茶树单宁酶的原核表达及酶学性质表征

陈 伟，谷新晰，张莉娟，谈苏慧，田洪涛，卢海强*

（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

单宁酶（EC 3.1.1.20）能够催化单宁底物酯键和缩酚酸键的水解，从而释放没食子酸、鞣花酸及对应醇[1-2]。单宁酶应用到食品领域可以解决由单宁引起的品质问题，使产品品质得到改善。如Lu等[3]发现单宁酶处理可以大大减少绿茶茶汤“茶乳”的形成，并且使茶汤具有更好的颜色外观和口感；Zhang Yingna等[4]通过单宁酶水解绿茶生产具有极佳回甘的茶饮料；单宁酶应用到葡萄汁、腰果梨汁、橙汁、刺梨汁和石榴汁等果汁当中，水解果汁中的单宁，起到澄清、脱苦和脱涩的作用[5-8]；Selwal等[9]将单宁酶应用到葡萄酒中，起到澄清的作用。

面对复杂的应用环境和大量的应用需求，挖掘具有良好酶学性质的新单宁酶向来是研究热点。目前，进行的异源表达和酶学性质表征的单宁酶主要来源于微生物。Dai Xinlong等[10]从植物中发现并鉴定了参与植物单宁降解的单宁酶基因，植物单宁酶在植物单宁代谢中起重要作用，重组植物单宁酶对多个天然底物（如表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯和β-五没食子酰葡萄糖）表现出较高的催化效率，而重组植物单宁酶的相关性质鲜见报道。同时，Dai Xinlong等[10]推测富含单宁的植物基因组中很可能含有单宁酶基因，这一发现为新单宁酶的挖掘和研究提供了新方向，植物中可能存在具有理想性质或适合于各种单宁底物的新单宁酶。

本研究将茶树单宁酶基因CsTanA（GenBank：MK381269.1）参照大肠杆菌（Escherichia coli）密码子偏好性进行优化，并在大肠杆菌BL21（DE3）中重组表达。重组茶树单宁酶rCsTanA利用Ni-NTA亲和层析进行分离纯化及酶学性质表征，旨在探究植物来源单宁酶的酶学特性和为重组茶树单宁酶rCsTanA应用研究提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌BL21（DE3）感受态 天根生化科技（北京）有限公司；硫酸卡那霉素（Kan）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、质粒提取试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；标准分子质量Marker 河北瑞帕特生物科技有限公司；罗丹宁、没食子酸甲酯（methyl gallate，MG）、没食子酸乙酯（ethyl gallate，EG）、没食子酸正丙酯（propyl gallate，PG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、单宁酸（tannic acid，TA） 上海源叶生物科技有限公司；Ni-NTA琼脂糖 上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

微量移液器 德国Eppendorf公司；酶标仪美国Bio-Rad公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）设备 北京君意东方电泳设备有限公司；立式高速低温离心机 日本Hitachi公司；JY88-IIN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶树单宁酶基因CsTanA密码子优化及合成

使用RARE CODON CALTOR（https://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html#opennewwindow）对茶树单宁酶基因（GenBank：MK381269.1）进行稀有密码子分析。以大肠杆菌为表达宿主，采用JAVA Condon Adaption Tool（https://http://www.jcat.de/）对茶树单宁酶基因进行密码子优化，优化的序列中避免EcoRI和NotI酶切位点。5’端与3’端分别引入EcoRI和NotI酶切位点，优化的序列由金斯瑞生物科技有限公司合成并构建重组质粒pET-30a-CsTanAopt。

1.3.2 序列信息分析

使用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列一致性分析。使用CLUSTALW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）进行多序列比对。使用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）进行茶树单宁酶CsTanA的蛋白质同源建模。使用The ConSurf Server（https://consurf.tau.ac.il/）基于CsTanA同源建模结果和多序列比对结果确定进化保守性，结合Pymol进行可视化分析，氨基酸残基以梯度着色。使用ExPASy（http://web.expasy.org/compute_pi/）计算单宁酶的分子质量和等电点。

1.3.3 重组菌的构建与表达

重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，涂布于含Kan的LB平板上，37 ℃过夜培养。随机挑取3个单菌落接种于10 mL Kan终质量浓度为100 μg/mL的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养8 h，再以1%的接种体积分数转接到50 mL Kan终质量浓度为100 μg/mL的LB液体培养基中，振荡培养至OD600nm达到0.6左右，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，30 ℃诱导12 h，取发酵液4 ℃离心收集表达菌体。

1.3.4 重组茶树单宁酶rCsTanA的纯化及SDS-PAGE分析

重组茶树单宁酶rCsTanA N端带有6hHis标签，故通过Ni-NTA亲和层析对rCsTanA进行纯化分离。取1 g湿质量表达菌体加入5 mL pH 7.0磷酸缓冲液（0.2 mol/L）使表达菌体重悬，使用超声波细胞粉碎机（功率150 W，工作5 s、间歇5 s，处理2 min）处理重悬表达菌体。离心收集破碎上清液与提前平衡好的Ni柱相结合，用9 mL pH 7.0磷酸缓冲液（0.2 mol/L）分3次加入洗涤杂蛋白，分别用3 mL含20、40、80、100、200 mmol/L和300 mmol/L咪唑的平衡液梯度洗脱目的蛋白，测定单宁酶活性并进行SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。以牛血清白蛋白作为标准蛋白质，通过Bradford方法测定单宁酶蛋白质浓度。

1.3.5 单宁酶活力的测定

参考Sharma等[11]的方法并稍作调整，取100 μL适当稀释酶液与400 μL没食子酸丙酯溶液（1.25 mmol/L，pH 6.0）混匀，于30 ℃条件反应，10 min后加入300 μL罗丹宁甲醇溶液（50 mmol/L）终止反应，加入200 μL 0.5 mol/L KOH溶液显色，稳定5 min后在520 nm波长处测定吸光度。以每分钟生成1 μmol没食子酸所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.3.6 重组茶树单宁酶rCsTanA的酶学特性分析

最适温度和pH值的测定：以pH 6的PG为底物，在0、10、20、30、40、50、60、70 ℃和80 ℃条件下测定纯化rCsTanA的最适温度；在不同pH值（pH 2～3的100 mmol/L甘氨酸-HCl缓冲液、pH 3～8的100 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和pH 8～12的100 mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液）和测得的最适温度条件下测定纯化rCsTanA的最适pH值。

热稳定性和pH值稳定性的测定：rCsTanA在40 ℃和50 ℃保温0、5、10、20、30 min和60 min，在最适温度和pH值条件下测定残余酶活力，以处理0 min的酶活力为100%；将rCsTanA置于不同pH值（2.0～12.0）缓冲液中，0 ℃保温1 h后，在最适温度和pH值条件下测定残余酶活力，以未经处理rCsTanA活力为100%。

1.3.7 金属离子及化学试剂对重组茶树单宁酶rCsTanA的影响

在标准反应体系中加入不同金属离子、表面活性剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）和十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），使其终浓度分别为1 mmol/L和5 mmol/L，测定酶活力；加入表面活性剂吐温80及甲醇、乙醇和异丙醇等有机试剂，使其体积分数分别为1%和5%，测定酶活力。以未添加其他化学试剂所测得的酶活力为100%。

1.3.8 重组茶树单宁酶rCsTanA的底物特异性及动力学常数的测定

以浓度为1.25 mmol/L的MG、EG、PG、EGCG和浓度为0.4 mmol/L的TA测定纯化重组单宁酶rCsTanA活力。以MG、EG、PG、TA和EGCG（浓度范围为0.05～10.00 mmol/L）为底物，在最适条件下反应10 min以估算动力学参数，即Km和Vmax的值，动力学参数的计算基于Lineweaver-Burk图。

1.4 数据分析与统计

所有实验重复测定3次，利用Excel 2016和GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计分析，数据结果采用fs表示。

2 结果与分析

2.1 茶树单宁酶基因CsTanA的优化

编码茶树单宁酶的野生型基因全长900 bp，编码299个氨基酸和1个终止密码子。经分析野生型茶树单宁酶基因存在37个大肠杆菌稀有密码子和两处连续稀有密码子（CUA CCC和GGA CCC）。参照大肠杆菌的密码子偏好性优化密码子后，稀有密码子全部被替换，优化前后基因序列的一致性为77.8%，GC含量由此前的53.2%减小至51.9%，密码子适应指数由0.58提高至0.8，更接近于理想值1.0[12]。

2.2 生物信息学分析

利用SWIS-SMODEL对茶树单宁酶CsTanA进行同源建模研究，选择与CsTanA同源性为37.54%的晶体结构（PDB:6rj8）为模板以模拟CsTanA蛋白的结构。选择了分别源自柿子（QEE79633.1）、葡萄（QEE796030.1）、柑橘（XP_02403513.1）、核桃（QEE79629.1）和草莓（QEE79629.1）的5个植物单宁酶，同茶树单宁酶CsTanA进行多序列比对。使用The ConSurf Server（https://consurf.tau.ac.il/）基于模拟的CsTanA蛋白的结构和多序列比对结果确定进化保守性，结合Pymol进行可视化分析，结果如图1所示。CsTanA属于α/β水解酶超家族，整体结构由2个结构域组成，球形α/β水解酶折叠域和一个Lid结构域。与微生物来源的单宁酶相比，茶树单宁酶CsTanA没有复杂的帽子结构域，同时α/β水解酶折叠结构域也相对简单，除了必需的5个α螺旋和8个β折叠，没有过多的α螺旋和β折叠插入α/β水解酶折叠结构域[13-14]。茶树单宁酶CsTanA的α/β水解酶折叠核心域由5个α螺旋围绕8个β折叠，形成了α/β水解酶折叠域，Lid结构域由2个平行的β折叠和1个反平行的β折叠组成。CsTanA具有不规则的疏水底物口袋，保守的催化三联体残基为Ser159、Asp241和His273，Asp241和His273位于疏水底物口袋入口表面处排成一排，Ser159位于底物口袋底部；保守基序HGG（75～77）位于底物口袋内部，Gly76-Gly77形成一个氧阴离子空穴结构。研究表明该结构与酶活性有关，相同的结构也出现在了猕猴桃羧酸酯酶AeCXE1当中，活性口袋中的Gly92-Gly93形成氧阴离子空穴并且起到稳定中间体的作用[10,15]。如图1所示，通过计算进化保守性，基于该结构的多序列比对显示了氨基酸残基保守和多变的位置，确定了底物口袋结构中的残基是高度保守的，这些进化上稳定的残基在催化、配体结合和保持蛋白质支架的完整性中起重要作用，结构表面的大多数氨基酸被标记为高度可变。通过对植物来源单宁酶蛋白序列及结构的分析，为进一步分子改造研究提供理论基础。

图1 单宁酶CsTanA三维结构及进化保守性图Fig.1 Schematic diagram of the tertiary structure and evolutionary conservatism of CsTanA

2.3 重组茶树单宁酶rCsTanA的纯化及SDS-PAGE分析

茶树单宁酶CsTanA的等电点和理论分子质量分别为5.61和33.09 kDa。重组茶树单宁酶rCsTanA N端带有6hHis标签，使其可以通过Ni-NTA亲和层析进行分离纯化。对不同浓度咪唑的洗脱液（20、40、80、100、200 mmol/L和300 mmol/L）的洗脱结果进行单宁酶活性的测定，40 mmol/L咪唑的洗脱结果单宁酶活性最高，而80 mmol/L咪唑的洗脱结果无单宁酶活性。破碎上清液重组茶树单宁酶rCsTanA比活力为0.35 U/mg，纯化后的rCsTanA比活力为1.53 U/mg，纯化倍数约为4.4。如图2所示，rCsTanA的分子质量约为39 kDa，rCsTanA的N端融合表达了6hHis标签，使单宁酶蛋白N端多出52个氨基酸残基（约5.23 kDa），故实际分子质量大于理论分子质量（33.09 kDa）。

图2 纯化重组酶rCsTanA的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified recombinant rCsTanA

2.4 重组茶树单宁酶rCsTanA的酶学特性分析

2.4.1 温度对重组茶树单宁酶rCsTanA的影响

如图3A所示，rCsTanA在0～70 ℃的温度范围内均有活性，其最适反应温度为40 ℃，在30～40 ℃之间可保持64%以上的酶活力，温度高于40 ℃酶活力急剧下降，50 ℃时酶活力仅为33.9%。如图3B所示，rCsTanA在30 ℃条件下处理60 min后，仍保持66.0%的酶活力；在40 ℃条件下处理10 min后，酶活力保持在52.2%。

图3 重组酶rCsTanA的最适温度（A）、温度稳定性（B）、最适pH值（C）及pH值稳定性（D）Fig.3 Optimum temperature (A), temperature stability (B), optimum pH (C) and pH stability (D) of recombinant rCsTanA

2.4.2 pH值对重组茶树单宁酶rCsTanA的影响

在40 ℃的反应温度下，测定了rCsTanA在pH 2.0～12.0的酶活性，结果如图3C所示。rCsTanA的最适pH值为7.0，在pH 6.0～9.0内酶活力可维持在60.0%以上。将rCsTanA酶液置于不同pH值条件下，0 ℃保温1 h后，测定rCsTanA残余酶活力，由图3D可知，该酶在pH 6.0～10.0之间具有较好的稳定性，残余酶活力均保持在80%以上。

2.4.3 金属离子及化学试剂对重组茶树单宁酶rCsTanA的影响

金属离子对重组酶rCsTanA活力的影响结果见表1。经测定Na+、K+、Li+、Mg2+（仅1 mmol/L）、Mn2+和Ca2+均对rCsTanA活力有明显促进作用，其中K+可使其酶活力提高约37%。而Ag+、Zn2+、Cu2+、Fe3+及Al3+对rCsTanA活力具有不同程度的抑制作用，Ag+、Cu2+和Fe3+抑制作用较强，使rCsTanA活力均小于20%，其中5 mmol/L Cu2+可使rCsTanA失活。黄蕾等[16]报道了Cu2+和Fe3+对重组烟曲霉单宁酶AfTanA具有较强的抑制作用，5 mmol/L Cu2+和Fe3+可使重组酶失活。Kanpiengjai等[17]报道了Cu2+对重组戊糖乳杆菌单宁酶LpTanBA-7和LpTanQA1-5均有较强抑制作用，1 mmol/L Cu2+抑制了2个重组酶约70%的活力，Na+、K+、Ca2+、Mg2+及Al3+则为LpTanBA-7和LpTanQA1-5的激活剂。Ag+、Cu2+和Fe3+等重金属离子对大多数单宁酶有抑制作用，因为这些重金离子可能与酶活性部位的巯基、色氨酸残基或羧基结合在一起形成复合物，阻碍酶与底物结合而生成产物[18-19]。

表1 金属离子对重组酶rCsTanA的影响Table 1 Effects of metal ions on the activity of recombinant rCsTanA

如表2所示，所测11种试剂对rCsTanA均有不同程度的抑制作用，且抑制作用随添加量增大而增大。在螯合剂EDTA存在下，以金属离子为辅基的酶会表现出酶活性急剧下降。在1 mmol/L和5 mmol/L的EDTA存在下，重组酶rCsTanA活力分别为（94.52f5.68）%和（83.27f8.58）%，并未表现出酶活性急剧下降，这表明该酶不使用金属离子作为辅因子。表面活性剂SDS、吐温80和CTAB有较强抑制作用，1 mmol/L的SDS几乎完全抑制了rCsTanA活力，5 mmol/L的吐温80使rCsTanA活力丧失80%以上，5 mmol/L CTAB可使rCsTanA失活。甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮（极性溶剂）会抑制酶活性，可能是因为极性化合物会降低酶微环境中周围的水含量[20]。

表2 化学试剂对重组酶rCsTanA的影响Table 2 Effects of chemical reagents on the activity of recombinant rCsTanA

2.4.4 重组茶树单宁酶rCsTanA的底物特异性及动力学参数

在最适反应条件下，测定纯化重组茶树单宁酶rCsTanA的底物特异性及动力学参数，结果如表3所示。纯化重组酶rCsTanA对MG、EG、PG和EGCG酶活力分别为0.40、0.71、0.80 U/mL和0.53 U/mL，但对TA并未表现出水解酶活性。进一步进行酶动力学分析，由底物MG、EG、PG和EGCG测得的Km分别为（2.25f0.12）、（1.30f0.04）、（1.66f0.11）mmol/L和（1.91f 0.06）mmol/L，Vmax分别为（4.10f0.19）、（9.17f0.24）、（10.54f0.09）mmol/（Lgmin）和（3.59f0.15）mmol/（Lgmin）。rCsTanA对天然底物（EGCG）的催化效率略低于合成底物（EG和PG）。rCsTanA对合成底物（MG、EG和PG）酶活性随着合成底物烷基长度增加而提高。

表3 重组酶rCsTanA的底物特异性及动力学参数Table 3 Substrate specificity and kinetic parameters of recombinant rCsTanA

3 讨 论

本研究以大肠杆菌BL21（DE3）为表达宿主对茶树单宁酶CsTanA进行重组表达，SDS-PAGE分析显示纯化的重组酶分子质量约为39 kDa，rCsTanA的N端融合表达了6hHis标签，使单宁酶蛋白N端多了52个氨基酸残基（约5.23 kDa），故实际分子质量大于理论分子质量（33.09 kDa）。茶树单宁酶CsTanA的分子质量更接近于细菌来源的单宁酶，细菌单宁酶分子质量一般为31～90 kDa[1-2]。本研究将茶树单宁酶CsTanA成功进行原核表达后，又尝试将其在巴斯德毕赤酵母GS115中进行真核表达。真核表达的重组茶树单宁酶未检测出单宁酶活性，其分子质量约为50 kDa（数据未在文中给出），可能是巴斯德毕赤酵母对茶树单宁酶CsTanA过度的糖基化修饰造成了重组酶失活。

重组茶树单宁酶rCsTanA的最适温度为40 ℃，在30～40 ℃之间可保持64%以上的酶活力，温度高于40 ℃酶活力急剧下降。目前研究的单宁酶最适温度的范围一般为30～50 ℃，如黑曲霉单宁酶Tan7的最适温度为40 ℃，当温度高于40 ℃酶活力活性急剧下降[21]；烟曲霉单宁酶AfTanA、戊糖乳杆菌单宁酶LpTanQA1-5和路邓葡萄球菌单宁酶的最适温度为40 ℃，但在30～50 ℃的温度范围内可保持60%以上的酶活力[16-17,22]。重组茶树单宁酶rCsTanA具有较高的反应温度，但较微生物来源的单宁酶相比，对温度的适应范围和稳定性稍显逊色。

重组茶树单宁酶rCsTanA的最适pH值为7.0，在pH 6.0～9.0反应条件下酶活力保持在60.0%以上，在pH 6.0～10.0范围内稳定，处理1 h后残余酶活力均在80%以上。多数细菌来源的单宁酶在中性或弱碱性环境中有较高酶活力，最适pH值多在7.0～8.0的范围内[2]。在最适pH值这一酶学性质上，rCsTanA与细菌来源的单宁酶相似，在碱性条件下更为稳定。路邓葡萄球菌单宁酶同rCsTanA一样在酸性环境中酶活力较低，但经固定化后的路邓葡萄球菌单宁酶在pH 5.0时酶活力为65%，酶活力提高了35%[22]。这为提高rCsTanA在酸性环境中的酶活力提供了方法。

Na+、K+、Li+、Mg2+（仅1 mmol/L）、Mn2+和Ca2+均可使重组茶树单宁酶rCsTanA活力提高20%以上，其中K+可使酶活力提高约37%。Ag+、Cu2+和Fe3+对重组茶树单宁酶rCsTanA抑制作用较强，使rCsTanA活力均小于20%，其中5 mmol/L Cu2+可使rCsTanA失活。研究表明多数重金属（如Hg2+、Ba2+、Pb2+、Cd2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Ag+）对单宁酶有较强的抑制作用，这些离子可能与酶活性部位的巯基、色氨酸残基和或羧基结合在一起形成复合物，阻碍酶与底物结合而生成产物[16-19,23-27]。表面活性剂SDS、吐温80和CTAB对重组茶树单宁酶rCsTanA有较强抑制作用，可使rCsTanA失活。表面活性剂与单宁酶蛋白的直接作用和减少疏水作用，使得单宁酶的性质产生变化，SDS、Triton X-100、吐温20和吐温80对黑曲霉单宁酶rAntan1、源自阴沟肠杆菌的单宁酶和肺炎克雷伯菌的单宁酶同样有较强抑制作用[18,23-24,28]。而SDS对源自枯草芽孢杆菌PAB2的单宁酶和路邓葡萄球菌的单宁酶的酶活力具有促进作用[22,29]；EDTA、Triton X-100和吐温80可使单宁酶TanBFnp的酶活力分别提高106%、142%和69%[30]。甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮（极性溶剂）会抑制重组茶树单宁酶rCsTanA活力，可能是因为极性化合物会降低酶微环境中周围的水含量[17]。但也有少数单宁酶对有机溶剂表现出较强耐受能力，如源自枯草芽孢杆菌PAB2的单宁酶和戊糖乳杆菌的单宁酶可乙醇、甲醇、异丙醇、甘油和异戊醇等有机溶剂激活[17,29]。

重组茶树单宁酶rCsTanA对天然底物TA未表现出水解活性，但微生物来源的单宁酶一般均对TA具有较高的水解活性。rCsTanA对天然底物EGCG的催化效率略低于合成底物EG和PG。相比于大分子底物，小分子底物似乎更易于与重组茶树单宁酶rCsTanA的活性位点结合。TA分子质量为1 701.2 Da，是EGCG分子质量的3.7 倍，过多的没食子酸酰基占据了较大的空间位置，阻碍了TA与重组茶树单宁酶rCsTanA的活性位点结合，使TA无法被rCsTanA水解，但具体分子机制有待进一步研究。

4 结 论

对茶树单宁酶基因进行密码子优化并在大肠杆菌进行融合表达，经分析重组茶树单宁酶rCsTanA蛋白分子质量为39 kDa，比活力为1.53 U/mg，rCsTanA最适反应温度为40 ℃，最适pH值为7.0，在碱性条件下更为稳定。Na+、K+、Li+、Mg2+、Mn2+和Ca2+均对rCsTanA活力有明显促进作用，而Ag+、Cu2+和Fe3+对该酶有明显抑制作用；EDTA、SDS、吐温80、CTAB、尿素、甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮均对rCsTanA活力有抑制作用，其中SDS和CTAB的抑制作用最强。综上所述，重组茶树单宁酶rCsTanA在食品工业中具有较好的应用潜力。