张雪莉，胡秋辉,,*，纪 阳，俞安淇，仲 磊，赵立艳，范育明
（1.南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023；3.灌南县园艺技术指导站，江苏 连云港 222500）
硒是维持机体健康必需的微量元素，摄入适量的硒有利于保护免疫系统、心血管系统、甲状腺功能、生育功能及抗氧化功能等。机体自身无法合成硒元素，只能从外界摄入，但人类日常饮食中硒含量较低，难以满足普通人群尤其是缺硒地区人群的补硒需求。目前大多通过叶面喷硒、根部灌硒等方式使农作物富集硒以提高食物中的硒含量及生物可利用性。作物中的大部分硒以硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代胱氨酸（SeCys）及硒代同型半胱氨酸等形态与蛋白质结合，使得富硒蛋白成为硒在作物中的主要存在形式。研究发现，硒与蛋白结合不仅提高了蛋白质中的硒含量，还会影响蛋白质的营养、结构和功能活性，如与花生普通蛋白相比，花生富硒蛋白的氨基酸含量增加，二级结构显着变化；与秀珍菇普通蛋白相比，秀珍菇富硒蛋白的表面疏水性增加，-折叠含量降低而无规卷曲含量增加；与糙米普通蛋白相比，富硒蛋白-折叠和无规卷曲结构含量增加，-螺旋和-转角结构含量降低，体外抗氧化性显着增强。
铅作为一种有害重金属元素，通过食物及饮用水、空气及皮肤接触等途径在人体内富集，主要分布在大脑、肾脏、肝脏及骨骼等器官中。膳食铅暴露可能会破坏中枢神经系统、骨骼造血系统，引起贫血、高血压、肾脏损伤等疾病。传统的治疗铅中毒的方法为螯合治疗法，但螯合剂的使用存在一定副作用，例如长期服用依地酸二钠钙会导致疲劳、恶心、加重肾负担且会引起人体铁、锌等微量元素的流失。已有研究表明，硒不仅能够影响铅的吸收，还能对铅诱导的机体炎症损伤和免疫系统紊乱产生显着拮抗作用。Wu Jian等研究表明大米富硒蛋白水解物可抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路以减轻Pb诱导的RAW264.7细胞炎症反应。Fang Yong等研究发现富硒大米蛋白水解物可能通过抑制Caspase蛋白家族的激活减轻Pb对PC12细胞和RAW264.7细胞的毒性。以上研究均表明食源性硒蛋白具有潜在的缓解Pb细胞毒性的作用。
杏鲍菇是我国工厂化大规模种植的一种食用菌，富含蛋白质、多糖等营养成分，其栽培不受土壤因素限制，培养周期短，并且杏鲍菇对微量元素有较好的吸收能力，因此相较于大米、小麦等谷物，杏鲍菇是一种理想的硒生物强化载体。目前对杏鲍菇富硒蛋白（selenium-enriched proteinfrom，SePEP）的营养、结构特性及其铅毒性缓解作用鲜有报道。本实验以SePEP为原料，分析蛋白中硒含量、形态和氨基酸，并测定蛋白的结构以评估硒积累对杏鲍菇蛋白营养和结构特性的影响。此外，通过体外模拟消化SePEP和细胞实验探究SePEP对Pb诱导的RAW264.7细胞损伤和炎症反应的影响，旨在为SePEP缓解铅毒性作用机理研究及SePEP功能食品开发提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
富硒杏鲍菇和普通杏鲍菇均种植于江苏丽莎菌业股份有限公司，富硒杏鲍菇栽培过程中以富硒酵母作为硒源（培养基中硒含量：40 mg/kg）。将富硒杏鲍菇冷冻干燥后磨粉过80 目筛备用；小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）购于复旦IBS细胞资源中心。
SeMet、SeCys、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸钠、硒酸钠、胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶XIV美国Sigma公司；胎牛血清、DMEM高糖培养基、双抗、胰酶 美国Gibco公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenas，LDH）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）酶联免疫吸附检测（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 南京建成生物工程生物研究所；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑蓝（thiazolyl blue，MTT） 北京索莱宝科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；7700x电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）仪、1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国安捷伦科技有限公司；Mars6微波消解仪 美国CEM公司；IR200傅里叶变换红外光谱仪、Varioskan Flash酶标仪 美国赛默飞公司。
1.3 方法
1.3.1 SePEP和普通杏鲍菇蛋白的制备
参照席甜和袁彪的方法提取纯化SePEP。称取0.04 g碱提酸沉所得粗蛋白溶于20 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中，蛋白质量浓度为2 mg/mL，过0.45 μm滤膜。将滤液上样于DEAE Sepharose Fast Flow凝胶层析柱。用0.1～0.7 mol/L NaCl缓冲液洗脱，收集各组分并测定硒含量。以硒含量最高的组分记为SePEP。普通杏鲍菇蛋白（protein from，PEP）的提取方法同上。
1.3.2 硒含量的测定
硒含量的测定参考GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》，并作适当修改。精确称取0.2 g待测样品于消解管中，添加5 mL HNO（纯度65%～68%）预消解12 h，再加入1 mL HO微波消解，冷却后定容至50 mL，通过ICP-MS分析硒含量。ICP-MS射频功率：1 550 W；等离子体气流量：15.0 L/min；载气流量：1.0 L/min；辅助气流量：1.0 L/min；蠕动泵转速：0.1 r/min；雾化室温度：2 ℃；雾化室气流量：0.1 L/min。
1.3.3 硒形态的测定
根据薛梅等的方法通过HPLC-ICP-MS联用技术测定硒形态。称取0.25 g蛋白质于离心管中，加入10 mL质量浓度8 mg/mL蛋白酶XIV溶液。将离心管置于37 ℃及150 r/min条件下振荡12 h，于5 000 r/min下离心10 min，取上清过0.22 μm滤膜上机分析。硒形态和含量分别根据各硒标准物鉴定和标准曲线计算。HPLC的工作参数如下：Hamilton PRP-X100色谱柱（250 mm×4.1 mm，10 μm）；流动相A相为5 mmol/L pH 4.7柠檬酸溶液，流动相B相为15 mmol/L pH 4.7柠檬酸溶液；流速1.0 mL/min；进样量50 μL。洗脱条件：0～6 min，100% A；6～10 min，50% A；10～23 min，0% A；23 min，100% A。
将亚硒酸钠、硒酸钠、SeMet、SeCys、MeSeCys 5 种硒形态标准品混合，配制成质量浓度梯度为0、1、5、10、20、50、100 µg/L的混合标准工作液，按上述方法得到HPLC图（图1）。四价硒（Se）、六价硒（Se）、SeMet、SeCys、MeSeCys的回归方程分别为＝445.35-147.17，＝0.996 2；＝624.75-418.45，＝0.999 2；＝477.02-12.776，＝0.999 5；＝1 148.6-625.35，＝0.999 9；＝434.12-87.076，＝0.999 2。
图1 质量浓度100 μg/L硒形态混合标准溶液HPLC色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of 100 μg/L mixed selenium standard
1.3.4 SePEP氨基酸的测定
参考张梦甜等的方法作适当修改测定蛋白质中的氨基酸。称取0.02 g蛋白质于水解管中，添加20 mL 6 mol/L盐酸溶液，密封，于110 ℃烘箱中加热水解22 h，冷却后氮吹样品以去除浓盐酸。复溶于0.02 mol/L盐酸溶液并定容至50 mL，过0.22 μm滤膜，经全自动氨基酸分析仪测定。
1.3.5 SePEP二级结构相对含量的测定
蛋白的二级结构相对含量通过傅里叶变换红外光谱仪测定。将富硒杏鲍菇蛋白与溴化钾以质量比1∶100研磨并压片，进行红外光谱分析。分析参数中波数范围设为4 000～500 cm，分辨率设为4 cm，扫描60 次。二级结构通过Peak Fit软件对扫描图谱中1 700～1 600 cm酰胺I带进行分析。其中1 600～1 640 cm为-折叠，1 641～1 650 cm为无规卷曲，1 651～1 660 cm为-螺旋，1 661～1 690 cm为-转角。
1.3.6 SePEP巯基与二硫键含量的测定
参照罗明江等的方法，通过Ellman’s试剂测定蛋白巯基与二硫键的含量。总巯基和游离巯基含量计算如式（1）所示，二硫键含量计算如式（2）所示。
式中：为溶液在412 nm波长处吸光度；为稀释倍数；为样品质量浓度/（mg/mL）。
1.3.7 SePEP表面疏水性的测定
参考Chelh等的方法，称取适量蛋白溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）（pH 7.0）中，使蛋白质量浓度为5 mg/mL。取1 mL蛋白溶液并添加200 μL质量浓度1 mg/mL溴酚蓝溶液，以添加200 μL含溴酚蓝的PBS为对照。静置30 min，于6 000 ×离心15 min，于595 nm波长下测定吸光度。溴酚蓝结合量计算如式（3）所示。以溴酚蓝结合量表征蛋白的表面疏水性。
式中：为含溴酚蓝的PBS吸光度；为样品上清液的吸光度；为添加的溴酚蓝质量（200 µg）。
1.3.8 体外模拟消化SePEP
参考Brodkorb等的方法并作适当修改对蛋白进行体外模拟消化。称取2.0 g蛋白样品加入10 mL蒸馏水，再加入10 mL模拟唾液，摇匀，用0.1 mol/L HCl溶液调pH值至1.8。以1∶1（/）比例加入模拟胃液（2 000 U/mL胃蛋白酶消化液），于37 ℃恒温摇床振荡4 h，调pH值至6.8。以1∶1（/）比例加入模拟肠液（100 U/mL胰蛋白酶最终混合物），继续于37 ℃恒温摇床振荡4 h。消化完全后取出样品，并于沸水中煮沸5～10 min灭酶。
1.3.9 SePEP消化产物对Pb损伤RAW264.7细胞存活率的影响
参考Wu Jian等的方法培养RAW264.7巨噬细胞。采用MTT法测定RAW264.7细胞暴露于不同浓度Pb溶液12 h后细胞存活率的变化，以筛选Pb作用浓度。将对数生长期的细胞接种于96 孔板中，每孔细胞数量为2×10个。细胞铺满底部80%后，弃去培养液，用0.01 mol/L PBS清洗3 次。向细胞中加入100 μL不同浓度Pb溶液（0、25、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L）孵育12 h，吸弃处理液。加入20 μL质量浓度5 mg/mL MTT溶液于培养箱孵育4 h。吸弃MTT溶液，再向每孔加入100 μL DMSO，37 ℃下振荡10 min，于波长570 nm下测定吸光度，细胞存活率以对照组（0 μmol/L Pb溶液）为100%计算，空白组加入0.01 mol/L PBS。细胞存活率计算公式如式（4）所示。
测定不同质量浓度（0、1、5、10、25、50、75、100 μg/mL）蛋白消化产物及Pb与蛋白消化产物共处理12 h对RAW264.7细胞活力的影响，方法如上所述。待96 孔板底部铺满细胞后，加入蛋白消化产物和Pb混合溶液，12 h后测定细胞存活率。
1.3.10 LDH释放量及细胞因子质量浓度的测定
根据检测试剂盒说明书测定细胞培养液中LDH活力及IL-6、IL-8、TNF-α的质量浓度。
1.4 数据处理与分析
研究中所有实验至少进行3 次，结果以平均值±标准差表示。所有统计分析均采用SPSS 25.0软件进行，使用单因素方差分析（ANOVA）检验两组之间的差异显着性（＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 SePEP的硒含量及硒形态分析
经ICP-MS测定，富硒杏鲍菇中硒含量为（90.01±7.01）mg/kg，SePEP中硒含量为（360.64±3.11）mg/kg，PEP中未检测到硒。经蛋白酶XIV酶解提取后，提取液中硒质量浓度为（282.82±13.13）mg/L，经酶解后，蛋白质中78.42%的硒被提取至提取液中。通过HPLC-ICP-MS测定SePEP的硒形态，由图2A可知，SePEP中主要包括SeCys、MeSeCys和SeMet。通过对3 种硒化合物含量及其中硒含量计算可得，SePEP中SeCys、MeSeCys、SeMet含量分别为（413.28±6.66）、（103.39±2.54）mg/kg和（356.87±4.75）mg/kg，3 种硒化合物中的硒含量分别为（90.24±1.46）、（41.42±1.02）mg/kg和（135.87±1.81）mg/kg（图2B）。由以上数据计算可知，各形态硒在SePEP中的相对含量为SeCys（31.91±0.51）%、MeSeCys（14.65±0.36）%和SeMet（48.04±0.64）%（图2C）。富硒蛋白中的硒形态大部分为有机硒，如大豆富硒蛋白主要硒形态为SeMet；茶叶富硒蛋白和魔芋富硒蛋白主要硒形态为SeMet和SeCys。其中，SeMet与SeCys的形成是由于蛋氨酸合成酶及半胱氨酸合成酶无法识别Se和S原子，Se非特异性取代了蛋白质中的S原子。SeCys是SeCys不稳定转化形成的代谢物。MeSeCys是由SeCys与-腺苷蛋氨酸反应并通过硒甲基转移酶转化而成。根据Battin等的研究，SeMet、SeCys及MeSeCys可以与铜和铁元素结合缓解铜、铁浓度异常升高引起的大肠杆菌质粒DNA氧化损伤。
图2 SePEP中硒形态的HPLC色谱图（A）、各形态硒含量（B）及含量比例（C）Fig. 2 HPLC chromatogram of selenium species (A) and content (B)and proportion (C) of each selenium species in SePEP
2.2 SePEP氨基酸的种类与含量
氨基酸种类与含量是评价蛋白质营养价值的重要指标。SePEP及PEP的氨基酸组成与含量见表1，两种蛋白中均检测到17 种氨基酸，且SePEP中大部分氨基酸含量显着高于PEP（＜0.05）。根据联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提出的理想模式，必需氨基酸（essential amino acids，EAA）/总氨基酸（total amino acids，TAA）比值为0.4左右，EAA/非必需氨基酸（non-essential amino acids，NEAA）比值大于0.6，则该种蛋白质品质较好。因此，SePEP与PEP均具有合理的氨基酸组成。研究发现，适量的硒积累可提高植物蛋白质中氨基酸含量，提高蛋白营养价值，这是因为氨基酸是作物氮代谢的产物，作物富集硒的过程中影响了硫代谢，同时影响了与硫代谢在乙酰丝氨酸水平上相互作用的氮代谢。
表1 SePEP与PEP的氨基酸组成与含量Table 1 Amino acid composition of SePEP and PEP
2.3 SePEP的结构表征
蛋白质的二级结构包括-螺旋、-折叠、-转角及无规卷曲4 种类型。由图3可知，SePEP二级结构由（25.00±1.60）%（相对含量，下同）-螺旋、（37.48±1.37）%-折叠、（23.67±1.41）%-转角和（13.85±1.66）%无规卷曲组成；PEP二级结构则由（20.30±0.87）%-螺旋、（35.88±0.73）%-折叠、（24.92±0.92）%-转角及（20.38±0.84）%无规卷曲组成。相较于PEP，SePEP中-螺旋结构相对含量显着增多（＜0.05），无规卷曲结构相对含量显着减少（＜0.05）。研究发现，硒的添加会导致糙米蛋白中-折叠与无规卷曲结构相对含量增多，-转角与-螺旋结构相对含量减少；随外源硒浓度增加，秀珍菇富硒蛋白的-螺旋与无规卷曲结构相对含量先增多后减少。
图3 SePEP与PEP的红外光谱图（A）与二级结构组成（B）Fig. 3 Infrared spectra (A) and secondary structure composition (B) of SePEP and PEP
巯基与二硫键含量可以反映蛋白质分子间结合的强弱，在维系蛋白质二级结构上起重要作用。根据表2可知，SePEP总巯基及二硫键含量显着高于PEP（＜0.05），游离巯基含量无显着差异（＞0.05）。硒的生物强化导致PEP总巯基与二硫键含量增加，与花生富硒蛋白测定结果一致。蛋白质分子的表面疏水性反映了三级结构的展开程度、表面疏水基团数量及分子间相互作用的强弱。以溴酚蓝结合量表征蛋白的表面疏水性，溴酚蓝结合量越高则说明表面疏水性越高。SePEP与PEP的溴酚蓝结合量分别为（80.59±4.06）μg和（20.33±3.55）μg，SePEP表面疏水性较PEP显着增加（＜0.05）。这是由于硒与蛋白质结合改变了蛋白质内部环境，导致埋藏在蛋白分子内部的疏水基团暴露，引起表面疏水性增加。综上所述，外源硒的添加显着改变了PEP的结构，但硒对蛋白结构特性影响的具体机制还需深入研究。
表2 SePEP与PEP的巯基、二硫键含量及溴酚蓝结合量Table 2 Sulfhydryl and disulfide bond contents and bromophenol blue-binding capacity of SePEP and PEP
2.4 Pb2+及SePEP消化产物对RAW264.7巨噬细胞作用浓度的筛选分析
不同浓度Pb溶液对RAW264.7细胞活力影响（作用时间12 h）如图4A所示，当Pb浓度在0～100 μmol/L范围内时，与对照组（0 μmol/L Pb溶液）相比，细胞存活率未显着变化（＜0.05），说明在此浓度范围内Pb溶液对RAW264.7细胞无显着毒性。随Pb浓度继续升高，细胞存活率逐渐降低，呈剂量依赖性。当Pb浓度为800 μmol/L时，细胞存活率仅为（53.48±6.49）%，与对照组相比显着下降了46.52%（＜0.05），表明该浓度下的Pb具有较强的细胞毒性。
图4 不同浓度Pb2＋（A）及蛋白消化产物（B）对RAW264.7细胞活力的影响Fig. 4 Effects of Pb2+ concentration (A) and protein digestion products (B) on the viability of RAW264.7 cells
将不同质量浓度SePEP及PEP消化产物溶液作用于RAW264.7细胞12 h，细胞存活率结果见图4B。PEP消化产物质量浓度为0～100 μg/mL时细胞存活率无显着差异（＜0.05），说明该浓度范围内PEP消化产物对RAW264.7细胞未产生毒性。质量浓度0～75 μg/mL范围内的SePEP消化产物对RAW264.7细胞未表现出毒性作用。当SePEP消化产物质量浓度为100 μg/mL时，细胞活力降低至（86.37±6.79）%，与对照组（0 μg/mL蛋白消化产物）相比有显着差异（＜0.05），这是因为硒的营养必需剂量与毒性剂量之间的范围非常窄，摄入适量的硒于机体有益，硒摄入过量则会造成硒中毒，引起呼吸困难、腹痛、腹泻，甚至死亡，100 μg/mL的SePEP消化产物作用时可能对细胞产生了低毒性作用。因此，后续实验选择5、25、75 μg/mL作为蛋白消化产物作用质量浓度。
2.5 SePEP消化产物对Pb2+细胞毒性的影响
当Pb浓度为800 μmol/L，不添加蛋白消化产物时，RAW264.7细胞存活率接近50%，可作为衡量Pb溶液对细胞毒性的指标。以质量浓度为5、25、75 μg/mL的SePEP或PEP消化产物与800 μmol/L Pb溶液共处理细胞12 h，细胞存活率变化如图5A所示。与Pb处理组相比，不同质量浓度的PEP消化产物对Pb细胞毒性无显着影响（＜0.05），表明PEP消化产物对Pb诱导的细胞毒性无缓解作用。SePEP消化产物与Pb共处理组中，细胞存活率与消化产物质量浓度呈正相关，呈剂量依赖性。在SePEP消化产物质量浓度为75 μg/mL时，细胞存活率为（76.95±6.95）%，与Pb处理组相比细胞存活率显着提高（＜0.05）。Zhu Yiqing等以2.0 mmol/L Pb溶液作用于Caco-2细胞，细胞活力降至对照组的51.30%，添加水稻富硒蛋白水解物后，细胞存活率升高了约19.43%（＜0.05），说明富硒蛋白水解物对Pb细胞毒性有改善作用，与本实验结果一致。
图5 不同质量浓度蛋白消化产物对800 μmol/L Pb2＋损伤RAW264.7细胞活力（A）及LDH释放量（B）的影响Fig. 5 Effects of different concentrations of protein digestion products on the viability (A) and LDH release (B) of 800 μmol/L Pb2+-injured RAW264.7 cells
LDH是一种存在于细胞内的酶类物质，当细胞受到刺激死亡或结构被破坏时，细胞内的LDH就会释放出来，培养液中LDH释放量可反映细胞存活率。Pb处理组细胞培养液中LDH释放量为（1 364.79±81.43）U/L。添加不同质量浓度SePEP消化产物后，LDH释放量随SePEP消化产物质量浓度增加而减少，当SePEP消化产物质量浓度为75 μg/mL时，LDH释放量最低，为（580.73±48.11）U/L，与Pb处理组相比，细胞内LDH释放量显着降低了57.45%（＜0.05），PEP消化产物的添加对细胞LDH释放水平无显着影响（＞0.05）。结果表明，与PEP消化产物相比，SePEP消化产物对Pb细胞毒性具有显着缓解作用（＜0.05）。
2.6 SePEP消化产物对Pb2+诱导RAW264.7细胞因子分泌水平的影响
由图6A可知，5、25、75 μg/mL SePEP或PEP消化产物与100 μmol/L Pb溶液共处理对RAW264.7细胞存活率均无显着影响（＜0.05）。因此，上述条件下细胞存活率一致，细胞因子分泌水平仅受细胞炎症反应状态影响，故所选Pb浓度可用于无细胞毒性条件下细胞因子分泌水平差异的分析。与0 μmol/L Pb溶液处理组相比，Pb处理使细胞培养液中3 种促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α质量浓度显着升高（＜0.05），分别为（79.79±10.80）、（108.58±6.54）、（76.08±5.62）ng/L，说明细胞已产生炎症反应。与Pb处理组相比，添加PEP消化产物共处理对3 种促炎因子的分泌量整体上无显着影响（＞0.05）；而SePEP消化产物的添加促使IL-6、IL-8及TNF-α质量浓度整体上显着下降（＜0.05），且呈剂量依赖性，其中IL-8质量浓度在SePEP消化产物质量浓度为75 μg/nL时显着降低至（65.87±6.54）ng/L（＜0.05）。RAW264.7细胞受外物刺激分泌大量炎症因子，包括IL-6、IL-8与TNF-α等，被广泛应用于建立细胞炎症模型。IL-6与TNF-α和IL-1家族相似，具有促炎特性，在介导炎症中起重要作用，释放水平过高可致细胞死亡。IL-8是一种多细胞来源的趋化因子，可通过聚集中性粒细胞增强炎症反应，间接创造利于肿瘤生长的微环境。抑制促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α的释放可以抑制炎症相关信号通路如NF-κB、MAPK通路的激活，从而减轻炎症反应及炎症过程中的组织损伤。已有研究表明Se可显着抑制Pb暴露引起的细胞炎症，如向Pb暴露的RAW264.7细胞中添加大米富硒蛋白水解物可显着抑制促炎因子IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α及髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的释放（＜0.05）；单独以醋酸铅饲喂鸡会显着提高鸡血淋巴细胞中IL-6、IL-8和TNF-α因子mRNA表达水平，亚硒酸钠和醋酸铅联合饲喂时促炎因子表达水平受到显着抑制。本实验中SePEP消化产物对Pb诱导的RAW264.7细胞促炎因子释放有显着抑制作用，PEP消化产物对Pb诱导的促炎因子释放无明显影响。结果表明，与PEP消化产物相比，SePEP消化产物对Pb引起的RAW264.7细胞炎症反应有显着缓解作用（＜0.05）。
图6 不同质量浓度蛋白消化产物对100 μmol/L Pb2＋损伤RAW264.7细胞存活率（A）及细胞因子IL-6（B）、IL-8（C）、TNF-α（D）质量浓度的影响Fig. 6 Effects of different concentrations of protein digestion products on the viability (A) and IL-6 (B), IL-8 (C) and TNF-α (D)release of 100 μmol/L Pb2+-damaged RAW264.7 cells
3 结 论
本实验发现SePEP硒含量为（360.64±3.11）mg/kg，其硒形态主要包括SeMet（（48.04±0.64）%（相对含量，下同））、SeCys（（31.91±0.51）%）及MeSeCys（（14.65±0.36）%）。硒生物强化显着改变了蛋白的营养结构特性，与PEP相比，SePEP氨基酸含量显着增加，-螺旋结构相对含量增多，无规卷曲结构相对含量减少，总巯基与二硫键的含量增加，蛋白表面疏水性提高。此外，SePEP体外模拟消化产物可显着降低Pb对RAW264.7细胞毒性，细胞存活率可由（53.48±6.49）%升高至（76.95±6.95）%。SePEP消化产物对Pb暴露RAW264.7细胞的促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的释放具有显着抑制作用，缓解了Pb诱导的RAW264.7细胞炎症反应。综上，SePEP可作为膳食硒补充剂满足人群补硒需求，并且可作为一种改善铅毒性的新型膳食硒源。
