融过程中牛瘤胃平滑肌微观结构的变化Fig.3 Changes in microstructure of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.4 冻融次数对牛瘤胃平滑肌剪切力的影响

剪切力是肉品嫩度的直接反映，剪切力越小，肉嫩度越好[17]。由图4可知，随着冻融次数的增加，牛瘤胃平滑肌剪切力呈先上升再下降趋势（P＜0.05），冻融1 次时达到最大（9.70 kgf），冻融5 次时较新鲜平滑肌下降了28.79%，其变化趋势与Shanks等[18]对牛肉的相关品质研究基本一致。剪切力在冻融1 次时显着上升可能是因为冻融后持水力下降导致肌肉收缩，使肌纤维排列更加紧致；而冻融1 次后剪切力下降，一方面是因为冰晶随着冻融次数增加反复形成和消失，使细胞膜和组织结构不断受到机械损伤而导致肌纤维结构降解和破裂，蛋白多糖降解，胶原蛋白溶解性增大，从而使牛瘤胃平滑肌肌肉质地变软[19-20]；另一方面，反复冻融后肌肉细胞失水、平滑肌间隙增大，也会导致剪切力降低[21]。常海军[11]研究发现牛肉中胶原蛋白交联度的增加使胶原蛋白的纤维网状结构更加稳定，能增加肌肉结缔组织强度，使肌肉剪切力增大，这与本实验研究结果不一致，可能是贮藏方式和肌肉种类不同所致[10-11]。

图4 反复冻融过程中牛瘤胃平滑肌剪切力的变化Fig.4 Changes in shear force of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.5 冻融次数对牛瘤胃平滑肌胶原蛋白溶解性的影响

胶原蛋白溶解性是胶原蛋白的主要性质，也是影响肉品嫩度的主要因素之一[22]。由图5可知，随冻融次数的增加，胶原蛋白溶解性显着增加（P＜0.05），可能是因为冻融过程中冰晶的作用使平滑肌肌束膜和肌内膜蛋白多糖降解、结缔组织膜被破坏，增加了胶原蛋白溶解性，从而使剪切力下降，嫩度改善。冻融4 次时胶原蛋白溶解性较新鲜平滑肌增加了21.05%，随冻融次数的进一步增加变化不显着（P＞0.05）。

图5 反复冻融过程中牛瘤胃平滑肌胶原蛋白溶解性的影响Fig.5 Changes in collagen solubility of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.6 冻融次数对牛瘤胃平滑肌pH值的影响

pH值是影响肉品持水性的主要因素之一[23]。李婉竹等[24]研究表明在冻融循环过程中肌肉蛋白发生降解产生的氨基酸中，当碱性自由氨基酸含量高于酸性自由氨基酸含量时，pH值就会升高，反之则减小。由图6可知，随着冻融次数的增加，pH值呈先上升后下降趋势，冻融1 次时，较新鲜平滑肌上升了3.33%，可能是由于肌肉中的蛋白质分解成胺类等碱性物质。冻融5 次时pH值较新鲜平滑肌下降了3.06%，可能与反复冻融引起肌纤维及基质中蛋白变性，影响肌肉组织内酸碱平衡有关[4]。阿依木古丽等[25]研究发现随着冻融次数的增加牛肉背最长肌的pH值显着降低。

图6 反复冻融过程中牛瘤胃平滑肌pH值的变化Fig.6 Changes in pH of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.7 冻融次数对牛瘤胃平滑肌解冻损失率的影响

肉中的细胞液随着冻融次数的增加不断从肌肉组织内部渗出，不仅影响其外观，而且使肌肉中的营养成分和汁液流失增多[26]。解冻损失率是衡量肉品加工性能和营养成分损失程度的重要指标，解冻损失率越高，保水性越差[27]。从图7可以看出，牛瘤胃平滑肌解冻损失率随冻融次数增加显着升高（P＜0.05），主要是因为在反复冻融过程中牛瘤胃平滑肌中冰晶不断形成和消失，使组织结构和细胞膜受到机械损害，解冻时细胞中的水分、营养成分和可溶性蛋白逐渐流失，最终导致牛瘤胃平滑肌的保水性下降[28]，这与Boonsumrej等[27]的研究结果一致。解冻损失率在前3 次冻融循环中增加了26.16%，在后2 次冻融循环中增加了64.96%，说明在冻融次数超过3 次时，保水性的下降速率加快。这可能是因为牛瘤胃平滑肌水分在冷冻过程中体积增加使肌细胞的细胞膜破裂[29]。

图7 反复冻融过程中牛瘤胃平滑肌解冻损失率的变化Fig.7 Changes in thawing loss of bovine smooth muscle during freeze-thaw cycles

2.8 牛瘤胃平滑肌品质指标与胶原蛋白降解、交联指标间相关性分析

由表1可知，在冻融循环过程中，剪切力与β-半乳糖苷酶活力、β-葡糖醛酸酶活力、HP含量、LP含量和胶原蛋白溶解性呈极显着负相关性（P＜0.01）。结合前面这些指标测定结果，可以说明随着冻融次数的增加，肌内胶原蛋白基质多糖显着降解、溶解性增大，结缔组织弱化加剧，导致剪切力下降。Nishimura等研究表明牛肉肌束膜中的蛋白多糖显着降解，加快了牛肉结缔组织弱化，显着改善了牛肉的嫩度[30]，与本实验结果一致。然而，有研究表明胶原蛋白交联可提高剪切力，而本实验结果得出胶原蛋白交联物HP和LP含量与剪切力呈极显着负相关（P＜0.01），因此，牛瘤胃平滑肌嫩度改善主要取决于冰晶对肌肉的破坏和蛋白降解的作用，而蛋白交联对其影响较小。解冻损失率与pH值呈显着负相关（P＜0.05），与HP含量、LP含量呈极显着正相关（P＜0.01）；Liu Zelong等[31]研究发现蛋白质发生交联与肉的保水性呈显着负相关（P＜0.05），Melody等认为pH值降低是肉保水性下降的主要原因[32]，与本实验研究结果一致。

表1 牛瘤胃平滑肌各指标间的Pearson相关系数Table 1 Pearson correlation coefficients among various indicators

3 结 论

随着冻融次数的增加，牛瘤胃平滑肌胶原蛋白降解程度（β-半乳糖苷酶活力、β-葡糖醛酸酶活力）增大，结缔组织破坏严重，胶原蛋白溶解性增大，胶原蛋白交联度增大，解冻损失率增大，使牛瘤胃平滑肌保水性下降。冻融超过1 次后，剪切力下降，说明平滑肌嫩度逐渐得到改善。然而，在冻融3 次后，剪切力下降速率变慢，解冻损失率升高速率加快。因此，从食用品质和商业价值综合考虑，冻融次数应控制在3 次以内。