赤芝多糖对小鼠急性酒精性肝损伤的保护效果和作用机制

叶丽云，程 冰，马水丽，郝金斌，孟国良，傅俊生，吴小平

（福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002）

中国酒文化源远流长，如今在先进的制造工业、富裕的生活水平、多样的交际娱乐生活等多方面影响下，经常性饮酒已成为现代人的常态。在酒桌交际中，偏好高乙醇体积分数白酒易造成一次性大量饮酒。短时间大量饮酒会对肝脏造成严重损害，罹患急性酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）的危险性高[1]。氧化应激反应是导致ALD的重要原因，乙醇摄入机体内后会促进超氧阴离子、过氧化氢等活性氧的大量产生，并且导致体内谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化成分减少，从而促发氧化应激[2]。这个过程会引起肝细胞大分子物质过氧化等毒性作用而导致肝细胞的坏死。为此，人们开发了多种合成药用于治疗该类疾病，然而这些合成药物在ALD临床研究中没有实质疗效，并且伴随着不可预测的副作用。所以，寻找具有良好的保肝活性且副作用很小的天然抗氧化药物对酒精性肝病的预防和治疗具有十分重要的意义。

灵芝（Ganoderma lingzhi）是多孔菌科（Polyporaceae）真菌[3-4]，又名赤芝、仙草等。灵芝含有多糖、三萜、不饱和脂肪酸、生物碱、甾醇类物质等多种活性物质[5]。科学研究证实，作为灵芝主要活性成分之一的多糖能够有效降血糖，抑制癌细胞增殖，提高机体免疫力等[6-8]，因此多糖含量成为灵芝品质评估的重要指标之一。灵芝多糖作为一种天然提取成分，安全、无毒副作用且成本低，常用于临床癌症的辅助治疗、治疗病毒性肝炎、治疗神经衰弱与失眠等神经性疾病[9-10]。

转录组测序是最近几年发展起来的利用深度测序技术进行转录分析的方法，可以对全转录组进行系统的研究，为作用机制方面的研究提供有效手段。余贤美等[11]通过全转录组分析发现涉及植物-病原互作、细胞凋亡和类黄酮生物合成相关的基因在苹果苦痘病发生过程中发挥着重要的作用；田甜甜等[12]基于转录组学解析酿酒酵母耐酸机制，确定了8 个与耐酸性有关的重要基因。基于转录组测序，Ding Xiaomeng等[13]研究指出黑灵芝多糖在肠上皮与其免疫细胞作用时，细胞因子相互作用、核因子（nuclear factor，NF）-κB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路是3 条重要作用通路；Wang Hui等[14]发现黑灵芝多糖刺激树突状细胞受到免疫应答和免疫功能的调节，其中PI3K/Akt和NF-κB通路起重要作用。本实验以赤芝102为研究材料，利用转录组技术探索赤芝多糖对小鼠急性酒精性肝损伤的预防作用机制，为天然保肝药物的挖掘提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

昆明种雄性小鼠50 只，由海王福药制药有限公司提供，体质量18～22 g，使用许可证号为SYXK（闽）2019-0004。

赤芝102 福建农林大学菌物研究中心；无水乙醇、氯仿、正丁醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和SOD测定试剂盒 南京建成有限公司；E.Z.N.A. Total RNA Kit I试剂盒 美国Omega Bio-Tek公司；2100 RNA Nano 6000试剂盒 美国安捷伦公司；Top Green qPCR SuperMix荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）、TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒 北京全式金有限公司。

1.2 仪器与设备

CP214分析天平 上海奥豪斯仪器有限公司；UV-vis 1800紫外-可见吸收光谱仪 岛津（上海）实验器材有限公司；HL-2S恒流泵 上海青浦沪西仪器厂；ST16R高速冷冻离心机、Nicolet iS 50傅里叶变换红外光谱仪、Varioskan Flash多功能酶标仪 美国赛默飞世尔科技公司；N-001旋转蒸发仪 上海艾郎仪器有限公司；HWS12电热恒温水浴锅 上海一恒科技仪器有限公司；荧光qPCR仪CFX96 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 赤芝多糖的制备与鉴定

称15 g的赤芝菌丝体粉末，置于500 mL离心瓶，加300 mL蒸馏水并封口。90 ℃热水浸提4 h后，3 000 r/min离心10 min并收集上清液。重复上述浸提操作，合并两次上清液[15-16]，加入3 倍体积无水乙醇进行醇沉12 h。5 000 r/min离心10 min，弃去上清液。向沉淀中加入200 mL蒸馏水振荡使沉淀充分溶解得到粗多糖溶液，分装到50 mL离心管中，每管加入3 倍体积的Sevag试剂除去粗多糖中的蛋白质。将多糖溶液装入透析袋并封口，用流水（去离子水）透析2 d除去多糖中的小分子杂质。透析完毕后将多糖溶液冻干，得到赤芝菌丝体多糖（Ganoderma lingzhimycelia polysaccharide，GLMPS）。赤芝子实体多糖（Ganoderma lingzhifruiting body polysaccharide，GLFPS）的制备方法相同，由赤芝子实体制备得到GLFPS。取适量赤芝多糖和干燥溴化钾粉末按照质量比1∶200混匀研磨后压片，用傅里叶变换红外光谱仪在4 000～500 cm－1范围内扫描并鉴定所得多糖[17]。

1.3.2 小鼠分组及模型建立

饲养条件为通风良好，照明与黑暗各12 h，温度22 ℃，每3 d进行一次常规消毒。垫料、饮水瓶和笼子要根据情况换洗，保持小鼠生存环境干净和干燥[18]。适应性喂养1 周。为探明赤芝多糖对小鼠酒精肝损伤的预防效果，将50 只小鼠随机分为5 组，包括空白组（CK）、模型组（Model）、GLMPS组（200 mg GLMPS/kgmb）、GLFPS组（200 mg GLFPS/kgmb）和阳性组（300 mg联苯双酯/kgmb），每组10 只。空白组和模型组小鼠每天定时灌胃0.3 mL蒸馏水；GLMPS组、GLFPS组和阳性组小鼠每天分别定时灌胃200 mg GLMPS/kgmb、200 mg GLFPS/kgmb和300 mg联苯双酯/kgmb（溶解在去离子水中，每只小鼠灌胃体积为0.3 mL溶液）。连续灌胃1 周，整个实验中保持正常进食和饮水[19]，每天20点禁食，第2天定时空腹灌胃样品再饲喂饲料。在最后一次灌胃4 h后，空白组灌胃12 mL/kgmb的蒸馏水，其他4 组灌胃12 mL/kgmb体积分数50%的乙醇溶液，灌胃后12 h内禁食不禁水。

1.3.3 小鼠醒酒时间和醉酒时间测定

将醉酒小鼠腹部向上放置。若30 s内小鼠没有调换姿势，变成腹部朝下，说明此时小鼠处于醉酒状态，即翻正反射消失，乙醇溶液灌胃开始到翻正反射消失的时长为醉酒时间；若30 s内小鼠调换姿势变成腹部朝下则说明醒酒，将翻正反射消失到恢复的时长记为醒酒时间[20]。记录小鼠的醒酒时间与醉酒时间。

1.3.4 肝脏指数与生化指标测定

用颈椎脱臼法处死小鼠后立即解剖，取出肝脏后放入含50 mL生理盐水的离心管中，摇晃多次清洗血液，重复3 次。用干净滤纸吸干生理盐水，拍照记录并测定质量。计算肝脏指数（肝脏质量/体质量×100%）。切下肝脏组织，一部分肝脏组织放入体积分数10%的福尔马林溶液固定，制作肝脏病理切片[21-23]；剩余肝脏组织保存于－80 ℃冰箱中备用，分别参考MDA、CAT和SOD测定试剂盒说明书检测肝脏中的MDA、CAT和SOD水平。

1.3.5 转录组分析

利用E.Z.N.A. Total RNA Kit I试剂盒提取实验小鼠肝组织中的RNA，用NanoDrop ND-1000型DNA检测仪检测各组肝脏的RNA浓度，用2100 RNA Nano 6000试剂盒进行质量检测。将质量良好的RNA样品送至中国新科技有限公司，利用Illumina测序平台进行转录组测序。将测序所得的clean data利用HISAT2软件比对到参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息[24]。每个样本的基因表达水平用每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）表示。以P＜0.05和log2（差异倍数）的绝对值大于1作为差异显着性标准，筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）[25]。在线数据分析平台OmicShare（http://www.omicshare.com/tools）上对DEGs进行基因本体（gene ontology，GO）与京都基因和基因组（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库的富集分析。

1.3.6 荧光定量聚合酶链式反应

将1.3.5节得到的质量良好的肝组织RNA利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒反转录成cDNA，以GADPH基因为内参基因，在CFX96 PCR仪上进行荧光qPCR检测，引物序列见表1。

表1 荧光qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for fluorescence qPCR

1.4 数据处理与分析

每组处理设计3 个重复，结果以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan检验进行显着性分析，P＜0.05表示差异显着，P＜0.01表示差异极显着。采用GraphPad Prism 6.01软件作图。

2 结果与分析

2.1 赤芝多糖的傅里叶变换红外光谱分析结果

将提纯后的GLMPS与GLFPS用红外光谱进行鉴定分析，结果如图1所示。两光谱分别在3 408.22 cm－1和3 406.39 cm－1处的吸收峰是由于游离的O－H伸缩振动形成的，该峰为多糖的羟基吸收峰；GLMPS与GLFPS分别在2 929.81 cm－1和2 925.95 cm－1处呈现的吸收峰是由于C－H非对称伸缩振动引起的，1 654.89cm－1和1 639.46cm－1处的吸收峰是羧基的C＝O伸缩振动引起，1 386.79 cm－1和1 415.72 cm－1处是C－H的变角振动特征吸收峰，在1 200～1 000 cm－1间也都出现吸收峰，这些都是糖类物质的特征吸收峰，由此可见，提取得到的GLMPS与GLFPS确为多糖。

图1 GLMPS（A）和GLFPS（B）的傅里叶变换红外光谱图Fig. 1 FTIR spectra of GLMPS (A) and GLFPS (B)

2.2 赤芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠翻正时间的影响

翻正反射的出现和消失是判断小鼠乙醇中毒情况的重要依据。如表2所示，阳性组、GLMPS组与GLFPS组翻正反应消失与恢复的时间都与模型组有极显着差异（P＜0.01），说明赤芝多糖能够延长小鼠醉酒时间并缩短醒酒时间，有效的缓解小鼠急性乙醇中毒情况。

表2 赤芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠翻正时间的影响Table 2 Effects of G. lingzhi polysaccharides on righting reaction time in mice with acute alcoholic liver injury

2.3 赤芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏的影响

分析赤芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数的影响，结果如表3所示，模型组与空白组对比，小鼠肝指数显着提高0.95%，说明高剂量乙醇灌胃可能会导致小鼠肝脏受损，引发肝水肿和脂质积累，初步表明此次实验造模成功。多糖组和阳性组的肝脏指数与模型组相比降低（0.615±0.115）%，差异显着（P＜0.05），表明赤芝多糖可一定程度地降低肝脏指数且GLFPS效果优于GLMPS。

表3 赤芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数的影响Table 3 Effects of G. lingzhi polysaccharides on liver index in mice with acute alcoholic liver injury

2.4 赤芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏相关酶活性的影响

为证实赤芝多糖对小鼠急性肝损伤的预防保护功效，进一步检测肝脏组织中MDA含量、CAT和SOD活力。如图2所示，乙醇引起的肝损伤会导致模型组中MDA含量升高，CAT和SOD活力降低，进一步证明此次实验造模成功。与模型组相比，GLMPS组和GLFPS组的MDA含量分别降低37.63%、46.13%，由此发现GLFPS减少炎症反应中MDA含量的效果最好，更接近于联苯双酯。SOD是清理动物体内超氧化自由基的天然内源性抗氧化酶，是判断机体抗氧化水平高低的标志。模型组的CAT和SOD活力均低于空白组，说明肝损伤会导致CAT和SOD的活性下降。与模型组的CAT和SOD水平相比，GLMPS组分别升高53.55%、24.97%，GLFPS组分别升高97.37%、26.40%，说明赤芝多糖能缓解肝损伤所导致的抗氧化能力降低，在提高CAT活力来减轻机体氧化应激反应方面，赤芝GLFPS功效优于GLMPS和联苯双酯。

图2 赤芝多糖对急性酒精性肝损伤小鼠MDA（A）、CAT（B）、SOD（C）水平的影响Fig. 2 Effects of G. lingzhi polysaccharides on the levels of MDA (A),CAT (B) and SOD (C) in the liver of mice with acute alcohol liver injury

2.5 赤芝多糖对小鼠肝脏病理改变的影响

将小鼠肝脏制成病理切片，如图3所示，对照组小鼠的肝小叶构造非常清晰，界板整齐，细胞索排列井然有序，细胞结构清晰明了，无泡沫状变异，肝窦无充血现象；模型组小鼠肝小叶的界线变得模糊不清，细胞索排列零乱，肝窦变窄且充血现象十分明显，细胞呈现浊肿情况，出现泡沫或气球样变异且胞浆淡染，说明急性乙醇灌胃会引起明显的肝损伤；GLMPS、GLFPS以及联苯双酯都显着改善了肝细胞浊肿和肝细胞索零乱情况，肝小叶界限也变得明显，没有发现明显细胞坏死。

图3 肝脏组织病理切片（200×）Fig. 3 Pathological observation of liver tissues (200 ×)

2.6 转录组数据可信度分析

为进一步探究赤芝多糖对酒精性肝损伤的预防作用，将空白组、模型组和GLFPS组小鼠肝脏样品进行转录组测序，样品基因表达水平相关性如图4A所示。各样品之间的相关系数r＞0.930，这说明所测样品生物学重复性好，样品之间表达模式的相似度越高。用主成分分析来判断组间差异发现，通过主要差异特征PC1、PC2能够有效将3 组样品区分开（图4B），表明不同处理组差异明显。综上可见，转录组数据具有较高可信度。

图4 数据可信度分析结果Fig. 4 Credibility analysis of transcriptome data

2.7 差异表达基因筛选

利用火山图能够迅速查看基因在对比的两组样品中表达基因差异结果统计学显着性。如图5所示，模型组与空白组共有520 个DEGs，其中211 个基因下调，309 个基因上调。GLFPS组与模型组有468 个DEGs，其中227 个基因下调和241 个基因上调。以模型组与空白组、GLFPS组与模型组中表达差异趋势相反为条件筛选差异基因进行下一步富集分析，筛选出94 个满足条件的DEGs。

图5 DEGs的火山图（A）与维恩图（B）Fig. 5 Volcano plots (A) and Venn diagram (B) of DEGs

2.8 差异基因富集分析

首先对筛选的DEGs进行GO富集分析，结果如图6A所示。这些DEGs主要涉及生物学功能（biological process）中的脂肪酸代谢过程（fatty acid metabolic process）、一元羧酸代谢过程（monocarboxylic acid metabolic process），分子功能（molecular function）中的胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor）、谷胱甘肽转移酶活性（glutathione transferase activity）以及细胞成分（cellular component）中的膜攻击复合物（membrane attack complex）、外泌体（extracellular exosome）。对DEGs的进行KEGG富集分析挖掘赤芝多糖对酒精性肝损伤作用相关的通路，发现所筛选的DEGs主要涉及的通路包括谷胱甘肽代谢、细胞色素P450、视黄醇代谢（图6B）。

图6 DEGs的GO（A）与KEGG（B）富集图Fig. 6 GO (A) and KEGG (B) enrichment analysis of DEGs

2.9 差异表达基因的对比验证

对富集到通路上的部分基因进行实时荧光qPCR验证，结果如图7所示。Cyp2e1、Cyp1a1、Ugt2b381、Adh1为细胞色素P450通路上基因。在模型组中乙醇使得Cyp2e1显着上调表达，Ugt2b381、Adh1显着下调表达。与模型组相比，GLFPS组Cyp2e1、Cyp1a1的表达显着下调，Ugt2b381、Adh1显着上调表达。说明赤芝多糖能够有效抑制因乙醇作用而产生的细胞色素P450通路上基因的差异表达。基因Aldh1a1、Aldh1a2、Aox1、Rdh9为与视黄醇代谢相关基因。乙醇使Aox1基因在模型组中显着上调表达，Aldh1a1、Aldh1a2、Rdh9基因显着下调表达。与模型组相比，Aox1基因呈下调表达，Aldh1a1、Aldh1a2、Rdh9基因上调表达，说明赤芝多糖能够通过调控视黄醇代谢相关基因的表达来对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用。这一结果基本与转录组分析结果相一致，从而证明了转录组分析的准确性。

图7 GLFPS对急性酒精性肝损伤小鼠基因表达的影响Fig. 7 Effects of GLFPS on gene expression in the liver of mice with acute alcohol liver injury

3 讨 论

肝脏是人体最大的腺体器官，极易受有毒化学物质损伤，造成肝脏代谢功能紊乱。大量乙醇摄入会导致脂肪肝、肝炎、肝硬化，目前肝损伤已成为尤为突出的全球性健康问题[26]。前期有研究表明，乙醇在摄入机体后在体内经乙醇脱氢酶、细胞色素P450系统、CAT系统代谢生成乙醛，同时生成大量的羟自由基[27]，从而破坏氧化还原平衡状态，导致肝脏氧化应激损伤。本研究以体积分数50%乙醇溶液灌胃小鼠建立急性酒精性肝损伤模型，比较GLFPS与GLMPS对酒精性肝氧化损伤的保护效果。

动物体过氧化脂质代谢反应的产物为MDA，MDA积累过多会诱导细胞膜产生过氧化反应，损坏细胞膜的结构与功能，最终导致细胞坏死和凋亡[28]。SOD是清理动物体内超氧化自由基的天然内源性抗氧化酶，能够促使H2O2和O2产生，而CAT则能水解SOD产生的H2O2，从而减少机体超氧阴离子自由基数目，通过有效抑制脂质过氧化反应来保护机体；因此，肝脏中SOD、CAT、MDA水平是评价肝酒精性氧化损伤的几大重要指标。本研究结果表明赤芝菌丝体和子实体多糖对小鼠急性乙醇灌胃所导致的肝损伤有很好的预防保护效果。赤芝多糖可以缓解小鼠由于酒精性肝损伤引起的肝指数与MDA水平升高，提高SOD和CAT活性来加快体内脂质代谢和氧化分解，通过减轻氧化应激反应并提高抗氧化能力来保护肝脏。

食用菌中子实体与菌丝的多糖差异较大。冮洁等[29]通过比较4 种食用菌发现，菌丝体多糖抗氧化活性优于子实体多糖；邵丽晓等[30]的研究结果表明蛹虫草菌丝体多糖与子实体多糖体外免疫调节最佳作用浓度存在一定差异；于华峥等[31]指出灵芝子实体的单糖主要为葡萄糖和半乳糖，菌丝体单糖主要为葡萄糖，作用效果也不相同，在医药保健品使用中应区分。本研究从肝脏指数、MDA活力、CAT活力以及病理切片上比较发现GLFPS对小鼠酒精性肝损伤的预防作用效果优于GLMPS。

当前，转录组分析已成熟地应用于各个领域。本研究利用转录组分析技术探索了赤芝多糖对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用，筛选出符合条件的DEGs 94 个，进行GO和KEGG富集分析，结果显示这些DEGs主要涉及脂肪酸代谢、一元羧酸代谢、胰岛素样生长因子、谷胱甘肽转移酶活性等，主要涉及的通路包括谷胱甘肽代谢、细胞色素P450、视黄醇代谢。谷胱甘肽主要通过其功能基团巯基和γ-谷氨酰胺键参与体内多种生理生化功能与物质代谢，能减少氧应激性损害及脂质过氧化诱致的肝纤维化，解除外源性有毒物质的毒性，对肝脏起到保护作用[32-33]。赤芝多糖能够通过调节谷胱甘肽代谢相关基因的表达来预防急性酒精肝损伤。

细胞色素P450是一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，在细胞对抗炎症反应和促进细胞凋亡方面，细胞色素P450家族有着重要作用，主要承担90%的外源性药物（环境毒物、治癌药物）和内源性化合物（类固醇、脂肪酸、激素）的生物转化任务[34]。大量乙醇代谢反应会引起Cyp2e1高度表达，并在肝脏积累大量超过本身调节能力的活性氧和活性氮，进而导致自身氧化系统和抗氧化系统的平衡被打破，致使细胞膜变薄和通透性过高，最终引起肝脏损伤[35]。在本研究中乙醇使得Cyp2e1显着上调表达，在赤芝多糖组中表达下调，说明细胞色素P450通路在赤芝多糖预防急性酒精肝损伤中起重要作用。

视黄醇（VA）及其衍生物对细胞生长、细胞分化和凋亡具有深远的影响。乙醇中毒者肝脏VA水平较低，过量乙醇干扰视黄醇代谢[36]。刘中宏等[37]的研究指出视黄醇参与肝星状细胞的代谢，从而抑制胶原的释放，并抑制ALD患者肝脏纤维化的形成。在本研究中发现赤芝多糖能够通过调节视黄醇相关基因的表达来预防急性酒精肝损伤。

此外，本研究还对8 个富集通路上的基因进行qPCR验证，结果表明因乙醇作用而上调或下调表达的基因在多糖组中表达情况发生改变。这一结果基本与转录组分析结果相一致，进一步证明了转录组分析的准确性。综上所述，赤芝多糖能够有效预防急性酒精肝损伤，其机制可能是通过调节谷胱甘肽代谢、细胞色素P450、视黄醇代谢相关基因的表达。